林麝生长激素基因的克隆与生物信息学分析

了解林麝生长激素（GH）基因序列结构特点,为进一步研究GH基因的结构功能遗传变异规律及其与生长性能的关系提供科学依据。根据GenBank上已公布的绵羊全基因组GH基因序列设计合成4对特异性引物,以林麝基因组DNA为模板进行PCR扩增,将所获得的序列拼接,获得林麝GH基因CDS区序列,采用ExPASy等分子生物学工具对林麝GH蛋白的理化性质、二级结构、蛋白功能等进行预测。结果表明,林麝GH基因CDS区全长657 bp（GenBank登录序列号为KU296865）,编码218个氨基酸。α-螺旋结构和卷曲结构构成了林麝GH蛋白二级结构的骨架,为跨膜蛋白,同时第1~26位氨基酸为信号肽,第27~218位氨基酸残基为生长激素结构域。进化分析结果表明,林麝与羊的关系最为接近,在分子水平上符合物种进化理论。本研究成功克隆了林麝GH基因CDS区序列,其序列保守性强,为下一步林麝GH基因的表达调控、进化和多态性分析奠定了基础。     

德保矮马遗传资源的保护与利用

从德保矮马的起源进化、遗传特征及保护利用等方面进行阐述,为德保矮马遗传资源保护、利用提供理论参考。     

广西德保猪抵抗素基因的克隆与分析

[目的]克隆广西德保猪抵抗素（Resistin,RENT）基因并进行系统生物信息学分析,阐明德保猪脂肪细胞分化与脂肪生成的分子机制.[方法]根据NCBI已公布的猪RENT基因序列（NM 213783.2）设计特异性引物,以从德保猪血液中提取的总RNA为模板,PCR扩增RENT基因序列,T-A克隆至pEASY-T1载体后进行测序分析,并将所得测序结果用BLAST程序、MEGA 5.0软件、EXPASY服务器、SMART程序、SignIP程序、Softberry服务器和DNASTAR软件进行生物信息学分析.[结果]扩增获得468 bp的RENT基因序列片段,包含全长的德保猪RENT基因编码区和部分非编码区序列.多重序列比较分析结果显示,德保猪RENT基因编码区核酸序列与猪、牛、山羊、绵羊、人、兔、猕猴和豚鼠的同源性分别为100.0％、85.5％、85.5％、84.5％、81.2％、80.3％、80.0％和77.3％.德保猪RENT蛋白结构预测结果显示,其理论分子质量11.69 ku,等电点7.82,为弱碱性蛋白;N-末端存在信号肽,定位于胞质外,仅具有1个低复杂度结构域,包含1个α-螺旋、8个β-折叠、7个T-转角及两个无规则卷曲.[结论]RENT基因在德保猪中呈高度保守特征,是其脂肪细胞分化中的重要调控基因.     

驴生长激素基因的克隆与分析

 【目的】克隆驴生长激素基因DNA和cDNA的全序列,分析其序列和cDNA编码的蛋白序列特征及其在不同物种中的遗传差异。【方法】根据不同物种同一基因序列的同源性比对结果设计引物,应用RT-PCR和PCR 技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的DNA和cDNA及推定的氨基酸序列进行分析。【结果】从驴肝组织和血液中分别得到驴GH基因全序列1 928 bp和包括完整的编码区的cDNA序列706 bp,两者序列比对后证明驴GH基因DNA序列由5个外显子和4个内含子组成,编码216个氨基酸的GH前体蛋白,其中包括26个氨基酸的信号肽和190个氨基酸的成熟肽。序列比较结果表明,驴GH基因的序列与马同源性最高,启动子不是哺乳动物的典型TATA盒,而是CATA盒,该基因在进化过程中是保守的。【结论】从驴肝组织和血液中克隆了GH基因DNA和cDNA,DNA序列在1 267位的C→G可能影响到驴和马生长发育的差异,为下一步驴GH基因的表达调控、进化和多态性分析奠定了基础。     

唐鱼生长激素基因的克隆及序列分析

[目的]为开展唐鱼转自源基因研究提供基本构架。[方法]采用RT-PCR和RACE技术分离唐鱼生长激素基因(GH)全长cD-NA序列,同时利用PCR克隆了唐鱼生长激素基因的基因组(gDNA)序列。[结果]序列分析表明:唐鱼GH cDNA的5非编码区为64bp,3非编码区为448 bp,开放阅读框(ORF)633 bp,共编码210个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。应用MEGA 3.1软件进行序列同源性比较分析的结果显示,唐鱼GH cDNA所编码的氨基酸序列与近缘鱼种(草鱼、青鱼、鳙鱼、鲤鱼、斑马鱼等)的生长激素氨基酸序列有很高的同源性,其中与草鱼和鳙鱼的同源性高达98%。该研究获得的唐鱼生长激素基因的gDNA序列共有1403 bp,包括4个外显子和3个内含子,外显子大小分别150、117、162、204 bp;3个内含子都以GT开头、AG结尾,符合GT-AG法则。[结论]该研究为下一步构建自源GH基因构件,进行唐鱼的转自源GH基因研究,培育出生长快、体型大的唐鱼新品系奠定了基础。     

水貂生长激素cDNA的克隆与序列分析

从水貂脑垂体中分离提取总RNA，经过RT—PCR分别扩增出水貂生长激素前体肽和成熟肽cDNA。PCR产物经凝胶回收纯化，克隆到栽体pGEM—T，然后转化感受态细胞DH5α。在含X—gal、IPTG的LB(Amp^ )平板上筛选阳性克隆，提取质粒作限制性酶切鉴定后，对目的片段进行测序。结果表明，RT—PCR扩增出的2个cDNA片段碱基数分别为713bp和780bp，用DNAsis2．5软件进行分析表明，此扩增序列与GenBank中发表的水貂生长激素cDNA100％相同。前体肽编码区由651bp组成，编码216个氨基酸，包括长度为29个氨基酸的信号肽；成熟肽的开放阅读框全长564bp，编码187个氨基酸，分子量约为21kDa。通过Blast比对，分析了与人、马、牛、猪、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠生长激素核苷酸序列的同源性。     

猪IRGC基因的克隆与序列分析

[目的]对猪IRGC基因进行序列分析,为进一步研究其功能奠定基础。[方法]采用EST信息和测序相结合的方法分离了猪IR-GC基因,并与人、牛、犬和猩猩IRGC基因进行序列相似性分析。[结果]获得了1 558 bp的cDNA序列,其登录号为EU703776,与人、牛、犬和猩猩IRGC基因的序列分别有86%、90%、91%和84%的相似性。序列分析表明,该基因编码的464个氨基酸与人、牛、犬和猩猩的相似性分别达到了90%、93%、95%和90%。[结论]成功提取了猪IRGC基因,其具有人、牛、犬和猩猩类似的结构和功能。     

牛生长激素cDNA的克隆与序列分析

从平脑垂体中分离总ＲＮＡ，经ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）一纤维素柱纯化ｍＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，经ＰＣＲ技术扩增牛生长激素（ｂＧＨ）ｃＤＮＡ序列，长度为６２０ｈｐ，将ＰＣＲ产物克隆于ｐＵＣ１９Ｓｍａｌ位Ⅰ点转化大肠杆菌ＤＨ５α，经蓝白斑筛选，获得重组克隆，分离重组质粒，经限制性内切酶酶切分析后，进行序列分析。结果表明，一质粒中所含克隆片段为ｂＧＨｃＤＮＡ全序列，与国外所发表的ｂＧＨ核旮酸序列基本相同     

四棱豆纤维连接蛋白基因部分序列克隆与分析

利用已报道的FNDC基因序列的保守区域设计引物,用所设计的引物扩增四棱豆FNDC基因的部分序列,将序列提交GenBank,获1个登录号FJ176925.通过对该序列的同源性比较分析发现,该序列与目前数据库中山豆根YP_001511236序列具有明显的同源性.该序列在112～651 bp片段上包括了1个开放性阅读框,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA.将ORF处的氨基酸序列继续进行生物信息学的分析,对其进行的1级结构分析和2级结构分析中,表明该序列是一个酸性蛋白,亲水性较弱,疏水性较强,信号肽序列为第23位～第45位,亚细胞定位最大可能性为定位于细胞外.含有N型糖基化位点,蛋白激酶C磷酸化位点,酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,C-末端锚定微体信号,纤维素结合结构域.主要以α-螺旋,不规则盘绕和延伸链为该蛋白最大量的结构元件,β-折叠散布于整个蛋白质中.     

番鸭IFN-α基因的克隆与序列分析

从经免疫的番鸭外周血分离淋巴细胞，经PHA刺激培养后提取总RNA，采用RT－PCR的方法，按照GenBank中序列号为X84764鸭I型IFN（DIFN1）基因设计引物，成功扩增出番鸭IFN基因，命名为MDIFN－α，包含编码MDIFN－α成熟蛋白全部核苷酸序列。DIFN1开放阅读框架（ORF）有576个核苷酸，编码191个氨基酸，其中切除信号肽的IFN－α为成熟DIFN1，共有486个核苷酸组成，编码161个氨基酸。MDIFN－α（含有不完整的信号肽）与X84764的核苷酸同源性为97．7％，推导氨基酸同源性为95．7％，结果显示，MDIFN－α可能为鸭I型IFN一个新的亚型。     

柔嫩艾美耳球虫杂交株MIC2基因克隆及序列分析

根据柔嫩艾美耳球虫子孢子微线蛋白2的cDNA序列,利用计算机设计l对引物,以柔嫩艾美耳球虫杂交株子孢子总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出1个片段。把这个片段克隆到pMD18-T载体,经酶切鉴定得到1个阳性克隆,测序及序列分析结果表明该片段为MIC2基因,开发阅读框（0RF）与E．tenella豪顿株MIC2核苷酸同源性为99.51％,推导的氨基酸序列同源性为99.12％,说明MIC2基因高度保守。     

华南地区新城疫病毒WS_(99)株HN基因片断的克隆和序列分析

用RT -PCR一步法扩增了华南地区野毒NDVWS99株的HN基因 890bp片断 ,并对其进行克隆、核苷酸测序及同源性分析 结果表明 :WS99株的HN基因与其他 2 9株NDV的核苷酸同源性在 88.0 %～ 99.8%之间 ,氨基酸同源性在 90 %～ 97%之间 鸡源NDVWS99株与鹅源副粘病毒GPMV株有极高的同源性 ,高达 99.8% 该毒株与TEX/ 48和B1/ 47一样 ,在HN基因 130 1bp处由G突变为A ,对应氨基酸由V突变为I,但其半胱氨酸位点和个数没有改变 ,且所克隆的目的片段中含有HN基因上 5个凝血抗原位点其中的 4个     

海南黑山羊生长激素（GH）基因单核苷酸多态性分析

利用PCR-SSCP与测序相结合,分析海南黑山羊GH基因第2外显子exon2的多态性,SSCP结果出现3种基因型,分别定义为AA、AB、BB;3种基因型频率分别为28．3％、63．0％、8．7％,A、B等位基因频率分别为59．8％和40．2％,以A等位基因为优势基因,经Hardy-Weinberg平衡卡方适合性检验结果表明,exon2在此群体中处于Hardy-Weinberg不平衡状态（X2=0．000,P〈0．01）,该位点群体遗传结构及多态指标分析结果显示,该位点表现为中度多态。AA和BB基因型进行测序结果发现,exon2第11位点发生G→C突变,将核苷酸序列翻译成氨基酸序列进行同源性比较,结果exon2第11位G→C突变位点引起编码的氨基酸改变,所编码的氨基酸由原来的精氨酸变为脯氨酸。     

猪A组轮状病毒Vp4全基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR技术，从猪A组轮状病毒总RNA中扩增了2331bp的Vp4全基因，通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆至克隆载体pCEM-T中，转化至受体菌株JM109中，通过质粒提取、限制性内切酶酶切、PCR、序列测定等方法鉴定，构建出重组阳性克隆质粒pCEM-T-Vp4。经DNASTAR软件分析核苷酸和氨基酸序列，结果显示该实验株与黑龙江株和美国株的同源性最高，均达到99％以上，并具有轮状病毒Vp4全基因的抗原表位区。     

鸡PTH基因克隆、序列测定及其真核表达质粒的构建

采集200日龄产蛋期新扬州鸡甲状旁腺组织,提取RNA并进行反转录聚合酶链反应（RT—PCR）,扩增产物进行T—A克隆、测序。序列测定结果表明：胛HcDNA核苷酸长度为360bp。与GenBank上发表的鸡序列比较,核苷酸同源性为99．6％,在第159位处存在C→A的有意义突变。与从GenBank下载读取的牛、马、人、狗、猫、食蟹猴PTH基因序列进行比较分析,同源性分别为51．4％、50.8％、50．6％、50.3％、50．3％和46．9％。将该基因片段克隆到真核表达载体pCEP4,构建重组质粒pCEP4-PTH,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为利用pCEP4-PTH调控机体钙代谢、改善蛋鸡生产性能和蛋壳质量的研究应用奠定了基础。     

暗纹东方鲀生长激素基因克隆与同源性分析

克隆获得暗纹东方鲀GH基因,该基因包含6个外显子和5个内含子,在此基础上获得其cDNA序列,共有591bp,编码196个氨基酸。将该cDNA序列转换成蛋白质序列后,结合NCBI数据库中得到的其它24种脊椎动物生长激素基因的蛋白质序列,运用MEGA3.1,以UPGMA法构建东方鲀等25种脊椎动物的生长激素基因进化树,14种鱼类中除了鳗鲡和鳝鱼外聚为一大类,其它动物中哺乳动物、反刍动物、家禽、爬行动物、人以及鳗鲡等聚为另一大类,暗纹东方鲀与红鳍东方鲀生长激素基因的氨基酸同源性达到100%,与斗鱼、杜父鱼、金鲈生长激素基因的氨基酸同源性达到70%以上,与人的生长激素基因的氨基酸同源性也达到40%;斑马鱼、草鱼、鲋鱼以及鲤鱼之间生长激素基因的氨基酸同源性在85%以上;哺乳动物、反刍动物、家禽的生长激素基因的氨基酸同源性在90%左右。从进化树的结果来看,与传统分类学研究结果基本一致,为进一步研究GH基因在胚胎发育及个体生长中的功能奠定基础。     

寿光鸡MSTN基因3种不同转录子的克隆及序列分析

采集1日龄寿光鸡腿肌,提取RNA进行RT-PCR反应、TA克隆和测序,序列测定结果表明：寿光鸡腿肌中存在3种不同大小的MSTNcDNA。第1种MS刑cDNA由1128bp组成,将该序列命名为csMSTN-1,与已报道的鸡MSTNcDNA序列（gb：AF019621．1）同源性为99％;第2种MS孙cDNA由985bp组成,命名为CSMSTN-2．与csMSTN-1相比,缺失了374～517处的143个碱基,并且在6处存在碱基变化;第3种MSTNcDNA由754bp组成,命名为csMSTN-3,与csMSTN-1相比,缺失了374～748处的374个碱基,并且存在26处碱基变化。这是世界上首次发现鸡体内存在3种不同大小的MSTN基因转录子．该结果为进一步确定MSTN基因的作用机理提供了新的试验依据。     

鹅细小病毒四平分离株VP3基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)核苷酸序列,设计并合成了1对引物,对吉林农业大学预防兽医学研究室分离鉴定的GPV四平株(SP)主要保护性抗原蛋白VP3基因进行扩增。所得到的PCR产物片段大小约1.6 kb,与预期片段大小相符。将该片段纯化后与T载体连接,转化到感受态大肠杆菌JM-109中进行克隆。对所提质粒进行快速鉴定、PCR鉴定以及限制性内切酶NheⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒,对重组质粒测序并进行核苷酸序列分析。结果表明:GPV四平株VP3基因长1 605 nt,包含了完整编码GPV VP3蛋白阅读框,且与国内GPV分离株B,GD,HG5/82相应核苷酸序列和氨基酸序列的同源性较高,分别为96.2%,96.3%,96.4%和97.4%,98.7%,98.9%。据此认为,GPV四平株VP3基因可以作为构建具有普遍应用价值的基因工程疫苗的候选基因。