通过组织移植揭示鹿生茸区骨膜与鹿茸形态关系的研究

鹿生茸区骨膜是角柄和初角茸生长的组织基础,然而,控制鹿茸生长形状的信息存在于何处目前尚不清楚,本研究利用鹿生茸区骨膜移植试验来揭示这一问题。结果表明,在角柄发生前将鹿生茸区骨膜移植到鹿的前额皮下后,第1年诱发生长了角柄或单枝鹿茸,第2年再生了具有眉枝的典型二杠茸。这一结果表明,控制鹿茸形状的信息存在于鹿生茸区骨膜中,而不是所谓的鹿中枢系统的“鹿茸生长中心”中。     

一种优化的适用于双向电泳的水稻纹枯病菌蛋白质提取方法

为开展水稻纹枯病菌蛋白质组学的研究,采用TCA-丙酮法、SDS法和TCA-丙酮-酚/SDS联合抽提法对水稻纹枯病菌蛋白质提取质量进行比较,并建立了双向电泳体系。对电泳后的图谱用Quantity One软件进行分析,结果发现:TCA-丙酮法、SDS法和TCA-丙酮-酚/SDS联合抽提法所获得的蛋白质双向电泳图谱中,分别记录得到557、309和877个蛋白质点。SDS法提取的蛋白质样品杂质较多,存在盐离子和小分子物质干扰,得到的蛋白点较少;TCA-丙酮法提取的蛋白质样品呈黄色,有色素残留;而在TCA-丙酮法的基础上,增加酚/SDS抽提步骤,能够有效地去除样品中的盐离子和色素等杂质,获得背景清晰、分辨率高的蛋白图谱。结果表明,本研究建立了一种优化的TCA-丙酮-酚/SDS联合抽提法,该法适用于水稻纹枯病菌蛋白质双向电泳的提取。     

鹿茸再生关键组织角柄骨膜基因组DNA甲基化分析

为研究鹿茸再生过程中的分子调控机制,利用荧光标记的甲基化敏感扩增多态性(Fluorescence-labeled methylation sensitive amplified polymorphism,F-MSAP)方法,分别从组织和细胞水平检测致敏区角柄骨膜(Potentiated pedicle periosteum,PPP)和休眠区角柄骨膜(Dormant pedicle periosteum,DPP)的基因组DNA甲基化水平。结果表明:无论在组织还是细胞水平,PPP的DNA甲基化水平均低于DPP,并且差异显著(P0.05)。通过人工制造致敏区角柄骨膜(artificial PPP,a PPP)对试验结果进行了功能验证,证明鹿茸再生过程中,DNA甲基化是重要的分子调控机制,DNA去甲基化是激活鹿茸角柄骨膜再生能力的先决条件。     

鹿茸发生和再生的组织基础及其研究进展

通过对鹿茸生长发育机理研究的整理和总结,阐述了鹿茸发生和再生过程中的组织变化,特别是关于生茸区骨膜和角柄骨膜的研究,取得了重要的成果．生茸区骨膜切除后不能发生角柄和鹿茸,而被移植了生茸区骨膜的位置则生长角柄和鹿茸,证明了生茸区骨膜是鹿茸发生的组织基础,确定了生茸区骨膜中存在鹿茸再生干细胞,为进一步研究鹿茸的生长发育机理提供了重要的依据和参考．     

适用于双向电泳的芒果叶片蛋白提取方法的建立

为建立一套适用于鉴别"四季芒"成花蛋白表达差异的双向电泳方法,摸索出合适的芒果叶片蛋白提取方案。以"四季芒"芒果叶片为材料,采用TCA-丙酮法、酚抽提乙酸铵沉淀法、改良酚抽提乙酸铵沉淀法等3种芒果叶片蛋白提取方法,进行SDSPAGE和双向电泳,比较这些方法的提取效果。结果表明,改良酚抽提乙酸铵沉淀法比一般酚抽提法获得更高质量的蛋白。对沉淀产物洗涤和干燥步骤的优化能有效提高TCA-丙酮法蛋白提取质量。提取液p H能明显影响改良酚抽提乙酸铵沉淀法所提蛋白的得率、2-DE凝胶蛋白点数量和分布。p H 8.5提取液所提蛋白获得最多的2-DE蛋白点,但在小分子区域蛋白分辨率比p H9.0提取液所提蛋白低。TCA-丙酮法所提蛋白在大分子区域2-DE蛋白点分辨率不如改良酚抽提乙酸铵沉淀法,但小分子和高等电点区蛋白点分辨率却明显好于后者。实验表明改良酚抽提乙酸铵沉淀法和TCA-丙酮法有很强的互补性,可以在双向电泳体系中组成双提取法提高蛋白分辨率。     

杜鹃叶片3种蛋白质提取方法的比较

以映山红(R.simsii)、马银花(R.ovatum)、满山红(R.mariesii)和云锦杜鹃(R.fortunei)4种杜鹃为实验材料,采用TCA-丙酮法、酚法和TCA-丙酮-酚法3种蛋白质提取方法提取杜鹃叶片蛋白质,并应用双向电泳技术(2-DE)比较分析不同方法的蛋白质提取率、溶解性、完整性等的差异,确立适用于2-DE分析的杜鹃叶片蛋白质提取方法。结果表明,TCA-丙酮法提取的蛋白溶解性差且粘稠,得到的蛋白质点少,不适合杜鹃叶片蛋白的提取;酚法提得的蛋白质溶解性好,蛋白质点多,但是杂质较多,且此法不适用于映山红叶片蛋白的提取;TCA-丙酮-酚法提取的杜鹃叶片蛋白质位点较多且清晰,重复性也好,且4种杜鹃叶片蛋白的提取效果都比较好。因此,TCA-丙酮-酚法被认为最适于杜鹃属植物叶片蛋白质的提取及分析。     

鹿茸干细胞p21基因表达水平及其对细胞周期的影响

为初步探讨p21基因在基于鹿茸干细胞的鹿茸再生过程中所起的生物学作用,本研究利用qRT-PCR以及流式细胞术,以鹿脸部骨膜细胞(FPCs)为对照组,对鹿茸干细胞的生茸区骨膜细胞(APCs)和角柄骨膜细胞(PPCs)中p21基因mRNA表达水平和细胞周期分布进行了检测。进一步通过RNAi干扰技术,抑制APCs中p21基因表达水平,验证其对细胞周期分布的影响。结果表明,鹿茸干细胞中p21基因mRNA表达水平显著高于对照组细胞(APCs PPCs FPCs,P 0.05);相对于对照组细胞,鹿茸干细胞周期分布没有显著差异;低表达p21基因的APCs细胞周期无显著变化,说明p21基因表达水平的变化对鹿茸干细胞周期无直接影响。本研究为深入揭示该基因在鹿茸干细胞中高表达所起的生物学作用奠定了基础。     

猕猴桃中SOD提取工艺研究

[目的]寻找一条从植物中提取出较纯净S01）的廉价工艺路线。[方法]利用超氧化物歧化酶（SOD）耐热等性质,对以猕猴桃为原料制备的SOD粗酶液分别进行热变性、等电点、丙酮沉淀处理,以得到纯度较高的SOD酶液。[结果]试验确定了热变性、等电点、丙酮沉淀处理猕猴桃中的SOD粗酶液的最佳提取参数分别为65℃下25min、pH5．0、V丙酮：VSOD酶液=1：1,并且依次用3种方法下的最佳参数进行提取,得到的蛋白样品经分析达到了电泳纯。[结论]研究可为植物中SOD的廉价提取提供参考依据。     

S100A4蛋白的生物学功能研究进展

S100A4是S100蛋白家族成员之一,是一种具有EF双螺旋结构域的Ca2+结合蛋白。S100A4在多数成体组织细胞中不表达,在多种肿瘤和干细胞等增殖细胞内高度表达。相关研究表明,S100A4蛋白的表达与细胞的异常增生及肿瘤的发生、发展有关,并可促进肿瘤细胞的转移、侵入以及瘤区血管的生成。本研究组发现,S100A4在鹿生茸区骨膜(鹿茸发生的组织基础)和角柄骨膜(鹿茸再生的组织基础)的组织细胞中均大量存在。与肿瘤细胞不同的是,鹿茸干细胞并没有因为S100A4的表达而发生异常的侵入和转移,其增殖、生长直至分化为形状规则的完整鹿茸受到了严格的调控。鹿茸是哺乳动物中唯一可以周期性再生的复杂器官,其再生的机制引起了越来越多的关注,S100A4作为一种在快速增殖细胞中高度表达的多功能蛋白,为我们揭示鹿茸的发生与再生机制提供了一个新的研究方向。     

低磷胁迫下杉木针叶蛋白的提取与表达差异分析

采用TCA-丙酮沉淀高速离心法,对杉木针叶蛋白质组双向电泳技术中全细胞蛋白的提取、蛋白的裂解、电泳条件等环节进行了优化改良,获得了高重复性、高清晰度的杉木针叶响应低磷胁迫的差异蛋白图谱。在此基础上对低磷处理5 d的杉木进行针叶蛋白提取,并使用ImageMaster 2D Platinum 7.0软件分析比较杉木针叶在对照与低磷处理下的蛋白表达谱。研究表明,图谱中有59个蛋白点存在显著差异,可能与低磷胁迫有关,其中,上调表达点52个,下调表达点7个。     

鹿茸干细胞内[Na+]测定及其影响因素鉴定

为探索鹿茸的形态发生与鹿茸干细胞(包括发生干细胞和再生干细胞)内[Na~+]的关系有关,以鹿茸干细胞为模型,研究不同干性的哺乳动物干细胞内[Na~+]的差异,并鉴定引起这种差异的电压门控性钠离子通道(NaV)因素。采集并培养具有不同干性的梅花鹿鹿茸干细胞,包括生茸区骨膜细胞(AP细胞,鹿茸发生干细胞)和角柄骨膜细胞(PP细胞,鹿茸再生干细胞,其干性低于AP细胞),以鹿普通脸部骨膜细胞(FP细胞)作为对照,并采用CoroNa染色方法,通过荧光强度来分析不同类型细胞内[Na~+]的差异,结合PCR方法鉴定转录水平上NaV基因的差异,并分别用睾酮和MS-222对细胞进行处理,观测其对细胞内[Na~+]的影响。结果表明:鹿茸干细胞内[Na~+]高于FP细胞,其中AP细胞内[Na~+]高于PP细胞;NaV1.1基因在AP细胞中特异性转录;睾酮对这3种细胞内[Na~+]水平没有显著影响;但是,MS-222处理能够在一定程度上降低细胞内[Na~+]。本研究发现:鹿茸干细胞内[Na~+]与其干性一致,干性高的AP细胞内[Na~+]也相对较高;NaV1.1基因在转录水平上的差异,可能是造成AP细胞内[Na~+]高的主要原因;干扰NaV的MS-222能够在一定程度上降低细胞内[Na~+]。说明哺乳动物器官的发生和再生可能与低等动物器官上的发现类似,都与细胞内[Na~+]有关。     

两种方法从林麝粪便提取DNA效率及分析

采集林麝DNA样本获得快捷、有效的DNA提取方法是其分子标记,良种遗传选育的分子基础。以林麝粪便为研究对象,用常规和改良的方法比较提取林麝粪便DNA的效率,两种方法分别设为对照组和试验组。采集林麝粪便后分别在空气暴露0、2、4、6d。用对照组和试验组两种方法提取粪便DNA,以林麝GAPDH为目的基因,用PCR方法扩增样本。琼脂糖凝胶电泳分离DNA目的条带,以空气暴露0d的粪便DNA条带光密度值为参考,2、4、6d粪便DNA条带光密度值与0d进行比较获得相对光密度值。结果发现,随着时间延长,林麝粪便逐渐失去光泽,表面粗糙;对照组和试验组两种方法均能有效提取林麝DNA。试验组2d和4d与0d相比较DNA水平显著上升,6d与0d没有显著差异;对照组仅在2d提取的DNA水平上升,而4d和6d显著下降到0d的水平。以对照组为参照,两组各时间点相比,试验组获得的DNA水平显著高于对照组。研究结果表明,试验组提取DNA的方法可显著提高林麝粪便DNA的获得率。     

梅花鹿鹿茸软骨细胞的培养及X型胶原的克隆和序列分析

型胶原是肥大软骨细胞的标志物,据GenBank中收录的人、鼠、牛、猪型胶原基因的序列,进行同源性分析,在同源性高的相对保守区域设计了1对特异性引物。建立梅花鹿鹿茸软骨细胞的分离培养方法,培养鹿茸软骨细胞。提取细胞的总RNA,以总RNA为模板,用RT-PCR方法克隆了梅花鹿的型胶原基因序列为877的片段,此片段全部位于编码区,与已报道的牛的型胶原基因的序列比较,同源性达到96%。共有35个碱基发生变异。DNAStar软件分析表明,二者推导的氨基酸序列同源性为95.5%。     

梅花鹿Thymosin beta 10基因RNAi慢病毒载体的构建及其对鹿茸干细胞增殖的影响

利用慢病毒干扰系统,对梅花鹿生茸区骨膜干细胞(Antlerogenic periosteum cells,AP细胞)Thymosin beta 10(Tβ10)基因进行RNA干扰(RNA Interference,RNAi),并初步研究该基因对细胞增殖的影响。结果表明:试验设计的3条针对梅花鹿Tβ10基因的shRNA序列与载体质粒p LVTHM连接成功,与p SPAX2、p MD2.G质粒共转染HEK 293T细胞,获得的重组慢病毒成功感染了AP细胞;荧光定量PCR检测结果表明,RNA干扰后Tβ10基因的mRNA水平下调,MTT试验结果显示Tβ10基因的下调可以抑制AP细胞增殖。试验成功构建了针对梅花鹿Tβ10基因RNAi载体,并成功干扰了Tβ10基因在AP细胞中的表达,基因下调最高可达35.6%,并初步确定Tβ10基因下调可抑制AP细胞的增殖。     

CIDR在林麝同期发情上的应用研究

为了利用CIDR和PMSG对林麝进行同期发情试验,研究其对林麝的应用效果,寻求操作简便、效果良好、稳定的林麝同期发情方法.把CIDR放人林麝阴道内,11d后取出同时注射PMSG,观察发情情况.结果表明,取栓后7d内同步发情率达到85.7％.CIDR诱导发情在林麝上的首次应用研究,效果优于巴报道的其他林麝同期发情方法.     

不同鹿茸片红外数据的聚类分析

[目的]探讨不同鹿茸片的有效鉴别方法。[方法]采用SPSS软件对梅花鹿茸片、去血梅花鹿茸片、劣等梅花鹿茸片、假鹿茸片的红外光谱数据进行聚类分析。[结果]4种鹿茸片的红外光谱图谱存在明显差异;聚类分析表明,去血梅花鹿茸片和梅花鹿茸片为一类,成分没有明显差异。[结论]傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和社会科学统计软件包（SPSS）软件相结合为梅花鹿茸的质量鉴别提供了一个客观有效的方法。     

醇提法制备鹿茸胶原的初步研究

采用醇提法制备鹿茸胶原,BCATM蛋白浓度测定法、RE-HPLC法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测其纯度及其分子量范围,酸水解法测定其氨基酸组成。结果表明,鹿茸醇提物中主要含有Ⅰ型胶原,含量约为70%;相对鲜鹿茸,胶原提取率为10.3%。     

圈养与半散放条件下梅花鹿成年母鹿的行为节律比较

以江苏省扬州市平山堂养殖场圈养条件及扬州市动物园半散放条件东北亚种成年梅花鹿母鹿为研究对象,采用瞬间扫描取样法研究了2种饲养方式下梅花鹿昼间行为节律。结果表明:2种饲养方式下梅花鹿群体昼间取食、卧息、观望、反刍、移动、修饰等行为频次比率依次减少,其取食、卧息和观望行为比率占昼间行为的80%以上。圈养和半散放条件下成年母鹿都有2个取食行为高峰,二者的反刍行为高峰分别发生在12:30、8:00左右,卧息行为高峰分别在12:30—13:30、10:30—13:30,观望行为高峰分别在13:30—16:30、7:30—8:30。行为分析表明,不同饲养条件下,成年梅花鹿母鹿昼间行为存在显著差异,饲养环境不同是造成梅花鹿行为差异的主要原因。