双重RT-PGR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIV M基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法.检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345 bp)和PRRSv(520 bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV 2种病毒混合液的最小检出量分别为102 EID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL.应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒.证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测.     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒双重RT-PCR检测方法的建立

为建立一种猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速、鉴别诊断方法,根据GenBank中已发表的2种病毒的基因组序列,选择病毒的保守基因各设计了一对特异性检测引物,建立了可以同时鉴别检测猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的双重RT-PCR方法.该方法能从猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒分别扩增出310 bp和161 bp的特异性片段,对2种病毒混合基因组同时扩增出310 bp和161 bp的特异性片段;该方法对猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;该方法最低可以检出0.2 pg病毒RNA含量.本研究建立的RT-PCR方法具有良好的敏感性、特异性、重复性,在一个PCR反应体系中就可以准确、快速鉴别检测出猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒,可以用于临床病料的快速检测.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪流感病毒二重RT-PCR 检测方法的建立

为建立可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）与猪流感病毒（SIV）二重RT-PCR 方法,研究根据GenBank 登录的相关病毒基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上2 种病毒的RT-PCR 诊断方法,扩增的目的片段长度分别为364 bp（PRRSV）和981 bp（SIV）。通过实验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性,对PRRSV 和SIV 的核酸检测最低浓度分别为 3.2×10-3 ng 和2.7×10-3 ng。应用该方法对32 、份临床样品进行检测发现PRRSV 阳性率为43.8%,SIV 阳性率为31.3%,二重感染率为9.4%。该方法的成功建立为快速高效地检测以上2 种病毒提供了有力手段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒并且能够区分普通毒株和高致病性毒株的荧光PCR方法,根据GenBank已经公布的国内发表的高致病性PRRSV NSP2基因序列,针对Nsp2缺失区设计一对引物和探针,在结合PRRSV通用检测引物探针进行荧光定量PCR,对反应条件进行优化,用已知PRRSV普通株和高致病性株及其他病毒进行试验.结果表明,该方法可以特异检测并区分高致病性株和普通株.将该方法用于临床标本的检测,通过对32份样本检测,通用阳性为28份,阳性率为87.5％.高致病性株为17份,阳性率为59.38％.表明建立的方法可以用于PRRSV的快速检测,并且可以区分普通株和高致病性株.     

不同引物RT-PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的比较研究

用3对分别针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF7、ORF5和ORF5的PCR引物N1/N2、AdGP5.1/AdGP5.2和RFLP5.1/RFLP5.2进行RT-PCR,检测PRRSV,从其敏感性、特异性和临床样品检出率等方面进行比较,在此基础上进一步建立一步法RT-PCR检测方法。结果显示:3对引物对PRRSV均有很高的特异性;应用N1/N2引物病毒最低检测量为7.9 TC ID50,而AdGP5.1/AdGP5.2引物和RFLP5.1/RFLP5.2引物PCR最低检测量为79 TC ID50;运用N1/N2、AdGP5.1/AdGP5.2和RFLP5.1/RFLP5.2引物分别进行RT-PCR扩增检测临床样品,PRRSV检出率分别为28/48、27/48和25/48,且用AdGP5.1/AdGP5.2和RFLP5.1/RFLP5.2引物检测的阳性样品,用N1/N2引物检测也都呈阳性。运用N1/N2引物,通过一步法RT-PCR成功地从PRRSV S1株中扩增出374 bp的目的基因片段。结果表明,用N1/N2引物扩增PRRSV目的基因,其敏感性和临床样品检出率更高,更适合临床样品PRRSV的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5'端非编码区基因序列,设计合成了1对特异性引物,参考本实验室针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白设计的引物,经过PCR反应条件的优化,建立了BVDV和PRRSV双重RT-PCR的检测方法。对于PRRSV和BVDV的cDNA最低检测量分别为3.8×10-4 ng和7×10-4 ng,对于猪瘟病毒(CFSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的PCR扩增结果均为阴性;用该方法对江苏省不同地区采集的75份仔猪的肺脏、脾脏和淋巴结等病料进行了检测,结果PRRSV有55份阳性,BVDV有14份阳性,PRRSV和BVDV混合感染的有12份,与PRRSV和BVDV单一RT-PCR的检测结果符合率分别为89.3%和92%。证明建立的双重RT-PCR检测方法可用于临床样品中BVDV和PRRSV的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究根据PRRSV GL膜蛋白基因和CSFV多聚蛋白基因,分别设计2对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果表明,该方法只对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒特异性良好,不与非洲猪瘟、猪圆环病毒Ⅱ型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒等常发猪病存在交叉反应;PRRSV和CSFV的检出下限分别为1.41拷贝/μL和1.6拷贝/μL;组内和组间Ct值变异系数都小于1.3%。对175份临床采集的样品检测,PRRSV单一阳性样品27份,CSFV单一阳性样品16份,检测双阳性样品24份。本方法敏感高、特异强,可以用于猪场的快速检测与诊断。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪瘟病毒(CSV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)现场快速鉴别检测方法,参照GenBank中CSV和PRRSV特异性基因序列,设计特异引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测CSV和PRRSV的一步法荧光RT-PCR方法,并验证了该方法的特异性、敏感性、重复性。结果显示,该方法检测CSV和PRRSV的灵敏度分别可达0.25和1.99 TCID_(50)/100μL,对猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性。本试验建立的TaqMan一步法荧光定量RT-PCR检测方法,可对CSV和PRRSV进行快速诊断,适合现场检测。     

斑点杂交法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒

斑点杂交技术是一种快速、稳定、高通量的检测方法,在动物疫病的诊断和流行病学调查中发挥着重要作用。在本研究中,通过RT-PCR扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SD1株ORF7基因,并以其为模板,制备地高辛标记cDNA探针,并进行了特异性和敏感性检测。利用该探针对50份临床病料进行PRRSV检测,并与RT-PCR进行了比较,结果显示,斑点杂交结果与RT-PCR结果完全一致,探针敏感性和特异性亦较高,说明本研究建立的斑点杂交方法可用于PRRSV临床检测与免疫监测。     

实时荧光定量PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒

根据GenBank发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保守区域的序列分别设计了2对特异性引物。建立了一种快速检测CSFV和PRRSV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用该方法检测采集的临床疑似病料。结果表明,建立的CSFV、PRRSV-SYBR GreenⅠPCR有较好的特异性,敏感性和重复性,可以用于CSFV和PRRSV的检测。     

不同亚型猪流感病毒双重RT-PCR快速检测

参照已发表的文章合成4对引物,分别能特异扩增出H1、H3、N1和N2片段,应用同时鉴别3个血清亚型H1N1、H1N2和H3N2的双重RT-PCR快速鉴别诊断猪流感的方法。从临床病料中检测出阳性后进行病毒分离鉴定,符合率为100%,表明该方法具有很高的使用价值。     

多重PCR检测猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒

应用Primer3.0和Omega2.0,根据猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪流感病毒(SIV)保守基因设计了3对多重PCR引物,建立PRRSV,SIV和PRV单项PCR检测方法,并在优化单项PCR反应条件(引物浓度、Mg2 浓度、退火温度等)基础上,初步建立了PRRSV-PRV-SIV多重PCR检测方法,并分别用多重PCR和单项PCR/RT-PCR检测10份临床病料,两者符合率为96.6%,表明该多重PCR检测方法有较高的敏感度,可以用于临床病料的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征和猪流感复合RT-PCR方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）美洲型标准株（ATCC VR-2332）的部分ORF7保守序列、猪流感（SIV）A/Swine/HeNan/703/2001(H₃N₂)株的NP基因保守序列,设计合成了2对特异引物,分别扩增出大小为300和457 bp的特异性基因片段,通过优化RT PCR条件,最终建立了可同时检测PRRSV和SIV的复合RT-PCR诊断方法,该方法能检出约10 pg总RNA病毒。应用该方法分别对河南省不同地区送检的26头份病死猪的鼻腔分泌物、气管、血液、肺组织等进行检测,结果9头份PRRSV阳性,4头份SIV阳性,其中4头份SIV和PRRSV同时为阳性,其余猪为阴性,健康猪对照样品全部阴性。结果表明,PRRSV和SIV复合RT-PCR诊断方法具有高度特异性和敏感性,为在分子水平上对PRRSV、SIV的混合感染进行早期快速诊断提供了科学依据。     

用PCR方法检测公猪精液中的猪繁殖和呼吸综合征病毒

1　概述PRRS病毒是一种有囊膜的单链 RNA病毒 ,其基因组包括 7个亚基因 :其中的 ORFs1 a和1 b编码 RNA聚合酶 ,ORFs2— 6编码病毒膜蛋白 ,ORF7编码核依壳蛋白。直接接触感染猪是PRRS病毒传播的主要途径 ,因为已在唾液、尿、粪便和精液中分离出该病毒。流行病学研究结果表明 PRRS病毒可通过空气传播 ,并已证实PRRS病毒可通过感染公猪的精液传播 ,因此 ,随着人工授精技术的普及 ,通过精液传播 PRRS病毒的可能性大大增加 ,带有 PRRS病毒的精液可能被输送到多个猪场而大量传播。因为精液样品具有细胞毒性 ,因而用传统方法如病毒…     

猪繁殖与呼吸综合征病毒与非典型瘟病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立同时快速简便地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与非典型瘟病毒(APPV)两种病毒的方法,本研究根据GenBank中登录的PRRSV、APPV的基因序列,选取PRRSV的ORF2基因和APPV的NS2基因分别设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了能够同时检测PRRSV与APPV的双重RT-PCR方法。利用该方法对PRRSV、APPV重组质粒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒的cDNA和阴性对照进行检测,结果显示除PRRSV和APPV重组质粒扩增结果为阳性外,其余均为阴性,表明其特异性良好;该方法对APPV和PRRSV质粒标准品的最低检出量分别为2.17×10~4拷贝/μL、3.13×10~3拷贝/μL,敏感性较高;同时批间和批内重复性试验表明该方法重复性好。利用该方法对四川地区临床73份疑似仔猪颤抖病与猪繁殖与呼吸综合征病的病料样品进行检测,结果与单一RT-PCR的检测符合率为100%。本研究建立的双重RT-PCR方法具有良好的实用性,可用于临床样品的检测,对临床早期诊断具有重要意义。     

TaqMan荧光定量RT-PCR检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒

根据GenBank登录的高致病性PRRSV Nsp2基因序列利用Primer Express 3.0软件设计合成了引物和探针;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqMan 荧光定量RT-PCR检测方法.同时用建立的检测方法对以定量的10倍系列稀释质粒pMD- Nsp2为标准品进行了检测,并与常规RT-PCR做了对比.结果显示,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达3.15 拷贝,比常规RT-PCR灵敏度高100倍.用该方法对3份不同的标准品进行了重复检测,结果表明,该方法具有良好的重复性,可满足当前高致病性PRRSV的诊断需要.     

RT-PCR检测临床组织病料中的猪繁殖与呼吸综合征病毒

参考GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VL2332株的Lv基因序列,设计合成了一对引物,建立了检测PRRSV的RT-PCR方法。对2006年6-12月江苏省和福建省的5个大中型猪场送检的5份临床组织病料进行了检测,结果PRRSV均呈阳性。表明所建立的RT-PCR方法可用于临床组织病料中PRRSV的快速检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流行性腹泻病毒双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立快速、简便且能同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的方法,试验根据GenBank中已登录的PRRSV ORF7基因序列和PEDV N基因序列,设计2对特异性引物和2条TaqMan探针,通过优化扩增条件建立检测PRRSV和PEDV的双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,同时还进行了特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品检测。结果表明:最终确立的20μL扩增体系中各引物和探针的加样量分别为:PRRSV-F 0.8μL,PRRSV-R 0.6μL,PRRSV-P 0.5μL;PEDV-F 1.2μL,PEDV-R 1.0μL,PEDV-P 0.7μL。(优化后的最佳扩增程序为:50℃反转录6 min;95℃预变性1 min;95℃变性10 s,55℃退火10 s,72℃延伸10 s,共40个循环)。检测PRRSV和PEDV的敏感性可分别达到1.05 TCID_(50)/100μL和3.16 TCID_(50)/100μL,该方法特异性好,不与其他常见猪病病原体发生交叉反应,批内变异系数和批间变异系数均不高于2.0%。用该方法对234份临床样品进行检测,PRRSV阳性样品15份, PEDV阳性样品20份,检出率高于常规RT-PCR方法。说明试验建立的双重TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法敏感性高,特异性好,可同时准确、快速检测PRRSV和PEDV。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株的核苷酸序列与古典美洲株的核苷酸序列,设计一对高致病性PRRSV特异性引物,结合快速的RNA抽提试剂和一步法RT-PCR,建立高致病性PRRSV快速RT-PCR检测体系。通过测序和同类试剂盒检测效果比对,证实该体系检测结果准确,体系特异性和灵敏度试验结果显示,该体系对猪瘟病毒、普通PRRSV、禽流感病毒无扩增产物,至少能检测经10万倍稀释后的临床阳性样品。该方法可直接对可疑组织样品进行检测,操作简单、快速、价廉、受环境因素污染概率小,适合临床样品的检测。