三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)几丁质酶PtCht3基因克隆鉴定及表达分析

为初步研究三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)几丁质酶PtCht3的生物学功能,利用特异性引物扩增和SMARTTM RACE技术克隆获得三疣梭子蟹PtCht3基因全长cDNA序列,并对该序列进行分析.结果显示,三疣梭子蟹PtCht3基因全长为1409 bp,对PtCht3基因序列推导出的氨基酸序列进行分析可知,该基因编码由394个氨基酸组成的蛋白质,预测分子量为43.67 kDa,理论等电点为4.80.PtCht3蛋白亲水性总平均数为-0.097,属于稳定蛋白.同源性和系统进化分析发现,PtCht3与日本仿长额虾(Pandalopsis japonica)和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)几丁质酶3的同源性分别为54％和53％,与其他甲壳动物几丁质酶3聚为一支.RT-PCR显示,PtCht3基因具有较强的组织表达特异性,在肝胰腺中的相对表达量最高,在三疣梭子蟹蜕皮前期表达上调,低盐胁迫后在鳃和肝胰腺中表达量出现了波动,总体呈先上升后下降的表达趋势.推测PtCht3可能在三疣梭子蟹消化和蜕皮过程中发挥重要作用,参与三疣梭子蟹渗透压调节进程.本研究为三疣梭子蟹几丁质酶的功能研究提供了重要信息.     

不同近交程度对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)繁殖性能的影响

以本实验室建立的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)全同胞家系为研究对象,通过连续观测6代三疣梭子蟹近交家系的抱卵量、排幼量、孵化率、单位体重抱卵量、单位体重排幼量及幼体发育各阶段的变态率6个指标来评价近交对三疣梭子蟹繁殖性能的影响.方差分析显示,在实验亲蟹的规格大小对测量数据无影响的条件下,近交系数每增加10％,各近交代与非近交代F1m在单位体重抱卵量与单位体重排幼量的差异不显著(P＞0.05),这2个指标的近交衰退系数分别为-2.789％～-6.620％和-1.188％～-5.938％;孵化率的差异也不显著(P＞0.05),衰退系数为-1.859％～-7.222％,表明没有明显的近交衰退;由溞状幼体(Z)阶段、大眼幼体(M)阶段到Ⅱ期幼蟹阶段的变态率变化趋势可知,随着近交代数的增加,各阶段的变态率呈下降趋势.     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)两种养殖塘水体古菌的季节变化

结合基于古菌16S rRNA 基因的末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术与克隆测序技术对象山港三疣梭子蟹–脊尾白虾混养模式下改良塘 M1(塘底铺网、四周铺砂的养殖塘)以及传统塘M2(土塘)不同季节水体古菌群落结构和多样性进行分析。结果显示,M1、M2养殖塘水体古菌群落均由泉古菌门(Crenarchaeota)和广古菌门(Euryarchaeota)组成。M1、M2水体古菌群落组成在养殖初期较相似,但随着养殖时间的推移,古菌群落结构组成发生显著差异。M2养殖水体古菌群落结构随时间变化的差异性大于 M1,说明 M2养殖生态古菌群落稳定性低于 M1,底铺网、四周铺砂的改良措施可以减少古菌群落变化的幅度。相关性分析发现,多样性指数高时,古菌分布受环境的影响较小;2种养殖塘水体古菌分布受温度、溶解氧、总氮和总磷的影响较大。     

三疣梭子蟹稚蟹标志方法的探讨

前言经济价值较大的甲壳类之一——三疣梭子蟹,近年来由于过度捕捞的影响,资源量大幅度下降,开展梭子蟹的人工育苗及放流增殖的研究,是很有必要的。1986年～1988年,日本海外渔业协力财团与营口增殖实验站合作,在前人试验的基础上,在我国首次取得了三疣梭子蟹工厂化人工     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) 4个地理群体体色差异分析

对鸭绿江口、莱州湾、海州湾、舟山4个野生群体的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)头胸甲颜色进行观察及大螯斑点、头胸甲斑点、游泳足斑点数量统计,采用单因子方差分析和判别分析法对其进行比较。结果显示,4个地理群体头胸甲颜色存在显著差异,斑点数量存在显著或极显著差异;对样本所属群体进行判别分析,4个群体雌蟹的综合判别率为53.3%,其中海州湾最高,为83.3%;莱州湾最低,为30.0%;说明根据斑点数量不能精确完成个体群体归属判定。建立4个群体各自的判别函数公式,通过对同样环境下养殖的4个群体子代进行单因素方差分析,发现子代间差异减少;而家系结果显示,子代头胸甲颜色和亲本差异较大,斑点为中间型。综合以上数据初步判定,三疣梭子蟹体色受环境和遗传共同作用,且环境因素为主导因素。     

三疣梭子蟹低盐耐受性相关甲基化标记的开发及验证

为开发三疣梭子蟹低盐耐受性相关甲基化标记,采用甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法(methylation sensitive high resolution melting curve, MS-HRM)进行了三疣梭子蟹低盐耐受性相关甲基化位点的筛选和应用。结果显示,从三疣梭子蟹转录组数据库中共开发了8个甲基化标记,其中6个标记与低盐度耐受性显著相关,在低盐度条件下表现出显著的去甲基化或甲基化,这些标记分别位于V-ATP酶(V-type proton ATPase)、CLC型氯离子通道、琥珀酸脱氢酶、NAD(P)转氢酶(NAD(P)、磷酸乙醇酸性磷酸酶、NADH还原酶基因,为三疣梭子蟹耐低盐新品种的分子标记辅助选育提供候选工具。研究表明,“宁象1号”耐低盐能力显著高于野生群体,且选育群体中位点Pt-M1、Pt-M2的去甲基化率达到100%,可能有利于低盐条件下保持体内Na⁺和Cl^-的平衡。     

基于饵料及敌害生物的莱州湾中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)增殖基础分析

根据2011年及2013年6个航次的调查,结合历史资料,统计分析了莱州湾中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)及二者敌害生物单位捕捞努力量渔获量(Catch per unit fishing effort,CPUE)的长期变化,研究了目前二者的饵料生物密度以及饵料生物与敌害生物的数量分布.结果显示,目前中国对虾、三疣梭子蟹以及二者敌害生物的CPUE均呈历史低位水平.放流期间,莱州湾浮游植物饵料等级为Ⅴ级(很丰富),底栖动物饵料等级为Ⅳ级(丰富);中国对虾的饵料生物密度分别以莱州湾东北部(5月)和中东部(6月)最高,敌害生物密度分别以中西部(5月)和东南部(6月)最高;三疣梭子蟹的饵料生物密度均以莱州湾西南部和东北部最高,敌害生物密度分别以中西部(5月)和西北部(6月)最高.     

盐度胁迫对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)鳃中游离氨基酸含量的影响

本研究分析了不同盐度环境下三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)鳃组织中游离氨基酸(FAAs)的含量及浓度变化规律,明确 FAAs 的组成及其在盐度适应中发挥的功能。结果显示,在正常海水中,三疣梭子蟹鳃组织中牛磺酸(Tau)的浓度最高(2.54 mg/g),其次分别为丙氨酸(Ala,0.65 mg/g)、谷氨酸(Glu,0.64 mg/g)、精氨酸(Arg,0.58 mg/g)、甘氨酸(Gly,0.48 mg/g)和脯氨酸(Pro,0.25 mg/g);在盐度10–50范围内,梭子蟹鳃中总游离氨基酸(TOFAA)的含量随盐度的增加而显著升高(P<0.05),盐度50时,TOFAA 的含量为盐度10时的1.48倍。进一步分析发现,非必需氨基酸(NEAA)(Gly、Glu、Ala 和 Pro)的浓度随盐度的升高而上升,而必需氨基酸(EAA)的浓度变化不显著(P>0.05)。研究表明,FAAs 在三疣梭子蟹盐度适应中具有重要功能,其中发挥渗透调节功能的主要为 NEAA。     

浙江沿海三疣梭子蟹的养殖模式

为开发三疣梭子蟹低盐耐受性相关甲基化标记,采用甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法(methylation sensitive high resolution melting curve, MS-HRM)进行了三疣梭子蟹低盐耐受性相关甲基化位点的筛选和应用。结果显示,从三疣梭子蟹转录组数据库中共开发了8个甲基化标记,其中6个标记与低盐度耐受性显著相关,在低盐度条件下表现出显著的去甲基化或甲基化,这些标记分别位于V-ATP酶(V-type proton ATPase)、CLC型氯离子通道、琥珀酸脱氢酶、NAD(P)转氢酶(NAD(P)、磷酸乙醇酸性磷酸酶、NADH还原酶基因,为三疣梭子蟹耐低盐新品种的分子标记辅助选育提供候选工具。研究表明,“宁象1号”耐低盐能力显著高于野生群体,且选育群体中位点Pt-M1、Pt-M2的去甲基化率达到100%,可能有利于低盐条件下保持体内Na⁺和Cl⁻的平衡。     

急性盐度胁迫对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)“黄选1号”血清渗透压及离子含量的影响

为探索三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)“黄选1号”在盐度适应过程中血清渗透压和离子浓度的变化特点及规律,进而了解其渗透压调节机理,设置盐度为5、10、20和50共4个实验组,以盐度30的自然海水为对照组,进行三疣梭子蟹“黄选1号”急性盐度胁迫实验.结果显示,各实验组血清渗透压呈规律性交化,0-12 h期间,低盐实验组血清渗透压较对照组表现为下降,盐度为50的高盐实验组,血清渗透压表现为上升;12-72 h期间,各实验组血清渗透压达到稳定状态.随着胁迫盐度的升高,血清与环境介质渗透压的差值先减小后稳定,与外界环境未出现等渗现象.血清中Cl-、Na+、K+含量的变化与血清渗透压的变化相似,但血清与环境介质离子含量的差值表现为Cl-、Na+含量差值先下降后稳定,C含量差值表现为先上升再下降最后稳定.研究表明,三疣梭子蟹“黄选1号”渗透压调节类型属于高渗调节型,Cl-和Na+在渗透压调节中起主要作用,提示三疣梭子蟹“黄选1号”具有较强的渗透压调节能力,对生存环境盐度的变化具有较强的适应能力.     

三疣梭子蟹基因组小卫星特征分析

通过构建三疣梭子蟹部分基因组文库,对获得的4 164个克隆测序,共获得总长度为622 409bp的DNA序列。在序列拼接后长度500～1500bp的709个克隆中,筛选到130个小卫星序列,其序列总长度占测序序列总长度的2.55%。小卫星序列中,以12bp重复单位的序列数量最多（10.77%）,总体趋势表现为重复单位越长,相应的重复序列数目越少（R=-0.663,p＜0.01）。小卫星重复单位拷贝数分布范围以8bp重复单位最广为3.9～66.5;其次是13bp重复范围在2.0～40.6;再次是26bp重复,范围在2.3～21.0。平均拷贝数最高的三种重复类型分别为8bp重复(19.96),25bp重复(16.00)和22bp重复(15.85)。小卫星序列中各重复单位的拷贝数分布范围2～66.5,集中分布在2～25,且表现为拷贝数目越大,其相应的重复序列数目越低的趋势。130个重复序列分别由123种重复单位所组成, 因而小卫星重复序列的类型很多。 我们初步分成三类：两种碱基组成类别、三种碱基组成类别和四种碱基组成类别, 并进一步根据各个重复序列中所含有的碱基种类的数量从大到小排列这些碱基而分成若干小类。从这些分类中可以看出,三疣梭子蟹基因组中的小卫星整体上是富含A/T的重复序列, 并揭示了其与微卫星重复序列之间的关系, 即一部分小卫星重复序列可能起源于微卫星序列。     

三疣梭子蟹渔业生物学的初步调查

为探讨池塘养殖三疣梭子蟹的生长规律和雌雄差异,本研究对1~6月龄池塘养殖三疣梭子蟹各生长指标进行了比较分析,并采用Logistic模型分别拟合三疣梭子蟹的体重 (BW)、体长 (BL)、体高 (BH)、全甲宽 (FCW)、甲宽 (CW)、大螯长节长 (MLC)、大螯不动指长 (FFLC)、第一步足长节长 (MLFP)等8个形态性状的生长特征。结果显示,三疣梭子蟹雌性和雄性的生长存在差异,早期雄性生长较快,后期雌性生长较快,而雌雄混合分析介于二者之间。三疣梭子蟹各生长性状的Logistic模型拟合结果显示,除雌性MLC和MLFP以及雌雄混合分析的MLFP之外,其余性状R²均达到0.990以上;雌性和雄性体质量的极限生长值分别为290.27和195.91 g,快速生长区间分别为2.74~5.10月龄和2.33~4.14月龄,拐点分别为3.92和3.24月龄。研究表明,三疣梭子蟹的生长过程均符合“慢-快-慢”的特征,雄性比雌性更早进入快速生长期,但是快速生长期的持续时间不及雌性。本研究对三疣梭子蟹不同生长指标的规律特征,以及各指标在混合养殖条件下雌性和雄性的优势阶段进行了研究,为实现三疣梭子蟹精细化高效养殖提供了参考。     

三疣梭子蟹线粒体基因组单核苷酸多态性

为获得三疣梭子蟹线粒体全基因组(mt DNA)SNP突变位点,本研究针对其mt DNA全序列设计了179对引物,采用高分辨率熔解曲线(HRM)检测技术对SNP进行了筛查。在179对引物中,有89对引物具有特异性扩增结果;进一步研究表明,89对引物中共有22对引物的扩增区域含有SNP突变位点,共包含24个SNPs。统计结果显示,三疣梭子蟹线粒体基因组中的SNP分布频率为0.15/100 bp,其中转换突变比例为79.1%、颠换突变比例为16.6%;C/T(G/A)突变比率为79.1%、G/T(C/A)突变比率为8.3%、A/T突变与G/C突变的比率均各占4.16%。本研究中所获得的SNP位点分布于三疣梭子蟹线粒体基因组的11个区域,且分布不均。其中COX1基因区域的SNP数目最多,其次在D-LOOP、ND1基因区域分别为3和4个SNP位点;而t RNA、12S r RNA等其他区域尚未发现突变位点。本研究所建立的三疣梭子蟹线粒体全基因组SNP的快速筛查方法及发现的SNPs,为进一步开展三疣梭子蟹种质遗传资源多样性、增殖放流标记等方面的研究提供了分析工具。     

蟹笼渔具逃逸口位置对三疣梭子蟹逃逸行为的影响

为了检验蟹笼渔具逃逸口对三疣梭子蟹逃逸行为的影响,实验使用红外水下摄像装备观察了三疣梭子蟹对3种不同配置逃逸口(位于侧网底部、开口高度3.2 cm和4.0 cm以及位于侧网顶部、开口高度4.0 cm)的反应行为。水下观察结果显示,三疣梭子蟹在笼底的探索行为使其能轻易发现和接近底部逃逸口,而垂直搜索行为能使其发现和接近顶部逃逸口,虽然发现并接近顶部逃逸口所需的时间显著大于底部逃逸口,但平均次数无显著性差异;87%接近逃逸口的个体企图穿越逃逸口,且逃逸口位置对此无显著影响;所有个体均采用侧身姿态穿越逃逸口,甲高是决定个体成功逃逸的关键因素;穿越顶部逃逸口的三疣梭子蟹需要花费更多的时间和精力调整姿态和位置以更好地匹配逃逸口,但广义线性混合模型(GLMM模型)拟合结果显示,逃逸口位置对个体逃逸成功率没有显著影响,表明三疣梭子蟹具有较高的个体姿态操纵能力,而笼内个体数量对逃逸成功率具有显著的影响。结合水下观察,研究认为个体在探索行为的活跃程度和浸泡时间会影响逃逸口的性能;考虑到东海近海蟹笼的结构和渔业现状,研究认为在蟹笼侧网靠近底部安装一个逃逸口是目前可行的技术措施。     

辽东湾三疣梭子蟹增殖放流效果评估

根据2018年6—8月在辽东湾对三疣梭子蟹增殖放流前后进行的4个航次的对比调查结果,定量分析了辽东湾三疣梭子蟹自然群体和增殖放流群体的数量,并根据三疣梭子蟹放流苗种数量和放流后捕捞产量调查数据,对辽东湾三疣梭子蟹增殖放流效果开展评价。结果显示,2018年6月上中旬辽东湾海域三疣梭子蟹增殖放流前,自然群体资源量较低,相对资源密度为2.80只/h;在6月下旬共放流苗种3 678.94万只,7月上中旬、8月上中旬和8月下旬三疣梭子蟹相对资源密度分别为16.60、2.20和13.33只/h。通过6月上中旬放流前本底调查和8月下旬放流后跟踪调查分析增殖放流前后三疣梭子蟹资源量的变化,通过内禀增长率来计算自然群体在放流前后的种群扩繁能力,计算出2018年辽东湾三疣梭子蟹放流后,放流群体所占比例为30.10%;同时采用世代分析法,分析出2018年三疣梭子蟹当年补充群体占比为94.54%。统计2018年秋汛期间三疣梭子蟹捕捞产量为1 890 t,增殖放流回捕产量538 t,回捕率9.36%,投入产出比为1∶12.02。通过扫海面积法估算三疣梭子蟹的资源量为2 056 t,接近于回捕调查的实际产量。建议可以适当加大辽东湾三疣梭子蟹的放流量,促进辽东湾三疣梭子蟹资源修复和渔民增收。     

盐度胁迫对三疣梭子蟹肌肉和血淋巴中游离氨基酸含量的影响

为探究不同盐度环境下三疣梭子蟹肌肉和血淋巴中游离氨基酸(free amino acids,FAAs)的含量及浓度的变化规律,明确FAAs的组成以及在盐度适应中发挥的作用,丰富FAAs在甲壳动物盐度适应领域的研究,为后续分子机理的研究提供依据,实验设定胁迫盐度分别为10、20、40、50,以正常海水(盐度33)为对照,用日立835-50型氨基酸自动分析仪测定三疣梭子蟹血淋巴与肌肉组织中游离氨基酸的组分,分析不同盐度环境下三疣梭子蟹肌肉和血淋巴中FAAs的含量及变化规律。结果显示,在正常海水中三疣梭子蟹血淋巴和肌肉中含量较高的FAAs主要为牛磺酸(Tau)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)和丙氨酸(Ala)。盐度为10~50,梭子蟹肌肉和血淋巴总游离氨基酸(total free amino acid,TOFAA)的含量随盐度的增加而显著升高,非必需氨基酸(non-essentical free amino acid,NEAA)的含量随盐度的升高而上升,而必需氨基酸(essentical free amino acid,EAA)的含量变化不显著,因此,TOFAA在渗透压调节方面的作用主要取决于NEAA。发挥主要渗透压调节作用的FAAs为脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)。Ala、Gly、Asp、Glu属于鲜味氨基酸(taste amino acid,TAA),研究表明,NEAA中的TAA在渗透压调节方面作用显著,Pro含量的升高对TOFAA含量的增加作用显著,盐度为40~50尤甚,表明Pro在梭子蟹高渗调节中发挥重要作用。     

三疣梭子蟹精子活力评价方法的研究

采用染色法和钙离子载体A23187诱导精子顶体反应法,对三疣梭子蟹精子的活力进行评价研究.结果表明,采用台盼蓝染色无法清晰辨别死、活精子.采用曙红B染色,精子分别呈现不同的染色特征:活精子无色,细胞边界清晰可辨,在光学显微镜下观察可见顶体中央突起的圆锥状结构和辐射臂;死精子细胞边界有稍许模糊,核杯和顶体均着色.最适的曙红B浓度和染色时间分别为2%和2 min.钙离子载体.A23187诱导精子顶体反应的结果显示:在诱导时间和A23187浓度分别为50 min和30μg·mL-1时,校正顶体反应率达到(92.73±2.43)%.对这两种活力检测方法的比较分析显示,曙红B染色法和钙离子载体A23187诱导精子顶体反应法的活力检测值与样品理论值呈显著正相关(P<0.01),他们二者之间亦呈显著正相关(P<0.01),说明这两种方法均可用于精子活力检测,其结果具有可比性.     

基于图像识别技术研究不同海区三疣梭子蟹甲壳白色斑纹特征及蜕壳前后斑纹特征的变化

为进行三疣梭子蟹外观特征的研究,本研究通过计算机视觉技术建立三疣梭子蟹背部白色斑纹评估方法,经人工对比验证其准确性达100%。在此基础上,对来自海域的30只三疣梭子蟹[平均体质量(2.8±0.56)g]进行跟踪观察,发现蜕壳前后白色斑纹数量和位置保持不变,而白色斑纹面积和斑纹区域面积则会随着蜕壳后蟹壳面积的增加而扩大;蜕壳后,白色斑纹面积增加89.33%±8.61%,斑纹区域面积增加90.51%±7.95%,蟹壳面积增加94.66%±8.26%,均显著正相关。为进一步研究不同海区梭子蟹白色斑纹分布特征,对来自朝鲜、中国辽宁和浙江等不同海区的三疣梭子蟹进行白色斑纹个数(N)、白色斑纹面积(S1)、斑纹区域面积(S2)、白色斑纹面积百分比(R1)、斑纹区域面积百分比(R2)和密度(D)等6项参数分析,结果发现,不同海区三疣梭子蟹斑纹性状存在显著特点,朝鲜海区呈现斑纹小、分布面积少、占蟹壳总面积比例低的特点;辽宁海区呈现斑纹小、分布面积多、占蟹壳总面积比例高的特点;浙江海区呈现斑纹大、分布面积少、占蟹壳总面积比例低的特点。本研究将计算机视觉技术应用于水产养殖研究,通过建立评估参数阐明三疣梭子蟹白色斑纹的生长规律,揭示了不同群体的三疣梭子蟹白色斑纹具有地理多样性的特征。     

池塘养殖三疣梭子蟹的生长规律

为探讨池塘养殖三疣梭子蟹的生长规律和雌雄差异，本研究对1～6月龄池塘养殖三疣梭子蟹各生长指标进行了比较分析，并采用Logistic模型分别拟合三疣梭子蟹的体重(BW)、体长(BL)、体高(BH)、全甲宽(FCW)、甲宽(CW)、大螯长节长(MLC)、大螯不动指长(FFLC)、第一步足长节长(MLFP)等8个形态性状的生长特征。结果显示，三疣梭子蟹雌性和雄性的生长存在差异，早期雄性生长较快，后期雌性生长较快，而雌雄混合分析介于二者之间。三疣梭子蟹各生长性状的Logistic模型拟合结果显示，除雌性MLC和MLFP以及雌雄混合分析的MLFP之外，其余性状R²均达到0.990以上；雌性和雄性体质量的极限生长值分别为290.27和195.91g，快速生长区间分别为2.74～5.10月龄和2.33～4.14月龄，拐点分别为3.92和3.24月龄。研究表明，三疣梭子蟹的生长过程均符合“慢-快-慢”的特征，雄性比雌性更早进入快速生长期，但是快速生长期的持续时间不及雌性。本研究对三疣梭子蟹不同生长指标的规律特征，以及各指标在混合养殖条件下雌性和雄性的优势阶段进行了研究，为实现三疣...