长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2互作蛋白的筛选与验证

【目的】筛选长足大竹象(Cyrtotrachelus buqueti)信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白,为实现利用信息物质对长足大竹象种群持续控制提供参考。【方法】利用GST pull-down联合质谱技术,对长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白进行筛选、鉴定和分析,并采用酵母双杂交试验验证了CbuqPBP2与信息素结合蛋白CbuqPBP1的特异性互作。【结果】GST pull-down共筛选出45个与长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2特异性结合的候选互作蛋白,包括CbuqPBP1、ND2、CYTB。这些互作蛋白主要参与细胞过程、定位、代谢过程、应激反应以及生物调控等多个生物学过程。使用酵母双杂交体系,构建了pGADT7-PBP1 重组猎物质粒与pGBKT7-PBP2 重组诱饵质粒,通过诱饵质粒毒性检测和自激活检测,表明重组诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无毒性作用。共转化验证结果显示,诱饵质粒pGBKT7-PBP2共转化酵母菌株能够在TDO 培养基上生长。【结论】CbuqPBP2和CbuqPBP1之间有相互作用,不同信息素结合蛋白间的互作对深入理解长足大竹象嗅觉感受机制提供了新的思路。     

应用GST pull-down技术筛选番茄SIVQ6互作蛋白

【目的】含有VQ基序(VQ)的蛋白质是植物特异性蛋白质,具有保守的"FxxhVQxhTG"氨基酸序列,调节植物生长和发育。番茄SlMPK1在高温胁迫过程中发挥重要作用,酵母双杂交(Y2H)显示SlVQ6蛋白能够与SlMPK1相互作用,通过GST pull-down技术进一步验证SlMPK1与SlVQ6的互作以及SlVQ6的互作网络,为研究SlVQ6介导的高温应答信号通路奠定基础。【方法】通过pGEX-4T-1-PC-VQ6质粒构建,以含有目的基因SIVQ6的菌液为模板,设计特异性引物,扩增目的基因序列,将获得的目的基因VQ6克隆到载体pGEX-4T-1的Bam HⅠ和NotⅠ的酶切位点之间,将获得的重组质粒pGEX-4T-1-PC-VQ6转入TOP10克隆菌株经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达,通过GST柱亲和纯化获得目标蛋白PC-VQ6,进而获得预期GST-SlVQ6融合蛋白,通过体外磷酸化进一步确定SlVQ6是否是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6为诱饵蛋白固定于GST Sepharose Beads上,与番茄叶片总蛋白孵育后洗脱,收集洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳验证,通过LC-MS/MS检测SlVQ6可能互作的候选蛋白,并对筛选的SIVQ6互作蛋白通过GO、KEGG和蛋白互作网络进行生物信息学分析。【结果】成功构建pGEX-4T-1-PC-SlVQ6基因重组表达质粒,并获得带有GST标签的GST-SlVQ6融合蛋白,其分子量大小约为54 kD;将GST-SlVQ6和His-SlMPK1进行体外磷酸化试验,SlMPK1能够磷酸化SlVQ6,而作为阴性对照的GST与SlMPK1无相互作用,且SlVQ6不存在自磷酸化的现象,表明GST-SlVQ6和His-SlMPK1具有相互作用,且SlVQ6是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6融合蛋白为诱饵蛋白(空GST为阴性对照),利用pull-down试验筛选番茄叶片组织蛋白中与SlVQ6蛋白结合的蛋白,经SDS-PAGE分离、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定以及Mascot与蛋白数据库检索,共鉴定出37个与SlVQ6结合的蛋白,包括蛋白激酶Receptor for Activated C Kinase 1B(RACK1B),通过GO、KEGG和蛋白互作网络的生物信息学分析,表明这些蛋白参与多种信号通路,其中8个核糖体蛋白可能与高温胁迫密切相关。【结论】SlVQ6是SlMPK1的底物蛋白,且37个蛋白可能与SlVQ6互作,这些蛋白与胁迫反应有着密切的联系,可能会在提高番茄植株高温耐受性等方面发挥重要作用。     

应用GST pull-down技术筛选番茄SIVQ6互作蛋白

【目的】含有VQ基序（VQ）的蛋白质是植物特异性蛋白质,具有保守的“FxxhVQxhTG”氨基酸序列,调节植物生长和发育。番茄SlMPK1在高温胁迫过程中发挥重要作用,酵母双杂交（Y2H）显示SlVQ6蛋白能够与SlMPK1相互作用,通过GST pull-down技术进一步验证SlMPK1与SlVQ6的互作以及SlVQ6的互作网络,为研究SlVQ6介导的高温应答信号通路奠定基础。【方法】通过pGEX-4T-1-PC-VQ6质粒构建,以含有目的基因SIVQ6的菌液为模板,设计特异性引物,扩增目的基因序列,将获得的目的基因VQ6克隆到载体pGEX-4T-1的BamHⅠ和NotⅠ的酶切位点之间,将获得的重组质粒pGEX-4T-1-PC-VQ6转入TOP10克隆菌株经IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导表达,通过GST柱亲和纯化获得目标蛋白PC-VQ6,进而获得预期GST-SlVQ6融合蛋白,通过体外磷酸化进一步确定SlVQ6是否是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6为诱饵蛋白固定于GST Sepharose Beads上,与番茄叶片总蛋白孵育后洗脱,收集洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳验证,通过LC-MS/MS检测SlVQ6可能互作的候选蛋白,并对筛选的SIVQ6互作蛋白通过GO、KEGG和蛋白互作网络进行生物信息学分析。【结果】成功构建pGEX-4T-1-PC-SlVQ6基因重组表达质粒,并获得带有GST标签的GST-SlVQ6融合蛋白,其分子量大小约为54 kD;将GST-SlVQ6和His-SlMPK1进行体外磷酸化试验,SlMPK1能够磷酸化SlVQ6,而作为阴性对照的GST与SlMPK1无相互作用,且SlVQ6不存在自磷酸化的现象,表明GST-SlVQ6和His-SlMPK1具有相互作用,且SlVQ6是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6融合蛋白为诱饵蛋白（空GST为阴性对照）,利用pull-down试验筛选番茄叶片组织蛋白中与SlVQ6蛋白结合的蛋白,经SDS-PAGE分离、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定以及Mascot与蛋白数据库检索,共鉴定出37个与SlVQ6结合的蛋白,包括蛋白激酶Receptor for Activated C Kinase 1B（RACK1B）,通过GO、KEGG和蛋白互作网络的生物信息学分析,表明这些蛋白参与多种信号通路,其中8个核糖体蛋白可能与高温胁迫密切相关。【结论】SlVQ6是SlMPK1的底物蛋白,且37个蛋白可能与SlVQ6互作,这些蛋白与胁迫反应有着密切的联系,可能会在提高番茄植株高温耐受性等方面发挥重要作用。     

广藿香醇合酶 PcPTS 互作蛋白的筛选与鉴定分析

【目的】广藿香〔Pogostemon cablin（Blanco）Benth.〕是临床常用的芳香化湿药,其质量指标成分广藿香醇具有良好的抗病毒、抗炎症等活性。广藿香醇合酶（Patchouli alcohol synthase,PcPTS）在广藿香醇生物合成途径中起关键作用,但其在蛋白互作层面调控广藿香醇合成的机制尚不清楚。旨在筛选 PcPTS 的互作蛋白,以揭示 PcPTS 在广藿香醇生物合成途径中的调控机制和功能。【方法】利用酵母双杂交技术和 GST pull-down 联合液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）技术筛选可能与 PcPTS 互作的蛋白,利用 MASCOT 软件和 BLAST 分析注释互作蛋白,选取有文献报道参与其他蛋白互作、影响蛋白转运、修饰或降解、参与次生代谢调控的蛋白,利用酵母双杂交技术初步验证它们与 PcPTS 蛋白的互作关系并对互作蛋白进行生物信息学分析。【结果】通过 PCR 技术成功克隆了 PcPTS 的 cDNA 序列,开放阅读框（ORF）为 1 659 bp,编码 522 个氨基酸。构建了广藿香 cDNA 初级文库和酵母杂交文库,初级和次级文库容量分别为 7.6×106 CFU 和 8.6×106 CFU,初级和次级文库的重组率均为 100%,且插入片段平均长度均大于 800 bp。构建的诱饵载体 pGBKT7-PcPTS 对酵母菌株不产生毒性,且无自激活活性。利用酵母双杂交筛选得到阳性克隆并进行测序和 BLAST 分析,获得 17 个候选蛋白。成功构建了 GST-PcPTS 表达载体,诱导表达纯化获得 GST-PcPTS 诱饵蛋白,利用诱饵蛋白从广藿香总蛋白中捕获互作蛋白,共鉴定出 98 个候选互作蛋白。从候选蛋白中筛选 14 个可能与 PcPTS 互作的蛋白,利用酵母双杂交进行点对点验证,结果发现PcC3H6、PcENO3、PcACR11 和 PcHAD 与 PcPTS 存在相互作用。生物信息分析表明,四者分别属于 CCCH 锌指蛋白家族、烯醇化酶蛋白、ACR 亚家族和 HAD-like 超家族。【结论】初步筛选验证获得与 PcPTS 存在相互作用的 4个蛋白 PcC3H6、PcENO3、PcACR11 和 PcHAD,有助于揭示 PcPTS 在广藿香醇生物合成途径中的作用机制,也为进一步研究广藿香醇的合成调控机制奠定了坚实基础。     

水稻bip130与OSA7蛋白互作的验证及bip130对质膜H+-ATPase活性的影响

[目的]本文旨在验证水稻中bip130(油菜素内酯受体蛋白BR11互作蛋白130)与OSA7(质膜H+-ATP酶7)的相互作用以及ABA处理下bip130对水稻根部质膜H+-ATPase活性的影响.[方法]采用酵母双杂交技术(Y2H)、萤火虫荧光素酶互补成像系统(LCI)、GST pull-down、双分子荧光互补技术...     

小麦Hsp70基因家族鉴定及蛋白互作网络分析

为研究小麦Hsp70蛋白的相互作用,利用生物信息学方法,在全基因组范围内对小麦Hsp70基因家族进行鉴定,并进行蛋白互作及可视化分析。结果表明,在全基因组范围内共鉴定到21个结构域高度保守的Hsp70基因家族成员,亚细胞定位显示主要分布于细胞质,蛋白的二级结构中,α-螺旋与无规卷曲类型在每个蛋白中所占比重较大,二者之和大于70%,延伸链和β-转角所占比重较小,二者之和小于30%。互作分析结果表明,TaHsp70-14、TaHsp70-6、TaHsp70-12、TaHsp70-16、TaHsp70-3,TaHsp70-8、TaHsp70-21、TaHsp70-20,TaHsp70-17和TaHsp70-11之间有相互作用,GO分析显示所鉴定基因主要在分子功能、生物过程及细胞成分方面起作用。     

稻瘟病菌MoYpt7互作蛋白的初步筛选

利用酵母双杂交系统,以稻瘟病菌MoYpt7激活型为诱饵蛋白,从稻瘟病菌不同生长发育阶段的cDNA文库中筛选互作蛋白,经复筛得到10个候选互作蛋白基因,利用Bi FC或pull-down assay验证蛋白间的互作,为寻找MoYpt7下游调控侵染致病过程的效应因子提供依据.     

GST-pull down技术筛选毛白杨天冬氨酸蛋白酶PtoAED3互作蛋白

[目的]天冬氨酸蛋白酶属于蛋白水解酶家族,为了解析毛白杨天冬氨酸蛋白酶PtoAED3在植物生长发育中的分子调节机制,利用GST-pull down联合质谱技术,对PtoAED3的互作蛋白进行鉴定和分析.[方法]通过同源克隆获得了毛白杨PtoAED3的CDS序列,构建含GST标签的原核表达载体pGEX-4T-PtoAED...     

酵母双杂交筛选与小鼠维生素D受体互作的蛋白

通过酵母双杂交实验技术筛选小鼠VDR相互作用的蛋白质,评价不同蛋白与VDR的结合活性,以期获得基于互作影响雄性生殖能力基因。扩增小鼠VDR完整CDS序列,克隆至诱铒表达载体pGBKT7,经菌落PCR、DNA测序鉴定,获得重组载体pGBKT7-VDR。随后将重组载体转化至酿酒酵母AH109,并进行毒性和自激活检测;然后与含小鼠cDNA文库的Y187酵母杂交,获得阳性克隆,经HindⅢ酶切,测序分析VDR互作候选蛋白的核酸序列,再检测β-半乳糖苷酶活性,评价候选蛋白与VDR作用力的强弱。结果表明,从小鼠cDNA文库中获得12个与VDR互作的候选蛋白。初步检测到12个蛋白可能与VDR互作,其中3个蛋白因子可能与VDR结合并调控蛋白激酶磷酸化或去磷酸化以影响精子形成、发育和精子活力。     

烟草新驱动蛋白基因NtTKR原核表达载体的构建、诱导表达及蛋白纯化

通过对烟草驱动蛋白家族新成员Nt Tkr尾部的酵母双杂交筛选,得到多个与Nt Tkr互作的候选蛋白。为进一步验证NtTkr与候选蛋白之间的相互作用,以p GBKT7-Nt Tkr质粒为模板,PCR扩增烟草NtTKR全长,将其克隆入原核表达载体pMXB10,重组质粒pMXB10-NtTkr-3582经生物公司测序,结果正确。将其转化为BL21(DE3),IPTG诱导其表达目的蛋白,经几丁质法纯化及SDS-PAGE检测,结果表明笔者得到了高纯度的目的蛋白。该试验为进一步运用Pull Down确定Nt Tkr与候选蛋白之间的体外互作及深入研究该蛋白的其他生物学功能奠定了基础。     

环磷酰胺免疫抑制法制备单克隆抗体的研究

 采用纯化的鸡IgG免疫环磷酰胺预处理BALB/c小鼠后，再用亲和层析纯化的鸡IgM进行免疫，运用淋巴细胞杂交瘤技术，以间接ELISA法筛选，获得了5株能稳定地分泌抗鸡IgMμ链特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经ELISA交叉反应性试验和羊抗鸡IgMμ链抗血清阻断试验，证明这5株单克隆抗体均是抗鸡IgMμ链特异性的。采用环磷酰胺免疫抑制法制备单克隆抗体，其杂交瘤细胞阳性率为8.696%,而用常规免疫法为4.032%,前者比后者杂交瘤细胞阳性率提高1倍以上。经两次有限稀释法克隆和比较后，免疫抑制法获得5株单克隆抗体，而常规免疫法只获得2株单克隆抗体，前者有3株单克隆抗体腹水ELISA效价达到10#+（-12）、10#+（-14）、10#+（-15）；后者单克隆抗体腹水ELISA效价为10#+（-5）和10#+（-6）。因此，与常规免疫法相比，环磷酰胺免疫抑制法制备单克隆抗体具有杂交瘤细胞阳性率高，分泌的单克隆抗体特异性强、滴度高等优点，值得推广。     

全价颗粒饲料饲养舍饲山羊试验

试验山羊分为3组。预试期7d，正试期60d。第1组10只大白山羊，全饲全价颗粒饲料，平均每天每只采羊食0．79千克。第2组10只波尔山羊与大白山羊杂交一代，舍饲条件与1组完全相同，平均每天每只羊采食0．91千克全价颗粒饲料。第3组10只大白山羊，每日放牧6－8h（主要牧草品种为水草），平均每天每只补饲混合精料175g。第1组增重比第3组提高118．5％（P＜0．01）。第2组料肉比比第1组低29．24％（P＜0．01）。第2组只月收入是第1组的4．02倍，第1组是第3组的18．5倍（P＜0．01）。试验结果证明，山羊完全可以舍饲，舍饲山羊的经济效益大大超过放牧山羊，同时品种改良可以大大提高饲料利用率。     

中西医结合治疗儿童咳嗽变异性哮喘62例临床研究

目的观察中西医结合治疗儿童咳嗽变异性哮喘的疗效作用.方法62例咳嗽患儿随机分为西药对照组和中西医结合治疗组,两组均采用布地萘德、特布他林雾化吸入治疗,治疗组在此基础上给予中药治疗,疗程为2周.结果两组治疗结果比较,治疗组总有效率为93.75%,对照组为83.33%,经比较,有统计学意义（P〈0.05）.治疗后复发率治疗组为9.68%,对照组为23.08%,治疗组明显低于对照组（P〈0.05）,提示治疗组疗效稳定,且优于对照组.结论中西医结合治疗可提高咳嗽变异性哮喘的疗效.     

小麦氮高效基因型的蛭石盒筛选

为探索一种简便易行的小麦氮高效基因型筛选方法,以塑料盒为栽培容器,以浇施营养液的蛭石为栽培介质,对黄淮麦区24个小麦基因型在3种氮素水平下进行了氮高效基因型的筛选。结果表明,这种蛭石盒筛选法,能有效筛选出不同氮素水平的氮高效基因型,利用该方法筛选出的低氮高效基因型有石家庄8号、邯6172和科农199,高氮高效基因型有矮抗58和092-38,氮不敏感基因型有092-39,其中石家庄8号为典型的低氮高效型品种,矮抗58为典型的高氮高效型品种,筛选结果与材料的田间表现比较一致。这种蛭石盒筛选法不但操作简单,而且筛选效果明显,可应用于小麦营养高效研究。     

ND疫苗免疫益生素雏鸡vNDV攻击后外周血液免疫变化

应用免疫SPA菌体花环法、间接ELISA法、酸性非特异性酯酶染色法较全面系统地检测了新城疫(ND)疫苗免疫应用益生素雏鸡新城疫强毒(vNDV)攻击后,其外周血液的T、B淋巴细胞数量,IgG、IgM、IgA含量的动态变化及免疫保护率。结果表明,ND免疫应用益生素雏鸡vNDV攻击后,不但其外周血液的上述被检指标较未饲喂益生素的相应对照雏鸡不同程度增加,而且其免疫保护率也明显提高,表明益生素可增强雏鸡外周血液对ND疫苗免疫的体液和细胞免疫应答。并且益生素Ⅰ组又略强于益生素Ⅱ组,说明益生素Ⅰ的免疫增强效果优于益生素Ⅱ。     

红藤煎加减灌肠联合小剂量甲硝唑治疗滴虫性阴道炎75例临床分析

目的观察红藤煎加减灌肠联合小剂量甲硝唑治疗滴虫性阴道炎的临床疗效。方法 150例滴虫性阴道炎患者随机分为治疗组和对照组,每组75例。对照组应用小剂量甲硝唑治疗,治疗组在对照组基础上应用红藤煎加减灌肠治疗,7d一个疗程。比较2组治疗前后阴道乳酸杆菌阳性率、阴道分泌物改善、临床疗效和复发率。结果治疗后阴道乳酸杆菌检测阳性率高于本组治疗前(P0.05),且治疗组治疗后高于对照组治疗后,差异有统计学意义(P0.05);治疗组阴道乳酸杆菌阳性率、阴道分泌物改善率、临床疗效均优于对照组,差异有统计学意义(P0.05);治疗组复发率低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论红藤煎加减灌肠联合小剂量甲硝唑治疗滴虫性阴道炎可提高治愈率,降低复发率,值得临床推广。     

滤纸壳聚糖膜固定乙酰胆碱酯酶的研究

[目的]探索滤纸壳聚糖膜固定乙酰胆碱酯酶(AChE)的最佳条件。[方法]以滤纸壳聚糖膜为载体,戊二醛为交联剂,牛血清白蛋白(BSA)为保护剂,进行AChE的固定。并对固定化酶的理化性质进行研究。[结果]固定AChE的最佳条件为将50μl 150 U/mlAChE液,50μl 5%(V/V)戊二醛溶液,100μl 1%(W/W)BSA,pH 8.0的0.2 mol/L的PBS缓冲液配制成1 ml酶液,滤纸壳聚糖膜浸于该酶液4℃固定8 h。固定化酶的最适反应温度为37℃,最适pH为8.0,能够重复利用4次以上。[结论]该研究为利用AChE快速检测蔬菜水果中有机磷农药残留提供了理论依据。     

等离子体激活小麦种子增产技术研究

2002～2004年在山西临汾就等离子体激活小麦种子的增产效应进行了研究。结果表明等离子体激活小麦种子具有较好的产量效应和生物学效应。等离子体激活小麦种子可较好地协调旱地小麦的穗数、穗粒数、千粒重,其最佳处理18A×2每公顷产量达41955kg,较对照增产116%,该项研究将为旱地小麦增产技术开辟新的领域。     

基于NIR-SVM对鸭梨褐变病果的识别

本文针对水果内部品质评定分类存在主观性强和一致性差的特点,提出了一种新的鸭梨褐变识别分类方法,该方法是利用近红外光谱仪获取正常鸭梨和褐变鸭梨近红外光谱并对其进行分析的基础上,应用支持向量机(SVM)算法的识别原理建立正常鸭梨和褐变鸭梨的分类识别模型。在多项式核函数下对试验样品的识别准确率为95%。研究结果表明NIR-SVM用于对于鸭梨褐变病果的无损检测识别是可行的。