茭白线粒体蛋白双向电泳体系建立

[目的]建立适合于茭白线粒体蛋白质组分析的双向电泳技术体系,为进一步开展茭白线粒体差异蛋白质组学研究提供参考.[方法]以茭白为试验材料,比较不同线粒体提取纯化方法、IPG胶条pH范围及蛋白上样量等条件对双向电泳图谱的影响.[结果]差速离心(3000~14000×g)联合Percoll不连续密度梯度离心(20%∶24%∶40%=2∶4∶2)对茭白线粒体的提取纯化效果优于仅采用差速离心.采用改良酚抽法提取茭白线粒体蛋白,17 cm、pH 3~10的IPG胶条,1.0 mg上样量,12% SDS-PAGE进行双向电泳,0.12%考马斯亮蓝G-250胶体考染法染色,茭白线粒体蛋白主要分布在pH 4~8范围内,pH 3~4和pH 8~10范围内蛋白点较少;进一步选用pH 4~7和pH 5~8的IPG胶条对茭白线粒体蛋白进行双向电泳,分离效果均明显提高,且pH 4~7范围内IPG胶条的双向电泳图谱清晰,蛋白点分辨率较高.分别采用0.8、1.0和1.2 mg 3个不同的上样量进行双向电泳,结果表明上样量为1.0 mg时,电泳图谱质量最好.[结论]通过差速离心联合Percoll不连续密度梯度离心提取纯化茭白线粒体,并控制好双向电泳体系的pH范围、上样量等因素,可获得蛋白质点清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱.     

旱柳根系蛋白质双向电泳体系的建立

林木抗逆机制的研究是林木抗逆育种的重要基础。为了解旱柳Salix matsudana 耐盐机制,实验采用蛋白质双向电泳技术研究盐碱胁迫前后旱柳蛋白表达变化,分离鉴定旱柳耐盐相关基因,建立一套适合于旱柳根系蛋白质的双向电泳技术体系是蛋白质组学的基础。用改进的酚抽法抽提旱柳根总蛋白,此方法不仅能很好地分离蛋白,而且能有效去除样品中的盐分。通过比较分析了双向电泳不同条件对电泳结果的影响,确立了900 μg·胶条^-1的最佳上样量,10 min平衡时间以及10万 V·h 的聚焦时间的双向电泳条件。还比较了氯化钠胁迫后双向电泳图谱差异,发现了39个差异表达蛋白,其中15个下调,24个上调（11个新诱导表达）,为下一步通过质谱鉴定分析旱柳耐盐分子机制及抗性基因分离奠定了基础。图9参23     

双向电泳技术在植物应答非生物胁迫蛋白质组学研究中的应用

介绍了双向电泳技术（2-DE）的基本概况及其在植物应答非生物胁迫蛋白质组学研究中的应用,并对今后的发展进行了展望。     

锥栗果实双向电泳体系的建立

通过对传统双向电泳技术进行改进和优化,包括对锥栗果实蛋白不同提取方法的优化和不同pH值范围IPG胶条的比较等,以建立适于锥栗果实蛋白质组分析的双向电泳方法.结果表明,使用裂解液直接提取蛋白的方法所获得的双向电泳图谱稳定性和重复性较好,分辨率较高,经银染后可分辨出400多个蛋白点,其等电点主要分布于pH 4-7.     

桔小实蝇蛋白质双向电泳体系的建立及在口岸检疫中的运用前景分析

通过蛋白样品、上样量、聚焦时间、重复性等多个方面的优化,建立了桔小实蝇蛋白质双向电泳技术体系,并分析了双向电泳技术在口岸检疫中的运用前景.结果显示使用bio-rad公司的Readyprep 2-D净化试剂盒可以使图谱质量提高;上样量采用300μg,等电聚焦时间60 000VH最佳,可以用于后续的蛋白质组学研究.而利用双向电泳技术对检疫性病虫害、医学媒介生物进行分类鉴定,是一种准确性高、重复性好、不限制于样本形态的方法,极大地扩充了生物的分类鉴定技术.随着技术的进一步提高,双向电泳将在口岸检疫性病虫害和医学媒介生物的鉴定中发挥更大的作用.     

棉花纤维蛋白双向电泳体系的建立

[目的]探索一套适合于棉花纤维蛋白的双向电泳技术,为研究棉花纤维发育的蛋白质组学奠定基础.[方法]以陆地棉徐州142为材料,比较了三种不同蛋白质提取方法以及不同裂解液组成对双向电泳的影响,并在蛋白上样量和染色方法等方面进行了探索与优化.[结果]利用饱和酚-甲醇醋酸铵法提取的棉花纤维蛋白,其蛋白含量较高,且SDS-PAGE电泳条带清晰;样品溶解于含有硫脲和CHAPS的裂解液中,其蛋白溶解度增加;不同的蛋白上样量比较结果表明,第一向等电聚焦固相pH梯度胶条(7 cm)的最适上样量为300 μg;同时,经改良后的考马斯亮蓝染-脱色后,2-D图谱的背景清晰,分辨蛋白斑点数增加.[结论]研究建立了一套适用于棉花纤维蛋白总蛋白质组分析的双向电泳方法.     

油茶种仁蛋白双向电泳体系的建立

以普通油茶优良无性系‘闽43’成熟种仁为材料,从样品制备、IEF聚焦程序参数设定、SDS-PAGE凝胶浓度3个方面优化油茶种仁双向电泳体系。结果表明:采用TCA丙酮+SDS酚抽法提取油茶种仁蛋白能够得到更多较为清晰的蛋白点;采用62 000 V·h的高压进行等电聚焦更适合油茶种仁蛋白的第一向分离;10%SDS凝胶浓度更适合油茶种仁蛋白的双向分离,试验结果为深入开展油茶种仁蛋白质组学的研究奠定基础。     

木本植物叶片蛋白质双向电泳技术体系的建立

以2种木本植物的成熟叶片为材料,对传统的双向电泳进行改进和优化,得到1种适合于木本植物叶片蛋白质电泳分析的方法,此方法大大降低了木本植物叶片中次生代谢物质对双向电泳结果的干扰,明显改善了分析效果。     

牛支原体蛋白质组学双向电泳技术的建立及初步分析

为了建立M.bovis蛋白质组学技术,试验采用M.bovis湖北分离株为实验材料,对样品处理、固相pH梯度胶条、上样量及染色等影响双向电泳图谱质量的关键因素与环节进行一系列的探索,2D Clean-up试剂盒处理的样品400 μg在13 cm干胶条(pH 4～7)中进行双向凝胶电泳,考马斯亮蓝R350染色的方法,结果获得了能较好展示大部分蛋白点,分辨率及重复性均很好的双向电泳图谱,应用Image Master 2D Platinum version 6.0软件对图谱进行初步分析,不同重复图谱之间的平均匹配率达80.95％,随机取重复性好的20个蛋白点进行质谱分析,获得19蛋白质点的肽质量指纹图谱,鉴定成功率为95％.质谱鉴定结果与自建M.bovis蛋白库对比,蛋白点匹配率高于82分值限值(P＜0.05)的不同蛋白有12个,初步分析这些蛋白多为酶类.说明该技术平台能有效用于M.bovis蛋白质组学的后续研究之中.     

双向电泳技术在植物蛋白质组研究中的应用

双向电泳技术是获得细胞、组织或器官等蛋白表达图谱的主要手段,是蛋白质组学研究的核心技术之一。综述了双向电泳技术的原理、主要操作方法及其在植物蛋白质组研究中的应用。     

黄瓜叶片细胞壁蛋白双向电泳体系的建立

【目的】建立一套适合黄瓜叶片细胞壁蛋白质组学研究的双向电泳体系,为黄瓜细胞壁蛋白质组学的后续研究奠定基础。【方法】以黄瓜品种"长春密刺"幼苗叶片为材料,比较2种不同提取介质(CaCl2和LiCl溶液)对细胞壁蛋白的提取效果,对比IPG胶条梯度、裂解液、上样量及等电聚焦程序对黄瓜叶片细胞壁蛋白双向电泳结果的影响。【结果】以0.2mol/L CaCl2和3mol/L LiCl溶液依次提取黄瓜叶片细胞壁蛋白,选用17cm pH 3~10NL IPG胶条和裂解液Ⅱ(7mol/L尿素、2mol/L硫脲、40g/L CHAPS、10g/L DTT和1mmol/L PMSF),上样量800μg,按聚焦程序Ⅰ(20℃水化14h,100V30min,250V30min,500V30min,1 000V1h,线性升压5h至10 000V,10 000V聚焦6.5h)聚焦后进行双向电泳分离和考马斯亮蓝G-250染色,可获得重复性好、分辨率高的双向电泳图谱。【结论】建立并优化了适合于黄瓜叶片细胞壁蛋白质组学分析的双向电泳体系。     

利用双向电泳分析烯丙异噻唑诱导后水稻的蛋白质变化

本研究应用双向电泳(2-DE)技术分析了烯丙异噻唑诱导后水稻蛋白质的差异表达,所得的双向电泳图谱用PDQuest8.0.1软件进行分析,在诱导4d的双向电泳图谱上找到了10个差异表达蛋白质点,选取其中3个进行质谱(MALDI-TOF-MS)分析,将所得肽段序列在数据库搜索比对后,找到了相匹配的蛋白,它们分别具有泛醌-细胞色素C还原酶、苏氨酸肽链内切酶和苹果酸脱氢酶活性。这些蛋白可能通过提高植物的呼吸作用和启动泛肽依赖性的蛋白质降解途径的活化来参与植物的诱导抗病机制。     

适用于毛白杨芽双向电泳分析的蛋白质提取方法

本实验以毛白杨芽为实验材料,采用Tris鄄酚法、三氯乙酸/ 丙酮法和三氯乙酸/ 丙酮+ Tris鄄酚法对其蛋白质提 取方法进行比较,采用双向电泳分离蛋白质,通过PDQuest 软件和质谱对这3 种提取方法得到的双向电泳胶进行分 析。结果显示,三氯乙酸/ 丙酮法得到的蛋白点数量为231 ±4,得到的鲜样中的总蛋白质含量为(3.57 ±0.618) mg/ g,均高于其他两种提取方法,并且所得到的双向电泳胶更清晰,为毛白杨芽蛋白质提取的最适方法。      

Proteomic Analysis of Wheat Seed in Response to Drought Stress

Drought stress is one of the major factors affecting in wheat yield and grain quality. In order to investigate how drought stress might influence wheat quality during grain filling, three wheat cultivars Gaocheng 8901, Jagger and Nongda 3406 were subjected to drought stress during the grain filling stage. Neither globulin and glutenin, nor the relative percentage ofamylose significantly changed following drought treatments, whereas albumin and gliadin concentrations did. The SDS-sedimentation, which has a strong linear correlation with wheat baking quality was markedly decreased following drought stress. These results indicated that drought had an adverse effect on wheat qualit3,. In order to investigate the protein complexes in the wheat flour, the data from native PAGE and SDS-PAGE were combined and a total of 14 spots were successfully identified, and of these eight protein types were determined to be potential complex forming proteins.     

红海榄根部总蛋白质提取方法的改进和双向电泳体系的建立

分别采用TCA-丙酮沉淀法、酚法、尿素法、周涵韬法和笔者建立的酚改良法,提取红海榄根部总蛋白质,并进行了SDS-PAGE分析和双向电泳体系的优化.结果表明,酚改良法提取红海榄根部总蛋白质的纯度最高,质量最好,为建立双向电泳分析体系提供了较为理想的蛋白样品,获得了良好的双向电泳图谱.该结果为盐生植物,尤其是盐生木本植物,建立了一套可靠的蛋白提取和双向电泳方法.     

利用双向电泳技术分离节瓜叶片总蛋白的方法研究

【目的】建立适合节瓜叶片蛋白质组学研究的双向电泳体系.【方法】以节瓜品种"A37毛节瓜"为材料,对蛋白质抽提方法、上样量、凝胶浓度及IPG胶条pH范围等关键因素进行探索与优化.【结果和结论】与TCA/丙酮沉淀法及酚提取法相比,改良酚提取法抽提蛋白质总量较高,纯度最高,SDS-PAGE电泳条带明显、清晰,双向电泳图谱蛋白质点最多、清晰均匀、纵横条纹少.利用17 cm pH 4~7范围IPG胶条、120μg蛋白质上样量、12%凝胶浓度,硝酸银染色获得蛋白质点数丰富、分辨率高、背景清晰且重复性好的双向电泳图谱,检测到节瓜叶片蛋白质点1 936个,相对分子质量主要分布于15 000~100 000之间.初步建立了一套适用于节瓜叶片蛋白质组学研究的双向电泳体系,为后续开展蛋白质组学研究及其相关工作奠定了基础.     

壳聚糖诱导下浅玫瑰色链霉菌菌体蛋白差异表达分析

建立了有效分析浅玫瑰色链霉菌菌体全蛋白质的方法,使用分离范围为p H 4~7的IPG胶条、2D clean-up试剂盒法纯化方法、80μg蛋白质上样量和银染的双向电泳技术,获得了低背景、高分辨率和重复率、无明显条纹的浅玫瑰色链霉菌全蛋白质双向电泳图谱。通过Image Master2D Platinum7.0软件对壳聚糖诱导条件下浅玫瑰色链霉菌菌体总蛋白质的电泳图谱进行匹配分析,在诱导菌株图谱上有723±14个清晰可见的蛋白质点可供差异分析。与未诱导菌株的双向电泳图谱对比结果显示:18个蛋白质点在诱导菌株中差异表达,其中14个蛋白质点的表达量上调,4个蛋白质点的表达量下调,选取10个差异表达量在5倍以上的蛋白质点进行质谱鉴定,结果显示,延长因子Tu、RNA聚合酶、分子伴侣等蛋白在壳聚糖诱导下表达量增加,表明它们在浅玫瑰色链霉菌代谢壳聚糖的过程中起重要作用。     

差异蛋白质组学及其在植物盐胁迫响应研究中的应用

随着蛋白质组学技术的发展,差异蛋白质组学的研究已引起国内外学者的广泛关注。介绍了植物差异蛋白质组学的产生背景及在凝胶和非凝胶技术方面的最新技术方法,植物差异蛋白质组学近年来正从定性向精确定量的方向发展。综述了差异蛋白质组学在植物盐胁迫响应研究中的最新进展,指出了差异蛋白质组学在植物盐胁迫响应研究中依然存在着过多地依赖于双向电泳-质谱（2DE-MS）技术,研究对象不多,不能有效分离相关蛋白质,差异蛋白质丰度分析不精确等问题。最后,提出将差异蛋白质组学和基因组学技术相结合来研究植物盐胁迫响应,从分子水平上系统诠释植物耐盐机制是今后研究的方向。参33