东南地区猪圆环病毒2型检测及分子流行病学分析

【目的】分析我国东南地区2012－2018年规模化猪场猪圆环病毒2型（PCV2）的流行动态、基因组特性及病毒重组情况,为猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）的防控和疫苗开发提供理论依据。【方法】对2012-2018年采自福建、江西、广东、江苏及浙江等省规模化猪场疑似断奶仔猪多系统衰弱综合症（PMWS）猪只的649份组织样本及血清样本采用PCR方法进行检测,对PCV2进行基因分型,并选取54份阳性样品进行PCV2全基因组同源性比对、系统发育分析和重组分析,同时对ORF2基因进行遗传进化分析和衣壳（Cap）蛋白氨基酸序列比对。【结果】东南地区猪场感染PCV2较普遍,PCV2阳性率为41.9%（272/649）。猪场存在PCV2a、PCV2b、PCV2d和PCV2e 4个基因型毒株,其中以PCV2d流行为主。基于PCV2全长核苷酸序列和ORF2基因的系统进化分析表明,54株PCV2毒株均分为4个基因型; PCV2e毒株检出率较低（仅为0.46%）,其基因组全长1 777 bp,与其他基因型代表毒株的全长核苷酸同源性较低（91.0%~93.0%）。重组分析表明,不同基因型毒株间存在重组现象。Cap蛋白的氨基酸序列分析表明,不同基因型具有特征性的突变位点。【结论】东南地区猪场存在4种基因型PCV2,其中PCV2d为优势基因型,不同基因型毒株间存在重组现象。新基因型PCV2e的检出率较低。     

2016—2020年浙江地区猪圆环病毒2型分子流行病学分析

为了解猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)在浙江地区的流行病学特点和遗传变异规律,本研究采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)对2016—2020年采自浙江省不同地区猪场的1 725份疑似猪圆环病毒2型感染的临床病料进行PCV2的病原学检测,同时对部分阳性样品进行全基因组扩增、克隆和测序,并与Gen Bank中收录的16株参考株序列进行比对和遗传进化分析。结果表明：PCV2检测阳性的样品有359份,平均阳性率为20.8%,2016—2020年PCV2阳性率分别为38.1%、23.2%、24.1%、12.5%和10.7%;测序所得PCV2 36个全基因序列的核苷酸同源性为94.0%～99.9%,与国产疫苗株核苷酸同源性为94.7%～98.5%,与参考株核苷酸同源性为92.9%～99.8%;遗传进化分析显示PCV2 36个全基因序列可分为3个基因型,其中11株为PCV2a型,8株为PCV2b型,17株为PCV2d型,PCV2d为优势基因型;ORF2基因全长分别为705 bp(16株)和702 bp(20株),...     

安徽省部分地区猪圆环病毒2型感染情况调查

[目的]了解猪群猪圆环病毒2型(PCV2)的感染情况,为安徽省猪圆环病毒病的防控提供科学数据。[方法]调查了安徽省8个县(区)的17个健康猪群,采集439份生猪扁桃体样品,采用荧光定量PCR方法对其进行检测。[结果]猪群PCV2平均感染率为23.0%,9个场点PCV2呈阳性,占53%;种猪场、商品猪场及屠宰场PCV2感染率分别为45.0%、11.8%和43.0%,商品猪场PCV2感染率极显著低于种猪场和屠宰场(P0.01);淮河以北地区和江淮之间地区PCV2感染率分别为13.0%和25.5%,差异显著(P0.05);大型商品猪场、中型商品猪场和小型商品猪场PCV2感染率分别为8.0%、0和26.0%,中型商品猪场PCV2感染率极显著低于大型商品猪场和小型商品猪场(P0.01);生产母猪、后备母猪、保育猪及育肥猪PCV2感染率分别为12.0%、16.0%、0和17.0%,其中保育猪PCV2感染率极显著低于生产母猪、后备母猪及育肥猪(P0.01)。[结论]安徽省部分地区超过50%猪群存在PCV2感染,应引起足够重视。     

猪圆环病毒2型组织培养特性研究

将经鉴定为PCV2阳性无菌处理的组织样品匀浆液接种到无PCV污染的PK15细胞中传代,PCV2病毒组织培养特性是添加D-氨基葡萄糖可有效地促进PCV2病毒的增殖复制,但病毒致细胞不产生病变,不能直接观察。应用PCR方法检测组织细胞培养物中的病毒增殖和增殖滴度,测定了PCV2病毒收获时间,试验表明PCV2病毒在PK15组织培养可连续传代,增殖病毒。     

广西猪圆环病毒2型的遗传进化分析

【目的】了解广西各地当前流行的猪圆环病毒2型（PCV2）基因型差异、出现的时间、致病性及其今后流行趋势。【方法】根据GenBank中已发表的PCV2核苷酸全序列设计1对引物,从广西不同市（县）采集的猪组织样本（脾脏、肺脏、淋巴结、流产胎儿）中成功克隆获得34株PCV2 ORF2基因序列,并对其进行遗传进化分析。【结果】获得的34株PCV2中有9株ORF2基因全长为705bp,1株为696bp,其余的为702bp;经遗传进化分析,发现PCV2可以分为PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e5个基因型,在34株PCV2ORF2基因中,有7株属于PCV2d型,1株属于PCV2e型,25株属于PCV2b型,未发现PCV2a和PCV2c型,而新发现的GXHP-2不归属于任何一个基因型。【结论】广西目前流行的PCV2有PCV2b、PCV2d、PCV2e3个基因型,其中以PCV2b为主。     

猪圆环病毒2型分子生物学研究进展

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要病因。目前流行的PCV2被分为PCV2a和PCV2b两个亚群。北美和其他国家PCVAD的暴发通常与主要基因型从PCV2a转变为PCV2b有关。本文对圆环病毒2型的分子结构及其表达产物的生物学活性的研究进展进行了综述,最后对分子差异和致病性进行了讨论。     

河南省猪圆环病毒2型感染的病原流行病学研究

采用PCR方法,从来自河南省不同地区的822份猪肺脏等病料组织中共检出514份猪圆环病毒2型(PCV2)阳性样品,总检出率为62.6%。2011年3-12月,PCV2在河南省的检出率介于41.6%～85.3%。其中,9-12月的检出率显著高于3-8月(P<0.05)。在河南省不同地区的猪群中,PCV2的检出率介于44.6%～87.9%;其中,驻马店市、漯河市、信阳市3个地区PCV2的检出率显著高于全省其他地区(P<0.05)。PCR检测过程中还发现,PCV2的检出率与猪群类别(日龄)有一定关系,其检出率随猪年龄的增长而升高(P<0.05)。在211份PCV2阳性样品中,有144份(占69.2%)能分离出不同的共感染菌。最常见的共感染菌是链球菌(52.1%,75/144)、副猪嗜血杆菌(42.4%,61/144)、大肠杆菌(39.6%,57/144)和多杀性巴氏杆菌(20.1%,29/144)。研究表明,PCV2在河南省10多个地区的猪群中广泛存在,且与病原菌的共感染情况非常严重。     

一株猪圆环病毒2型的分离与分子鉴定

利用PCR技术初步检测疑似PCV2感染的猪肺脏和淋巴结中的病毒.将样品处理后接种于PK-15细胞.从感染PK-15细胞PCR扩增PCV2基因片段,克隆入pMD18-T载体,并进行序列测定和比较.序列分析结果表明,分离病毒的PCR产物与国内多株PCV2核酸同源性大于98%,说明所分离的病毒为PCV2.     

猪2型圆环病毒ORF2基因片段的克隆与序列分析

利用ArrayDesigner2.0软件设计PCV2引物直接从PDNS病料肺组织中PCR扩增获得PCVCQB7基因片段,用pMD18-T载体连接、克隆获得PCVCQB7重组质粒。序列测定和与标准毒株对位比对分析PCVCQB7核苷酸序列全长624bp,系PCV2ORF2基因片段,与PCV2分离株的核苷酸序列相似性在80%以上,与PCV1在66%以下,采用最大似然法构建的系统发生树分析发现PCVCQB7位于PCV2主枝上,并与国内和欧洲分离株Imp.1147、304、375、QD、GD-TS、SH、24657_NL毒株亲缘关系较近形成一小分枝,表明PCVCQB7为引起PDNS的PCV2扩增产物。     

猪圆环病毒2型ORF3基因的克隆及原核表达

以细胞总基因组提取试剂盒抽提PCV2细胞毒株总DNA为模板,用特异性引物扩增PCV2 ORF3基因。将ORF3和表达载体pGEX-6p-1用BamH I和Sal I双酶切回收后连接,将测序验证为阳性的重组质粒命名为pGEX-6p-1-ORF3。重组质粒pGEX-6p-1-ORF3转化BL21(DE3)后用IPTG诱导表达并纯化,对获得的表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western blot检测。结果表明:PCV2 ORF3在pGEX-6p-1中获得了高效表达,其表达蛋白主要以包涵体形式存在,其分子质量约为37 kD,且能够和PCV2阳性血清发生特异性相互作用,具有免疫学活性。     

猪圆环病毒2型间接ELISA检测方法的建立

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列设计特异性引物,进行PCR反应,回收PCR产物,将其克隆入pMD18-T载体,再定向克隆到表达载体pET-32a中并转化大肠杆菌Rosetta,进行原核表达.表达产物经His-Bind蛋白纯化试剂盒纯化,平均浓度为1.10 mg/ml.以1.8 μg/ml蛋白包被酶标板,建立ELISA检测方法.建立的ELISA方法与北京世纪元亨公司试剂盒比较,两者检测结果符合率达85%以上.用该方法对常州某猪场36份母猪和156份10～160日龄猪群血清样品进行了检测,检测结果显示母猪阳性率为81.4%,仔猪阳性率随着日龄的增加而逐渐降低,之后由于受PCV-2的感染,阳性率逐渐升高.本试验建立的ELISA方法,具有较好的特异性、重复性和敏感性,可用于猪群PCV-2抗体的大规模检测.     

河南省及周边地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查

为了解河南及周边地区猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行病学情况,运用PCR方法对2014—2015年采集到的河南及周边地区山东、山西、河北、甘肃5省共158份病料进行PCV2检测,将PCR扩增得到的PCV2 ORF2基因片段进行测序,分析研究PCV2遗传变异情况。结果显示,158份样品中,有69份样品为PCV2阳性,得到19株病毒的ORF2基因序列;将检测到的PCV2 ORF2序列与国内外分离株进行比对发现,核苷酸序列的同源性为89.9%~99.9%,其氨基酸序列同源性为88.0%~99.6%。综上可知,河南及周边地区PCV2流行广泛,病毒变异频繁。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2部分基因的克隆及原核表达

根据发表的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)ORF2基因序列,设计合成1对特异性引物,从分离到的PCV2吉林株(JL01)中扩增出PCV2 ORF2579 bp的核苷酸片段,克隆到表达载体pET-32a中,经BamHⅠ和HindⅢ酶切及序列分析获得阳性重组表达质粒pET-32a-ORF2。将其转化到表达宿主菌BL21中,经IPTG诱导,成功表达了ORF2基因编码的部分结构蛋白,分子量为40 kD。通过SDS-PAGE和Western检测表明,表达的重组蛋白能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的反应原性。     

猪2型圆环病毒新疆株全基因组的克隆与序列分析

根据GenBank中猪2型圆环病毒(PCV2)的核苷酸序列,设计了一对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出一株PCV2全基因组,将其克隆到pMD simple18-T载体上,筛选获得了重组质粒pMD18-T- PCV2.对此重组质粒进行序列测定及同源性分析,结果表明,该PCV2新疆株的全基因组大小为1 767 bp,与其它PCV2核苷酸序列同源性为95.0％～99.6％,而与PCV1的同源性仅为76.8％～76.9％.     

猪圆环病毒2型贵州株ORF1基因的生物信息学分析

为了解猪圆环病毒2型贵州株(PCV2-GZ)ORF1基因的生物学特性,针对ORF1基因设计1对特异性引物,取PCV2阳性病料DNA为模板进行PCR扩增,克隆测序后进行生物信息学分析。结果表明:PCV2-GZ ORF1基因序列与GenBank登录的14株PCV2(06-06274,CC1,HUB-5,HUN-11,JX-1,LN-3,P710-1,PCV2HERD D,SC-10,SVP-321,SX-1,VOS 2689006,ZJ-38,N1)相应序列核苷酸的同源性为96.8%~99.7%,与国内HUB-5和ZJ-38的同源性最高,均为99.7%;PCV2-GZ编码的Rep蛋白与P710-1、HUB-5、SC-10、ZJ-38株的氨基酸序列同源性较高,均为99.4%。PCV2-GZ Rep蛋白可形成优势抗原表位,且不存在跨膜结构和信号肽,推测可进行PCV2 ORF1基因的全基因表达。     

一株高病毒载量 PCV2 毒株的基因组特征及序列分析

【目的】了解广东省某猪群中猪圆环病毒 2 型（Porcine circovirus type 2,PCV2）流行毒株的遗传进化情况,丰富 PCV2 分子流行病学数据,为当地 PCV2 疫苗候选株的选用和研发提供参考。【方法】使用 qPCR 方法对疑似 PCV2 的样品进行检测,发现 1 株具有高病毒载量的 PCV2 毒株,命名为 GD222858。通过 PCR 方法进行全基因组分子克隆及遗传进化分析。使用 MegAlign 软件将该毒株 ORF1、ORF2 基因编码的氨基酸序列与 PCV2 同亚型参考毒株进行比对,分析氨基酸序列的相似性;采用 DNAStar 预测该毒株的 Cap 蛋白二级结构及 B 细胞表位,并与 4 株疫苗株 DBN-SX07-2（HM641752）、LG（HM038034）、SH（HM038027）、ZJ（AY686764）的 Cap 蛋白抗原指数进行比对分析。【结果】GD222858 毒株基因组长度为 1 767 bp。遗传进化分析表明该毒株属于 PCV2d 亚型。与国内外 82 株参考毒株的核苷酸相似性为 91.4%~99.6%,与越南毒株 Han8（GenBank 登录号：JQ181600）的亲缘关系最近。在 ORF1 编码的 Rep 蛋白处发现多个特异性突变位点 F70Y、F77L、W202R、N256S;ORF2 编码的Cap 蛋白相对保守。Protean 预测 Cap 蛋白的氨基酸第 5~18、24~25、39~41、48~49、57~65、99、101、112~114、139~140、145~150、162~165、175~181、188~189、205~211、227~232 位 置 处 均 可 能 存 在 潜 在 的 B 细 胞 表 位。GD222858 毒株的 Cap 蛋白抗原指数与 4 株疫苗株均有差异,在氨基酸 45~57、124~132、223~233 位置处抗原指数明显高于 4 株疫苗株,且与疫苗株 HM038034 差异最大。【结论】GD222858 毒株感染猪群的原因可能是 Rep 蛋白多个位点发生特异性突变及疫苗株选用不当所致。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪Ⅱ型圆环病毒混合感染的诊断

采用病理学、PCR等实验室检测方法对采自吉林省某猪场的发病猪组织病料进行PRRSV、PCV2检测,结果表明该猪场的发病猪存在PRRSV和PCV2混合感染。对PRRSV和PCR扩增结果进行克隆分析,该基因序列与模板(EF112445.1)碱基序列有很高的同源性。