棉花黄萎病研究进展

由大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病已成为当前我国棉花可持续生产的主要障碍之一。该病害为土传种传维管束病害,具有病原菌寄主范围广,防治困难的特点。本文综述了近年来国内外有关其病原菌的致病力分化、全基因组测序与致病机制、微菌核形成与萌发机制,寄主的抗病分子机制以及病害防治措施等方面的最新研究进展。     

荧光标记基因转化棉花黄萎病菌及标记菌系选育

为了研究黄萎病菌的侵染机制,通过农杆菌介导的转化方法,将绿色荧光蛋白基因sGFP导入落叶型黄萎病菌VD07038,将红色荧光蛋白基因mCherryRFP导入非落叶型黄萎病菌Bp2中,分别获得了具有绿色、红色荧光信号的阳性转化子。经过分子验证和连续继代培养,证明了这些转化子具有遗传稳定的对潮霉素的抗性。通过对转化子的菌落形态、生长速度和致病力进行检测,发现大部分转化子与野生型基本一致,少量转化子发生变异,其中转化子Bp2R-30不能产生微菌核,致病力显著下降。利用荧光显微镜观察了转化子VD07038G-10在感病棉花品种苏棉22幼苗根部的侵染情况。结果表明,在接菌12 h后VD07038G-10的孢子可吸附在根表面;接种7~9 d后,菌丝入侵到棉花根部的维管组织。本研究获得的荧光蛋白标记的棉花黄萎病菌VD07038G-10可用于实时观测黄萎病菌侵染棉花根系的过程,并且可以定量鉴定不同棉花品种对该菌系的抗性,为棉花黄萎病菌抗性鉴定提供一种新方法。     

棉花黄萎病菌致病的分子机理

阐述了大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)产生的细胞壁降解酶、蛋白酶和毒素在致病中的作用及微菌核形成机制,全面分析了基因组学途径、RNA干涉和农杆菌介导的转化等真菌功能基因组学技术在大丽轮枝菌致病分子机理研究上的进展.     

我国棉花黄萎病菌基于SSR的遗传多样性分析

为了对棉花黄萎病菌群体的遗传多样性进行研究,以棉花黄萎病菌基因组DNA为模板,用双因素和单因素水平优化的方法对SSR反应体系的重要参数进行摸索和优化,建立了最适反应体系.从300对引物中筛选出13对多态性较高的引物,并对来自我国12个省96个县(市)的170个棉花黄萎病菌株进行SSR分析.SSR图谱的聚类分析结果将供试...     

江苏省大丽轮枝菌(Verticillum dahliae)营养体亲和性研究

用硝酸还原酶缺陷型(Nit)突变体技术,对来自江苏省80年代及1991年不同菌株进行了营养体亲和性研究。80年代的65个大丽轮枝菌菌株经含氯酸钾培养基诱导,表型鉴定获得突变体A型(Nit 1)73株,B型(Nit M)77株,C型27株,其它类型4株。亲和性测定表明,仅一株(VD8)与国外落叶型群相亲和,属同一亲和群,其余菌株为非落叶型群。对1991年的35个菌株诱导获得78个A型突变体,19个B型突变体。有5个菌株与国外落叶型群相一致,呈强亲和性反应,其中JC1B及SY12两菌株获得A、B两型突变体,可成为我国的落叶型的标准菌株。     

棉花黄萎病拮抗细菌的筛选与抗菌物分析

对21株芽孢杆菌属细菌分别进行了摇瓶震荡培养,其发酵液上清液用硫酸铵盐析,杯碟法测定了沉淀物对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)的拮抗活性,并对其中6株具有较强抑菌活性菌株的抗菌物进行了蛋白酶稳定性、热稳定性等分析.结果显示,BDT-25、JJ-5、DHT-12、80b-2、DHT-13和JJ-134菌株的抑菌活性较高;6株拮抗细菌发酵液沉淀物均对氯仿敏感,抗菌物溶液经蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后活性丧失或显著下降,对温度也较敏感,认为这些抗菌物质为蛋白或多肽类物质.拮抗菌株产生的抗菌蛋白通过抑制大丽轮枝菌孢子萌发和使菌丝体原生质凝集而抑制其生长.     

大丽轮枝菌侵染棉花幼苗过程中内源水杨酸响应的初步分析

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)会引起棉花黄萎病,是棉花可持续发展的主要障碍之一。为了揭示棉花幼苗对真菌病原的免疫反应途径,本研究利用带有增强型绿色荧记s GFP的大丽轮枝菌Vd592-G对5个不同品种棉花进行侵染,并对侵染发生后不同时间不同部位的棉花组织进行内源水杨酸含量的测定。结果表明：(1)不同棉花品种、不同取样部位对植株内源性水杨酸含量存在极显著(P<0.01)的影响,但两者的交互性不显著。(2)相同部位的不同棉种间水杨酸含量不存在显著差异,相同棉种间不同部位的水杨酸含量不存在显著差异,两者的交互作用不显著;但是同一棉种间的根、茎、叶接种后内源水杨酸含量变化呈现极显著相关(P<0.01)。(3)属抗黄萎病类型的棉花植株水杨酸含量显著小于属耐黄萎病类型的棉花植株(P=0.033)。(4)不同抗病性品种的植株水杨酸含量的差异性主要体现在根部。(5)同一抗病类型的棉花植株中根、茎、叶的水杨酸含量变化呈现极显著相关,不同抗病类型的棉花植株中只有茎部位的水杨酸含量存在显著相关。(6)‘海7124’茎部和‘新海14号’茎部的水杨酸含量变化存在极显著相关、‘...     

棉花尖孢镰刀菌绿色荧光蛋白的转化

棉花枯萎病是棉花的主要病害之一,严重威胁棉花产量和品质。绿色荧光蛋白(GFP)是发光水母(Aequorea victoria)体内的一种蛋白,作为报告基因拥有诸多优点,目前已被广泛应用于植物研究当中。为研究枯萎菌浸染棉花的过程及植病互作分子机理,本研究利用PEG介导的原生质体转化方法,将绿色荧光蛋白(GFP)基因转入到棉花枯萎病菌中,创制转报告基因株系。结果表明:转化子连续转接2代后仍能够稳定遗传,且荧光强度良好。经荧光共聚焦显微镜观察和PCR验证GFP基因已成功转入到菌株中,转化所得的菌株将为后续可视化检测和分析枯萎病菌对棉花的侵染等研究提供帮助。     

河南省不同地区棉花黄萎病菌分离物致病性及其毒素致萎活性测定

在河南省不同地区分离并鉴定33株棉花黄萎病菌分离物,并进行了致病力和粗毒素致萎活性测定。致病力结果表明,河南省棉花黄萎病菌分离物可分为强、中、弱3种致病力类型,分别占48.5%、21.2%、30.3%。河南省同一地区内不同分离物间致病力差异明显。粗毒素致萎活性测定结果表明,黄萎病菌强致病力分离物分泌的粗毒素对棉苗的致萎力较强,弱致病力分离物分泌的粗毒素对棉苗的致萎力较弱,强、中、弱3种致病力类型分离物在72h时对棉苗的平均致萎指数分别为63.82、52.38、45.83。采用考马斯亮蓝法测定不同分离物粗蛋白含量,结果表明,不同黄萎病菌分离物分泌的粗蛋白含量存在明显差异,且与其所致的病情指数呈显著正相关。     

棉花黄萎病拮抗蛋白的分离与纯化

从棉花叶组织中分离到的类芽孢杆菌(Paenibacillus)LC105菌株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌具有明显的拮抗作用.该菌株发酵液分别用过滤、高压灭菌及有机溶剂处理,初步证明对大丽轮枝菌产生拮抗作用的物质为蛋白质.LC105菌株发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析及Sephacryl S-100凝胶层析分离纯化,得到了分子量为27 kDa的抗菌蛋白.     

连作对棉田土壤枯、黄萎病菌数量及细菌群落的影响

采用选择培养法测定新疆库尔勒不同连作年限棉田土壤枯、黄萎病病菌数量的变化,运用PCR-DGGE(Polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis)技术分析棉花连作对土壤细菌群落结构和多样性的影响。结果表明,不同连作年限棉田的枯萎病菌和黄萎病菌量具有相似的变化特征,即在5~20年连作年限内,土壤中病原菌量随着连作年限的延长而增加,20年连作土壤病原菌数量达到最高峰;连作超过20年,土壤菌源数量开始下降。不同连作年限棉田土壤中枯、黄萎病病原菌的数量与发病株率呈显著正相关关系。连作棉田土壤细菌群落的DGGE图谱分析显示,连作棉田土壤细菌种群的组成、结构、丰富度均发生变化。连作5~40年的棉田土壤细菌种群Shannon-Wiener多样性指数(H')、均匀度(EH′)和丰富度(S)指数均降低,且连作年限越长降低越突出。     

新疆棉花枯萎病菌营养体亲和群及互补指数的研究

从采自新疆23个不同县(市或团场)的棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f．sp．vasinfectum)52个菌株上获得785个不能利用硝酸盐的突变体(nit),其中nitl 占70．57％,nitM占19．75％,nit3(8)占9．68％。将52个菌株分别与已知的4个7号小种菌株、一个3号小种菌株和一个8号小种菌株的突变体按nitl或nit3(8)配nitM的方式等距离配对,(各对菌株间的配组数为11～154),进行营养体亲和性的测定,结果表明,52个待测菌株与7号小种的4个标准菌株间存在着不同程度的营养体亲和性,而与3号小种和8号小种的标准菌株均不亲和,因此,它们属于7号小种营养体亲和群—VCG701。但各菌株与7号生理小种的4个标准菌株间的互补指数存在着差异,显示出棉花枯萎病菌同—营养体亲和群内在个体间存在着生理和遗传的差异。     

棉花黄萎病菌致病类型研究

以研究手段为主线,从形态学特征、凝胶电泳、血清学反应、营养体亲和性及几项分子生物学技术等方面讨论了目前国内外在划分棉花黄萎病菌种内致病类型上的研究进展状况,并在本文基础上作了总结。     

棉花根部拮抗枯萎病菌或黄萎病菌的可培养内生细菌多样性分析

为解析棉花内生细菌的种群结构,更好地开发利用生防内生细菌,以棉花枯萎病菌、黄萎病菌为指示病原真菌,对常抗棉和泗棉3号根部分离获得的内生细菌进行拮抗活性筛选,获得87株至少对其中1个指示病原真菌具有拮抗作用的内生细菌。ARDRA分析(Amplified ribosomal DNA restriction analysis)和16S r DNA序列测定表明棉花根部可培养内生拮抗细菌可分为13个ARDRA类群,分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、农杆菌属(Agrobacterium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、不动杆菌属(Acinetobacter)和假单孢菌属(Pseudomonas)7个属。其中常抗棉根部内生拮抗细菌分属于芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属和农杆菌属,而泗棉3号根部内生拮抗细菌则分属于芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、中华根瘤菌属、不动杆菌属和假单孢菌属,二者的优势种群都是芽孢杆菌属细菌。BOX-PCR分析显示这些内生拮抗细菌具有丰富的遗传多样性。通过测定这些内生拮抗细菌对棉花黄萎病菌和棉花枯萎病菌的拮抗力大小,以及是否具有产纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶和嗜铁素的活性,表明这些内生拮抗细菌具有不同的生防作用机制。     

河北省棉花黄萎病菌致病性的研究

在棉花苗期采用塑料营养钵底部定量注菌液法接种，于昼温２５～２６℃，夜温２０～２２℃的人工培养室中测定了自河北省重点植棉县分离的４０个棉花黄萎病菌单孢菌系和外地５个菌系的致病性。以中棉石系亚、海岛棉海７１２４、陆地棉９３抗１２、辽棉５号、冀棉１１号、农大３６５６个品种为鉴别寄主，以病情指数作为划分抗、感类型的标准，根据在鉴别寄主上的反应，４５个供试菌系可被划分为致病力强的Ⅰ型、致病力中等的Ⅱ型和致病力弱的Ⅲ型，分别占５３．５％、２８．９％、１７．８％。Ⅰ型菌系除使中棉表现抗（耐）病外，海岛棉和陆地棉均表现感病。该类菌系遍布冀中南棉区，其中有７个菌系可使部分品种表现落叶，证明河北省已有落叶型菌系存在。试验还表明，海７１２４、９３抗１２、冀棉１１号和农大３６５４个棉花品种对黄萎病鉴别力较强，可作为鉴别寄主加以应用     

陕西关中地区棉花黄萎菌营养亲和性研究

 由于陕西关中地区的泾阳菌系被定为致病性最强的生理Ⅰ型,本试验采用营养亲和性的方法对陕西关中地区采集的18个菌株以及陕西省植保所提供的新疆和田菌系、陕西泾阳菌系和河南安阳菌系进行了研究。经不同氮源利用的鉴定,结果为：21个菌株共获得364个nit突变株,其中nit1 289个,占总量的79.40%;nitM 72个,占总量的19.78%; nit3仅有3个。经营养体亲和性配对测试,21个菌株可分为3个营养亲合群(VCGs)。 新疆和田菌系属于亲合群2(VCG₂),河南安阳菌系属于亲合群3（VCG₃）。其余的18个菌株属于亲和群1(VCG₁)。B18没有产生突变体。且发现不同菌株营养体亲和产生的亲和带形态有差异,且具一定稳定性。由此可见, 造成陕西关中地区棉花黄萎病发生严重并造成经济损失的主要原因是由于主要致病菌属于VCG₁。     

北方植棉区棉花黄萎病菌生理分化类型研究

通过对采自北方植棉区落叶和非落叶病株的５１个棉花黄萎病菌系致病力分化测定结果，确定我国北方植棉区存在落叶类强致病力菌系；混合类中度致病力菌系及非落叶类弱致病力菌系的３个致病类型，并分别占测试菌的４１．５１％、３５．８５％和２２．６４％，其中９个强致病菌系致害棉苗出现落叶程度与对照菌的落叶程度相当或略重，表明河北、山东、河南植棉区重病田有落叶型黄萎菌系。病菌培养性状研究，得出３个培养型，即黑色菌落型、灰白色菌落型与白色菌落型。明确了黄萎病菌生长最佳温度为２５℃，这一结果同田间黄萎病大发生要求的温度一致。     

新疆乌苏地区棉花黄萎病菌分离鉴定和致病力分析

为了研究新疆乌苏地区棉花黄萎病菌的致病型和群体间的变异性,从该地区不同棉株上分离8株病原菌,通过对病原菌的菌落培养形态、菌丝和孢子的显微结构、对寄主的致病性、ITS序列的克隆、菌株间的系统进化及营养亲和性分析等方面进行了研究。结果表明：分离的病原菌均属于非落叶型棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae),为大丽轮枝菌;系统进化树显示8株菌在系统进化上属于2个不同的进化方式;8株黄萎病菌在相同的寄主上致病性存在差,Vd-1菌株致病力最强,Vd-34致病力最弱;不同致病力的菌株之间的营养亲和性分为2个营养亲和群(VCGs)。新疆乌苏地区棉花黄萎病的致病菌是大丽轮枝菌,病原菌在进化上差异显著。     

棉花红腐病菌nit突变体筛选及营养亲和群测定

 以自安徽不同地区分离的棉花红腐病菌（Fusarium moniliforme）单孢株为供试菌株,在含KClO₃培养基上诱导筛选获得抗氯酸盐的硝酸盐营养缺陷型(nit)突变株232株,根据在MM、NM、HM等3种不同氮源培养基上的生长情况划分出nit A、nit B、nit C、nit D 4种突变类型,其中nit A出现频率最高,179株,占总体的77%;nit B 25株,占总体的11%;nit C 24株,占总体的10%;nit D最少,4株,占总体的2%。将各菌株的nit A突变株和测试菌株的nit B或nit C配对,结果12个菌株分为6个不同的营养体亲和群(VCGs),其中3个VCGs各含1个菌株,另外3个VCGs各含3个菌株。结果还表明,来源于同一野生菌株的不同类型nit突变体间或同一VCG不同野生菌株的nit突变体间可产生互补反应而形成亲和带,其中以nit B型突变株互补性最好,在利用nit突变体测定营养体亲和性时作为标准菌株;来源于不同VCG的nit突变体间不能产生互补反应。     

新疆棉花黄萎病菌致病性分化的研究

对新疆主要植棉区的30个棉花黄萎病菌菌株及陕西省农科院植保所赠送的4个标准菌株进行致病性分化和营养亲和性研究。结果表明,新疆棉花黄萎病菌致病性分化明显,可分为强、中、弱3种类型,34个菌株中的32个菌株可分为2个亲合群,另外两个菌株暂未划定亲合群。