禽流感病毒HA基因在S2细胞中的表达与鉴定

根据GenBank中发表的禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)序列设计了1对引物并分别引入NotⅠ和NcoⅠ酶切位点,用PCR方法扩增AIV HA基因片段。回收目的基因片段,并用NotⅠ/NcoⅠ限制性内切酶消化,经纯化后,将其定向克隆入果蝇表达载体pMT/B/V5中,构建重组表达载体pMT-HA。测序验证正确后,用脂质体转染法与辅助质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,通过Blasticidin(杀稻瘟素)进行加压筛选,获得了抗性细胞S2-HA。提取S2-HA细胞的基因组DNA,PCR检测目的基因在果蝇S2细胞中的整合与表达。用终浓度500μmol/L的硫酸铜溶液诱导表达,收集无血清的细胞表达上清,样品浓缩后进行SDS-PAGE及Western Blotting检测。结果表明,成功构建了重组表达载体pMT-HA,转染细胞经10 mg/L的Blasticidin筛选及鉴定后获得了稳定表达HA的果蝇S2细胞株。     

TGEV双基因嵌合表达质粒pVAX—S—N的构建及体外表达

采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)SC-H株S基因5′端主要抗原位点片段和N基因,插入pMD19-T载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒19T-N与19T-S.从T载体上将S、N基因切下,以亚克隆方法插入真核表达载体pVAX1,构建嵌合表达S、N基因的重组质粒pVAX-S-N.对重组质粒PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况.结果表明,重组质粒构建正确且在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光.真核表达质粒pVAX-S-N的成功构建为进一步研究TGEV核酸疫苗奠定了物质基础.     

牛朊蛋白基因真核表达载体的构建及其在牛骨髓间充质干细胞中的稳定表达

试验构建牛朊蛋白(prion protein,PRNP)基因的真核表达载体,为进一步研究牛朊蛋白的生理功能和从细胞水平研究抗疯牛病转基因克隆牛奠定基础。采用重叠延伸PCR(splicing overlap extension PCR,SOE-PCR)法扩增获得牛PRNP基因序列,并克隆到带有DsRED2报告基因的真核表达载体pDsRED2-N1中,将双酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒经脂质体转染牛骨髓间充质干细胞(BMSC);通过荧光显微镜观察转染细胞,并用800 μg/mL G418对转染的细胞进行药物筛选。琼脂糖凝胶电泳显示基因合成的片段大小和构建的载体大小与预期相符;重组表达载体转染BMSC后有红色荧光出现;通过药物筛选出了稳定转染的细胞单克隆。通过SOE-PCR成功扩增了牛PRNP基因序列,并构建成真核表达载体,得到稳定表达目的蛋白的BMSC细胞。     

利用BiFC技术研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1结构域Ⅰ与棒状体颈部蛋白2互作关系

为了验证柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1结构域Ⅰ(apical membrance antigen 1 domain I,E tAMA1-DⅠ)与棒状体颈部蛋白2(rhoptry neck protein 2,EtRON2)的互作关系,以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增出492 bp的E tAMA1-DⅠ片段和1395 bp的E tRON2片段,并与pGEM-T-easy载体连接构建相应重组质粒。获得的阳性重组质粒及双分子荧光互补技术的真核表达载体pBiFC-VN155和pBiFC-VC155用E c oRⅠ和B g I II进行双酶切,将E tAMA1-DⅠ、E tRON2分别与pBiFC-VN155、pBiFC-VC155连接,构建真核重组质粒pBiFC-VN155-E tAMA1-DⅠ和pBiFC-VC155-E tRON2。将2个真核重组质粒分别转染BHK细胞进行表达,经间接免疫荧光鉴定,可在BHK细胞中成功表达。将2个真核重组质粒共转染至BHK细胞中,同时将pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(deltaZIP)VC155、pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(delta)VC155共转染至细胞中分别作为阳性和阴性对照组。BiFC结果发现真核重组质粒共转染组和阳性对照组的BHK细胞均产生绿色荧光,而阴性对照组无荧光,表明E tAMA1-DⅠ与E tRON2蛋白之间存在互作关系。本研究结果为深入研究E tAMA1及E tRON2在球虫入侵过程中的功能与作用机制奠定基础。     

PEDV和TGEV双基因共表达载体pVAXD-PS1-TS的构建及体外表达

采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒（TGEV）SC-H株S基因N端主要抗原位点片段（大小约为1 916bp）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）SC-L株S1基因（大小约为2 367bp）,插入pMDl9-T simple载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒pMD19-T-TS与pMD19-T-PS1。从T载体上将PS1、TS基因切下,以亚克隆方法插入双启动子真核表达载体pVAXD,构建能同时表达TGEV S基因和PEDV S1基因的重组质粒pVAXD-PS1-TS。对重组质粒进行PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况。结果表明,重组质粒构建正确且能够在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光。真核表达质粒pVAXD-PS1-TS的成功构建为进一步研究PEDV和TGEV的二联核酸疫苗奠定了基础。     

IBDV VP2蛋白在果蝇S2细胞中的表达与抗原性分析

利用果蝇S2细胞表达鸡传染性囊病病毒(IBDV)超强毒株VP2蛋白,并检测其抗原活性。通过扩增IBDV VP2蛋白的编码基因,与果蝇S2细胞表达载体pMT/BiP/V5/HisA连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5/HisA-VP2,将重组表达载体与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,表达VP2融合蛋白后纯化目的蛋白,并对表达产物进行抗原性分析。Western-blotting分析表明,融合蛋白相对分子质量为49 kDa,该融合蛋白具有与VP2单抗良好的结合能力。结论 IBDV VP2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行有效地表达,并且能分泌到上清中,融合蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断抗原用于该病的诊断检测。     

CBL蛋白的真核表达及其对日本脑炎病毒的抑制作用

CBL蛋白是一种E3泛素连接酶,在调控信号传导等方面发挥重要作用。采用PCR扩增CBL基因片段并连接到pEGFP-C1载体中,经Bam HⅠ、HindⅢ双酶切鉴定及基因测序,成功构建真核表达重组载体pEGFP-CBL。倒置荧光显微镜观察和Western blot结果证实,重组载体pEGFP-CBL在BHK-21细胞中成功表达。病毒增殖试验结果证实,日本脑炎病毒(JEV)强毒株感染转染pEGFP-CBL重组载体的BHK-21细胞,3 d内未见明显细胞病变。结果表明,真核表达载体pEGFP-CBL成功构建,且重组表达的CBL蛋白能够抑制早期JEV增殖,从而为深入研究CBL蛋白的免疫调节功能奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒E蛋白在Marc-145细胞中的表达

针对PRRSV E基因设计1对带有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,以PRRSV CC-1株为模版进行RT-PCR扩增,获得带有酶切位点的目的片段插入pMD18-T载体,对阳性重组质粒进行测序鉴定。将阳性质粒进行EcoRⅠ、SalⅠ双酶切,回收目的片段将其插入EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的真核表达载体pEGFP-N1中构建重组质粒pEGFP-N1-E,将重组质粒用脂质体转染Marc-145细胞,通过荧光显微镜观察显示,在转染后24h出现荧光,48h出现荧光高峰,筛选阳性细胞株,进行目的基因转录、Western blot检测目的蛋白的表达鉴定。结果表明：成功构建真核表达载体pEGFP-N1-E,建立了稳定表达的细胞株。为研究E蛋白如何与宿主细胞结合形成通道,PRRSV吸附、穿入宿主细胞的作用机理以及筛选特效的粒子通道阻断剂奠定了基础。     

敖汉细毛羊Noggin基因质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究

本实验旨在构建敖汉细毛羊Noggin基因表达载体,将其转染至成纤维细胞中,分析Noggin基因mRNA及蛋白表达量的变化。实验以40日龄胎羊为研究对象,采集组织样品,通过PCR反应扩增目的基因片段,经切胶回收后连接到pEM-T1载体,构建pEM-T1-Noggin后转染到大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞,提取pEM-T1-Noggin后进行酶切鉴定。鉴定后符合标准即可构建pcDNA3.1-Noggin重组表达载体,转至大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞振荡培养,将重组质粒pcDNA3.1-Noggin转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测Noggin基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果表明:经酶切、测序鉴定pcDNA3.1-Noggin表达载体构建成功,并成功瞬时转染成纤维细胞,转染组的mRNA及蛋白表达量均极显著高于对照组。本研究在细胞水平上验证了Noggin基因功能,为进一步在个体水平上研究Noggin基因功能奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒E蛋白在Marc-145细胞中的表达

针对PRRSV E基因设计1对带有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,以PRRSV CC-1株为模版进行RT-PCR扩增,获得带有酶切位点的目的片段插入pMD18-T载体,对阳性重组质粒进行测序鉴定。将阳性质粒进行EcoRⅠ、SalⅠ双酶切,回收目的片段将其插入EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的真核表达载体pEGFP-N1中构建重组质粒pEGFP-N1-E,将重组质粒用脂质体转染Marc-145细胞,通过荧光显微镜观察显示,在转染后24h出现荧光,48h出现荧光高峰,筛选阳性细胞株,进行目的基因转录、Western blot检测目的蛋白的表达鉴定。结果表明:成功构建真核表达载体pEGFP-N1-E,建立了稳定表达的细胞株。为研究E蛋白如何与宿主细胞结合形成通道,PRRSV吸附、穿入宿主细胞的作用机理以及筛选特效的粒子通道阻断剂奠定了基础。     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组鸡痘病毒的构建和鉴定

将 RVG基因插入到鸡痘病毒表达载体 p UTA- 2 Sm a 位点获得重组转移载体 p U TA- RVG,利用脂质体转染已感染中国鸡痘病毒疫苗株 2 82 E4株 2～ 3h的鸡胚成纤维 (CEF)细胞 ,收获病毒后 ,用 Brd U法进行加压筛选重组病毒 ,PCR检测到重组病毒 RVG基因 ,Western blot检测出 RVG,从而证实已成功构建了表达 RVG的重组鸡痘病毒     

重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对高致病性PRRSV N蛋白基因表达的抑制作用

构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果.PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因分别插入伪狂犬病病毒转移载体pUSKBH中,构建重组伪狂犬病病毒通用转移载体pUsiRNA.分别用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切pUsiRNA,回收后与HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的3个siRNA分子连接,构建表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒表达载体.将鉴定正确的重组伪狂犬病病毒表达载体与伪狂犬病病毒DNA共转染PK-15细胞,经同源重组及噬斑纯化获得表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒株,应用PCR及Southern blot鉴定重组病毒.将HN1株N蛋白基因的真核表达质粒pAcGFP1-N转染PK-15,经筛选获得稳定表达N蛋白基因的细胞.将鉴定正确的表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒接种于稳定表达N蛋白基因的细胞,利用绿色荧光蛋白基因及半定量RT-PCR检测重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA对N蛋白表达的抑制效果.结果显示,PCR扩增到的CMV-siR-NA-poly(A)片段约为0.7kb,新霉素基因约1.5kb.经酶切、PCR及测序鉴定,构建了表达siRNA的通用伪狂犬病病毒转移载体pUsiRNA.经PCR及Southern blot检测,获得了3株表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒gG-/siRNAN1、gG-/siRNAN2和gG-/siRNAN3;经荧光显微镜观察和半定量RT-PCR检测表明,重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA能够显著抑制N蛋白在PK-15细胞中表达,其中gG-/siR-NAN2抑制效果最好.这为深入研究N蛋白基因siRNA抑制HP-PRRSV复制奠定基础,并为HP-PRRSV的防制提供新的思路.     

猪瘟病毒E2基因自杀性DNA疫苗的构建及动物免疫试验

从含有猪瘟病毒(CSFV)Shimen株E2全长基因的重组质粒pMD18-T-E2上扩增得到带有BamHⅠ酶切位点的E2基因片段,构建重组克隆质粒pMD19-T-E2.用BamH Ⅰ酶切pMD19-T-E2和"自杀性"DNA疫苗表达载体pSCA1,构建"自杀性"DNA疫苗重组质粒pSCA1-E2.对目的基因E2的大小、插入位置、方向和读码框经PCR、酶切和序列测定进行鉴定.用纯化的阳性质粒pSCA1-E2转染PK-15细胞,转染后48 h荧光抗体法检测E2蛋白的表达;纯化的pSCA1-E2质粒分别免疫小鼠(10 μg/只)和试验猪(600μg/头),二免后分别检测小鼠脾淋巴细胞刺激指数和猪血清抗猪瘟特异性抗体水平.结果表明,构建的重组质粒中E2基因的大小、插入位置、方向和读码框均正确,获得了重组表达质粒pSCA1-E2;转染后48 h可检测到转染的PK-15细胞中E2蛋白的表达.免疫小鼠产生较高水平的淋巴细胞刺激指数,免疫猪可检测到抗CSFV特异性血清抗体;表明构建的pSCA1-E2重组质粒能激发实验动物的免疫反应.     

猪流感病毒NP基因重组复制缺陷型腺病毒的构建与表达

以含有猪流感病毒A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)NP基因的重组质粒pMD18-NP为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增NP基因,将其亚克隆至质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有NP及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-NP-EGFP。利用脂质体转染法将穿梭质粒pDC315-NP-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选到重组腺病毒rAd-NP-EGFP。经PCR和Western blotting鉴定,结果表明NP基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物学活性。重组腺病毒rAd-NP-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.26×1010/mL,为进一步研究该重组病毒的免疫原性奠定了基础。     

利用同源重组技术构建Chordin基因载体及其在成纤维细胞中表达量的研究

本实验旨在利用同源重组技术构建敖汉细毛羊Chordin基因表达载体,将其转染至成纤维细胞中,分析Chordin基因mRNA及蛋白表达量的变化。以40日龄的胎羊为研究对象,采集组织样品,参照Genbank中Chordin基因序列设计一对含有同源臂的引物,通过PCR反应扩增目的基因片段,利用SoSo试剂盒将目的片段连接至表达载体pcDNA3.1上。鉴定后符合标准即可将pcDNA3.1-Chordin重组表达载体转至大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞振荡培养。经质粒提取后将重组质粒pcDNA3.1-Chordin转染至成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测Chordin基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果表明:普通PCR反应产物经电泳检测后与目的基因大小一致,位于2874处,且条带单一无杂带;表达载体pcDNA3.1酶切效果良好,经电泳检测其大小位于5428 bp处,且条带单一无杂带;连接后经测序鉴定pcDNA3.1-Chordin表达载体无碱基突变,pcDNA3.1-Chordin表达载体构建成功;转染成纤维细胞后,经检测,转染组的mRNA以及蛋白表达量均极显著高于对照组。本实验成功构建了敖汉细毛羊Chordin基因的表达载体,并成功转染成纤维细胞且表达,为进一步对Chordin基因的功能研究奠定了基础。     

敖汉细毛羊Notch1基因真核表达载体的构建及在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊Notch1基因表达载体及转染成纤维细胞后基因表达量变化。试验以敖汉细毛羊40日龄胎儿为研究对象,提取RNA反转录并参照Gen Bank中Notch1基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得Notch1基因片段,将得到的Notch1基因片段连接至pGM-T载体,构建pGM-T-Notch1克隆载体并转化大肠杆菌(E.coli) DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定后构建pcDNA3.1-Notch1重组表达载体,转化大肠杆菌(E.coli) DH5α感受态细胞。将敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的pcDNA3.1-Notch1瞬时转染成纤维细胞,利用荧光定量PCR技术检测Notch1基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果显示:经酶切、测序鉴定质粒pcDNA3.1-Notch1构建成功,并且转染成纤维细胞后Notch1基因的表达量升高,且转染组的表达量极显著地高于对照组(P0.01)。结论:成功构建了敖汉细毛羊Notch1基因的表达载体,并且成功转染成纤维细胞,基因表达量明显升高,结果可为进一步研究其功能奠定基础。     

敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊DKK1基因的重组质粒,并对其转染成纤维细胞后基因的表达量变化进行研究。试验采集敖汉细毛羊肱二头肌提取基因组DNA,参照GenBank中DKK1基因序列设计1对引物,PCR扩增获得DKK1基因片段,连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-DKK1重组质粒并转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,鉴定正确后构建PmaxGFP-DKK1重组质粒,转化大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞;对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的重组质粒PmaxGFP-DKK1转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测DKK1基因在成纤维细胞中的表达量变化。结果显示,经酶切、测序鉴定发现,重组质粒PmaxGFP-DKK1构建成功,大小为3 956 bp,并成功瞬时转染成纤维细胞,转染细胞后DKK1基因的表达量明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组（P<0.01）。试验成功构建了敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒,并成功转染成纤维细胞,为进一步研究DKK1基因的功能奠定基础。     

西尼罗病毒糖蛋白第三结构域的原核表达及鉴定

根据西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)序列设计1对特异性引物,用PCR反应扩增糖蛋白第三结构域(WNVEDⅢ)基因,将PCR产物克隆至pGEX-4T-1原核表达载体上,获得重组表达质粒,将该质粒转化入E.coli DH5α,命名为pG-EDⅢ,鉴定正确后转入transetta表达菌中,经IPTG诱导后纯化重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western-blot方法证实WNV-EDⅢ基因可在大肠杆菌中高效表达,小鼠免疫试验证明该原核表达蛋白有良好的免疫原性。     

敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊DKK1基因的重组质粒,并对其转染成纤维细胞后基因的表达量变化进行研究。试验采集敖汉细毛羊肱二头肌提取基因组DNA,参照GenBank中DKK1基因序列设计1对引物,PCR扩增获得DKK1基因片段,连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-DKK1重组质粒并转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,鉴定正确后构建PmaxGFP-DKK1重组质粒,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞;对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的重组质粒PmaxGFP-DKK1转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测DKK1基因在成纤维细胞中的表达量变化。结果显示,经酶切、测序鉴定发现,重组质粒PmaxGFP-DKK1构建成功,大小为3 956bp,并成功瞬时转染成纤维细胞,转染细胞后DKK1基因的表达量明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组(P0.01)。试验成功构建了敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒,并成功转染成纤维细胞,为进一步研究DKK1基因的功能奠定基础。     

猪圆环病毒2型结构蛋白Cap在果蝇S2细胞中稳定表达与鉴定的研究

为了表达猪圆环病毒2型(PCV-2)结构蛋白Cap并检测其表达情况,试验采用果蝇S2细胞真核表达的方法,通过扩增PCV-2 Cap蛋白的编码基因,与昆虫细胞表达载体pMT/Bip/V5-HisA连接构建重组表达载体pMT/Bip/V5-HisA-Cap,用重组表达载体与筛选质粒pCoHygro共转染S2细胞,再使用选择性培养基加压筛选出稳定的细胞株,表达Cap融合蛋白后,利用SDS-PAGE及Western-bolt研究表达产物的抗原性。结果表明:融合蛋白的分子质量约为31 ku,该蛋白能够与带有V5标签的抗体结合,说明PCV-2 Cap蛋白能在S2细胞中正确表达,并具有良好的抗原性。