毛白杨木材形成功能基因内SSR标记的开发及评价

利用直接测序法开发木材形成功能基因内一套新的核基因组SSR标记.通过对参与木材形成的16个基因在40个毛白杨基因型个体中的序列比较分析,共检测剑20个SSR多态性位点.在毛白杨自然群体中,SSR多态性位点的碱基重复呈现出二碱基、三碱基、五碱基、六碱基与七碱基形式,基元霞复次数变异范围为2～34次,其中以二碱基重复的位点较多,占总数的55.0%.在此基础上,依据SSR位点两侧的保守序列,设计20对SSR位点PCR扩增引物对.利用设计的引物检测开发的SSR位点在杨属内15个基因型个体中PCR扩增的有效性及SSR位点的保守性.PCR扩增结果显示,90.0%的SSR位点能够在杨属至少2个派内有效扩增,每对引物组合可检测到SSR多样性位点数为3～9个,平均5.3个.开发的这些SSR位点在功能基因内小同区域的分布频率不同.     

杨树基因组SSR标记在康定柳中的通用性分析

SSR分子标记因具有共显性遗传、高度多态性、重复性和稳定性好、易于实现自动化等优点,在遗传育种等方面有着广泛的应用前景。本研究在杨树基因组中随机选取622对SSR引物对来自5个不同群体的康定柳雌雄各20个个体,共计200个进行了通用性分析。结果表明：杨树基因组SSR标记在康定柳中的通用性达到7.88%。     

基于桤木属转录组测序的SSR分子标记的开发

[目的]基于转录组数据开发适用于桤木属树种的SSR标记,揭示其在转录组序列中的分布类型及特征,为桤木属树种分子标记辅助育种提供有利工具。[方法]利用Micro SAtellite(MISA)软件对所有转录组序列进行SSRs搜索,并对SSR位点的数量、分布特征进行统计分析。设计100对SSR引物,采用琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳分离检测方法对3种不同倍性桤木属植物(12份材料)进行遗传多样性检测,确定引物多态性及通用性。[结果]85 769条Unigenes序列中发现8 678个SSR位点,分布在8 298条Unigenes中发生频率为9.67%,转录组序列中平均每14.04 kb长度就有一个SSR位点分布。其中,二核苷酸重复类型数量最多,占65.87%。根据转录组Unigenes序列,利用Primer 3软件共设计出4 531对符合要求的引物,挑选出的100对SSR引物中,获得18对多态性高、稳定性好的SSR引物。[结论]本研究可扩增出多态性位点的引物重复单元以二、三核苷酸重复为主。基于桤木属转录组序列的SSR标记开发是可行的,开发的引物为桤木属遗传多样性分析、分子育种、遗传图谱构建和功能基因的挖掘提供了丰富的候选分子标记。     

利用荧光SSR标记鉴别杨树品种

世界上天然杨树约100多种,我国有50多种。杨树作为重要造林树种,多用于水土保持、防风防沙和园林绿化,也是造纸、建筑及木材工业的重要经济树种。杨树易繁殖,生长速度快,生产周期短,在我国广泛栽培,我国也是世界上杨树人工林面积最大的国家(Carleetal.,2005)。我国杨树引种和育种的历史可追溯到新中国建立时期,杨树种质资源十分丰富,我国已培育了许多优良杨树品种(马常耕,1995)。随着育种技术的发展,新品种产生的速度与日俱增。然而,由于杨树品种繁多,形态相似,容易出现品种混淆。特别是近年来杨树种苗市场的迅速发展,为了追逐经济效益,杨树种苗市场上出现了以次充好,甚至出现造假的现     

杨树EST-SSR标记的开发

利用来自美洲黑杨及欧美杨的20 023条EST序列,进行EST-SSR标记开发研究.首先对这些EST序列进行序列拼接,然后在非重复序列中发现由二核苷酸至五核苷酸组成的SSR重复序列.共在10 816个非重复序列中发现1 604个序列含有SSR,占总非重复序列的14.8%.在发现的1 918个SSR重复序列中,二核苷酸重复是最丰富的重复类型,占总类型的62.3%.设计合成48对SSR引物,利用6个不同的杨树品种对其进行验证.结果约90%的引物获得扩增产物,58%的引物在6个不同杨树品种中产生多态性分离.另外,还对重复序列的数量及重复类型进行了讨论.     

SSR标记与欧洲黑杨材性性状的关联分析

对引进的92个1年生和65个4年生欧洲黑杨无性系进行材性测定,并结合171个SSR标记进行材性数量性状位点的关联分析.结果表明:1年生和4年生欧洲黑杨的木材基本密度分别为0.308 8 g·cm-3和0.355 2 g·cm-3,纤维长分别为601.3 μm和649.4 μm,纤维宽分别为21.81 μm和23.11 μm,微纤丝角分别为26.5°和26.1°.4年生欧洲黑杨苯醇抽提物、综纤维素、α纤维素以及木质素含量分别为2.32%、78.62%、41.48%和20.93%.通过SSR标记位点与性状间的关联分析,共获得与1年生材性性状关联的SSR标记位点10个,其中基本密度3个,微纤丝角5个,纤维长2个,纤维宽4个,贡献率6.43%～23.18%;与4年生欧洲黑杨材性性状关联的SSR标记位点8个,其中基本密度、纤维长、木质素各1个,微纤丝角、综纤维素含量和α纤维素含量各2个,贡献率7.41%～28.56%.     

杜仲基因组微卫星特征及SSR标记开发

为全面解读杜仲的遗传背景,本研究在基因组测序(数据未公布)的基础上,通过MISA软件搜索杜仲基因组(26 947/854 758 160 bp)中的完整型(1～7核苷酸重复)及复合型SSR序列,共查找出25 694个Scaffolds含有488592个SSR位点,占总Scaffolds的95.3％.从SSR位点分布密度上讲,平均每1 749 bp出现1个微卫星,其中单核苷酸重复单元的SSR含量最多,约占总数的54.34％,其次为二核苷酸(20.47％),而复合模式、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和七核苷酸重复分别占20.29％、23.89％、0.77％、0.13％、0.10％和0.01％,并发现SSR中均以含A、T的重复类型占主导地位.根据SSR位点设计并合成引物290对,162对SSR引物扩增出清晰的目的条带,其中16对引物多态性高、稳定性好,在8份杜仲资源中共检测到84个等位基因,平均每个SSR位点检测到5.25个等位基因.本研究对于进一步利用SSR分子标记分析杜仲遗传多样性、遗传图谱构建、杜仲雌雄株早期鉴定等具有较高的应用价值.     

基于SSR分子标记的枸杞遗传多样性研究

【目的】使用黑果枸杞的转录组数据开发适合枸杞的EST-SSR引物,用于分析评价枸杞品种和种质的遗传多样性,为黑果枸杞种质资源评价和新品种培育提供理论依据。【方法】基于NCBI公共数据库已经发表的黑果枸杞果实转录组数据,分析得到枸杞的EST-SSR分子标记,合成了符合设计标准的182对EST-SSR引物,经过扩增和多态性筛选后,将多态性好的引物用于30份枸杞材料的遗传多样性分析。【结果】在182对引物中,有176对引物可以扩增出条带,共筛选出20对多态性好、有特异性的引物,其多数引物扩增条带数为2～8条。使用20对引物在30份枸杞材料中共扩增得到121条条带,平均每对引物扩增出6.05条,有效等位基因数(N_e)的均值为1.473 1个,Nei’s多样性指数(H)的均值为0.291 7,Shannon信息指数(I)的均值为0.451 7,多态性信息含量(PIC)均值为0.667,30份材料的遗传相似系数为0.459 2～0.991 8,表明品种间具有较丰富的遗传差异。聚类分析结果表明,30份枸杞材料被分为6个组,黑果枸杞与红果枸杞明显归于不同类型,不同种源地的黑果枸杞...     

暗褐网柄牛肝菌高多态性SSR标记的开发

从暗褐网柄牛肝菌基因组数据中开发高多态性的SSR标记,按照本实验中设计的方法得到43对引物,扩增分型后,30个位点在供试的157个样品中均表现出较高的多态性,其中:三碱基单元的位点22个,四碱基单元的位点4个,五碱基单元的位点1个,六碱基单元的位点3个.PCR产物的长度为114～561 bp.从聚类结果来看,157个样...     

刚毛柽柳Thb HLH1转录因子识别的顺式作用元件的鉴定

[目的]本研究拟对Thb HLH1所识别的顺式作用元件进行鉴定,进一步揭示Thb HLH1调控抗逆基因表达的机理。[方法]利用以转录因子为中心的酵母单杂交系统鉴定Thb HLH1所识别的顺式作用元件;将元件与报告基因融合构建报告载体(p CAM-Cis),通过基因枪法将报告载体与效应载体35S∶Thb HLH1共转化烟草叶片,在盐、干旱胁迫下比较GUS酶活。[结果]鉴定出2段能够与Thb HLH1转录因子结合的DNA序列:分别为CCGAAA(LTRE1)和TGAC(WRKY710S)。[结论]在盐或干旱胁迫下,Thb HLH1通过与LTRE1或WRKY710S元件作用来激活基因表达。     

光皮桦BlSPL1转录因子基因的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

Squamosa promoter binding protein like genes(SPLs)对植物开花具有重要的调控作用.基于转录组序列并利用RACE技术从光皮桦中分离获得BlSPL1基因,其cDNA序列全长1 825 bp,包含开放阅读框长1 170 bp,编码389个氨基酸,与桃PpSPL1(EMJ10405)的同源性最高(67％),属于陆地植物SPLs基因家族的group VⅧ分支.表达分析显示BlSPL1在光皮桦芽、雌花、雄花、幼苗中均有表达,在雄花和幼苗中表达量较低,但在芽发育成雌花过程中明显上调,推测其可能对早期的雌花形成起调控作用.同时,从57个不同的光皮桦无性系中克隆BlSPL1的基因组序列,进行单核苷酸多态性(SNP)分析,共检测到98个SNP位点,SNP频率为1/26 bp,多样性指数π为0.007 12.在外显子区域,共检测到28个SNP位点,其中11个为同义突变,17个为错义突变.进一步的连锁不平衡分析显示,随着序列长度的增加,不同光皮桦群体BlSPL1内的SNPs连锁不平衡在基因内部迅速衰退.     

杨树热激转录因子HsfA1d的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

利用RT-PCR方法,首次由小叶杨受热激胁迫后构建的cDNA文库中扩增获得一热激转录因子HsfA1d cDNA克隆,测序结果表明克隆的PsHsfA1d cDNA片段总长为2036bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为1449bp,可编码长度为482个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列在HSF DBD结构功能域与拟南芥AtHsfA1d和水稻OsHsfA1蛋白的相似性分别为86.3%和87.4%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PsHsfA1d主要在杨树叶片和根部组织中高丰度表达。非生物胁迫、激素及糖诱导表达表明,PsHsfA1d不仅受高温、干旱与盐诱导表达,还受到激素中GA_3与ABA,及葡萄糖与蔗糖信号的上调表达。组合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.7软件对小叶杨36株基因型个体的PsHsfA1d序列进行比对和分析,共检测到207个单核苷酸多态性(SNP)位点,SNP频率为1/16bp,多样性指数π为0.00772。在编码区域,共检测到69个SNP位点,其中37个为同义突变,31个为错义突变,1个为无义突变;非同义突变与同义突变的比率0.132<1,推测在小叶杨物种演化过程...     

麻竹转录因子DlSCL6的基因克隆及在拟南芥中异位表达

GRAS家族 HAM( Hairy Meristem)亚家族是一类转录因子,对植物的生长发育和形态建成具有重要作用。利用RT-PCR和RACE技术从麻竹中得到一个HAM 同源基因,命名为DlSCL6。该基因全长2006 bp,含有5'非编码区129 bp,3'非编码区266 bp,编码区1611 bp。DlSCL6蛋白具有 LHRⅠ,VHIID,LHRⅡ,PFYRE,SAM 5个保守域,且与某些单子叶植物的 SCL6蛋白有较高的一致性,与拟南芥有部分一致性,为43%。DlSCL6基因在大肠杆菌中表达,获得分子量约为60 kDa的重组蛋白。在拟南芥中正义表达 DlSCL6基因的植株营养期延长,开花延迟,植株粗壮,莲座叶数量增加;而转反义基因的植株开花提前,植株瘦弱,且莲座叶数量明显减少。由此表明,DlSCL6基因能影响转基因植株茎端分生组织的分生状态,从而导致形态建成的变化。     

基于高通量转录组测序筛选马尾松抗松材线虫病相关基因

目的 研究马尾松抗松材线虫病相关基因,为解析马尾松抗性机理和高抗马尾松早期选择提供理论依据。 方法 对高抗和易感2种马尾松基因型接种松材线虫,在接种后第1、15和30天取样进行转录组高通量测序,通过对高抗和易感马尾松差异基因识别以及富集分析,以筛选与抗松材线虫病相关的组成型差异基因。 结果 对高抗和易感马尾松接种松材线虫后的转录组进行比较,在接种后第1、15和30天分别获得2 866、679和1 657个差异基因,且在接种松材线虫后不同时间点间,共有差异基因相对较少。对差异基因进行GO富集分析,结果显示：在接种后第1、15和30天,最显著的生物学进程是氧化-还原过程,而GO项刺激反应、转录调节以及香叶基二磷酸代谢过程也显著富集。对这几类GO项相关基因进一步分析,发现接种后3个时间点GO项刺激反应中共包括26个R基因,除了2个R基因外,其它R基因表达皆为组成型,在接种松材线虫和对照间差异不显著,而GO项转录调节中仅2个差异基因被nr注释为 ERF 转录因子,其余为未知基因。接种松材线虫后, ERF 转录因子在高抗马尾松上的表达量始终高于易感马尾松上的表达量,且在接种松材线虫和对照间表达量变化不显著,也为组成型基因表达。GO项香叶基二磷酸代谢过程中, GGPPS 3个基因也在高抗马尾松上具有更高表达量,为组成型基因表达。这些基因中 TIR-NBS-LRR 基因（c65785.graph_c0）、 ERF 转录因子（c78073.graph_c0）和3个 GGPPS 基因在高抗马尾松中表达量较高,而在易感马尾松中表达量较低,甚至为0,可作为开发分子标记的候选基因用于鉴定抗性马尾松。 结论 高抗和易感马尾松在接种松材线虫后第1天其表达量差异达到显著水平的基因最多,其中, LRR 基因、 ERF 转录因子和 GGPPS 与马尾松的抗性相关,部分 TIR-NBS-LRR 基因、 ERF 转录因子和 GGPPS 有望被开发为鉴定高抗马尾松的分子标记。     

毛竹TIP基因成员鉴定及其响应胁迫的表达分析

液泡膜内在水通道蛋白（TIPs）在调节植物细胞膨压适应逆境胁迫环境过程中发挥着重要作用。研究毛竹TIP基因成员的分子特征及其在不同逆境胁迫条件下的表达模式,对揭示其在毛竹应答胁迫中的功能具有重要意义。利用生物信息学方法在毛竹基因组中共鉴定19个编码完整TIP蛋白的基因（PeTIP1-1~PeTIP1-3、PeTIP2-1~PeTIP2-4、PeTIP3-1~PeTIP3-2、PeTIP4-1~PeTIP4-7和PeTIP5-1~PeTIP5-3）;PeTIPs编码氨基酸的长度为238~434 aa,相对分子量为25.06~44.03 kDa;亚细胞位置预测显示,所有PeTIPs均定位于液泡膜上。PeTIPs包含7个保守基序,其中有4个为共有基序,不同成员的Ar/R选择性过滤器具有一定的差异,而Froger's残基均较为保守。系统进化分析显示,来自毛竹、水稻等6个物种的71条TIP氨基酸序列可分为5个分支,各分支中PeTIPs成员依次为3、4、2、7和3个。共线性分析结果表明,PeTIPs成员间共存在10对片段重复,在12个PeTIPs与水稻8个TIP基因间发现18对片段重复,这些重复基因多半发生在PeTIP4s和PeTIP5s中,且基因对的非同义对同义取代比（Ka/Ks）均小于1.0,表明PeTIPs经复制后的功能差异不大。在PeTIPs启动子区域中,发现多种与胁迫、激素响应相关的调控元件。基于叶片RNA-seq数据分析表明,不同PeTIPs响应低温、干旱和强光胁迫的表达模式均存在一定差异,既有显著性变化的成员（如PeTIP1-1和PeTIP1-2）,也有几乎无变化的成员（如PeTIP5的成员）。qPCR结果显示,在不同胁迫条件下毛竹叶片和根中的PeTIPs的表达模式不同,多数呈现不同程度的显著上调,亦有在某一处理下基因表达变化不明显（如强光下叶片中的PeTIP1-1、PeTIP1-3和PeTIP4-2;干旱下根中的PeTIP1-1和PeTIP1-2）,个别基因呈现下调（如低温下叶片中的PeTIP1-1）。毛竹叶片和根中PeTIPs的表达变化模式差异,说明它们在响应不同环境胁迫中可能发挥着不同的作用。