γ-干扰素ELISA检测方法在广西牛结核病流行病学调查中的应用

【目的】摸清广西水牛及奶牛结核病的流行情况,为制定净化广西牛结核病防制策略提供参考。【方法】2008～2011年采用皮内变态反应和γ-干扰素ELISA检测方法联合对广西奶牛及水牛开展结核病流行病学调查,共检疫5478头奶牛和1580头奶水牛。【结果】2008～2011年从广西南宁、柳州、北海、钦州、桂林等市累积检测出皮内变态反应阳性奶牛63头、水牛17头,阳性检出率分别为1.15％和1.08％,总体上广西奶牛及水牛结核病阳性率呈现逐年降低的趋势。通过采用自制水γ－干扰素EusA检测试剂盒和Bovigam牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测试剂盒对牛结核病进行检测,发现γ-干扰素ELISA检测的牛结核病阳性率低于皮内变态反应,且准确度高。【结论】对牛群进行结核病检测时,先以变态反应检疫牛群,再结合γ-干扰素ELISA检测进行综合判断,更有利于牛结核病的检测与净化。     

牛结核γ-干扰素ELISPOT方法在奶牛结核病检疫的应用

本研究通过建立牛结核γ-干扰素ELISPOT检测方法,同步检测颈部皮内变态反应(SICT)阳性牛.结果表明,该牛结核γ-干扰素ELISPOT检测体系较为稳定,为后续研究者基于ELISPOT技术建立更多稳定的检测体系提供了重要的理论依据.     

梅花鹿γ-干扰素在牛型结核病中的应用研究进展

梅花鹿γ-干扰素是细胞因子超家族中干扰素家族的特殊重要成员之一,具有广泛的生物学功能。其功能的多样性是通过诱导细胞表达多种蛋白质实现的。对梅花鹿γ-干扰素的诱导与产生、结核病特异性基因、梅花鹿γ-干扰素用于牛型结核病的检测原理及γ-干扰素优劣的研究进展进行综述。     

ELISA方法在牛结核病诊断的应用

牛结核病主要是由牛分枝杆菌引起的一种人兽共患传染病，给奶牛养殖业和人类健康带来巨大危害。目前，牛结核病的诊断方法多种多样，本文综述了该病的ELISA诊断方法的特点及应用进展，并对该方法的应用进行展望。     

ELISA方法在牛结核病诊断的应用

牛结核病主要是由牛分枝杆菌引起的一种人兽共患传染病,给奶牛养殖业和人类健康带来巨大危害。目前,牛结核病的诊断方法多种多样,本文综述了该病的ELISA诊断方法的特点及应用进展,并对该方法的应用进行展望。     

鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的表达

构建鸡γ-干扰素基因(lFN-γ)的融合表达质粒,并在原核系统表达。根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,使用prim er5设计一对特异性引物,通过RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆出鸡γ-干扰素基因并对其进行测序。测序结果表明,鸡γ-干扰素基因全长495bp,具有一个完整的开放阅读框,编码164个氨基酸,与国外发表的序列同源性为100%。将序列连接到原核表达载体pET28 a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明鸡γ-干扰素表达蛋白大小为20.8KD,并以包涵体形式表达。为鸡γ-干扰素生物制剂或疫苗佐剂的开发奠定基础。     

牛干扰素-γ基因的克隆与真核表达载体的构建

根据Genebank中已发表的INF-γ蛋白cDNA序列保守区设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术从Con A活化的牛外周血单核细胞中扩增到编码牛INF-γ蛋白基因,其大小为510 bp左右。将该基因克隆到pMD18-T载体中,测序结果与Genebank上发表的INF-γ基因序列进行比较,其同源性为99.8%。将该基因从重组pMD18T-IFN质粒中克隆到表达载体pcDNA3.1(+)质粒中,构建真核表达重组质粒,经酶切和PCR鉴定后表明构建的重组质粒为阳性。     

鸡γ-干扰素的可溶性表达及纯化产物的抗NDV活性

将鸡γ-干扰素(chIFN-γ)基因先克隆,接着通过大肠杆菌表达后进行产物纯化与活性检测.通过PCR方法以带有信号肽的重组质粒PMD-18T-preIFN-γ为模板,扩增无信号肤chIFN-γ基因片段,克隆至原核表达载体pProEXTM HTa,构建重组表达质粒pProEXTM HTa-chIFN-γ,在大肠杆菌BL2...     

γ-干扰素受体在山羊颈前神经节的表达

旨在探索山羊颈前神经节是否具备接受γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)作用的条件,是否有IFN-γ受体(interferon-γreceptor,IFNGR)的存在,进而明确神经调节与免疫调节之间的关系。分别取雌雄成年山羊颈前神经节各5对,用免疫组化SP法和PCR方法检测IFNGR在颈前神经节的表达情况。结果表明,在山羊颈前神经节的神经元、卫星细胞和神经纤维均有IFNGR免疫阳性产物分布,但主要分布于神经元胞体,IFNGR在神经元胞体的相对表达量显著高于非神经细胞结构(P0.05)。在山羊颈前神经节扩增到IFNGR1基因的cDNA片段全长376bp,与绵羊、牛、野猪、家兔、褐家鼠IFNGR1基因同源性分别为98%、97%、84%、73%、66%。在山羊颈前神经节中IFNGR主要在交感节后神经元表达与分布,具备对IFN-γ刺激做出反应的条件,提示山羊颈前神经节可能作为IFN-γ对靶器官免疫内分泌调节途径和自主神经对靶器官调节的神经途径之间相互协调的关键点。     

鸡γ-干扰素基因的克隆与原核表达

应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,通过一对自行设计的引物,从经ConA诱导活化的鸡脾淋巴细胞的RNA中扩增出一特异性基因片段,其大小约为500 bp.该片段经酶切和测序鉴定为鸡IFN-γ基因.将其插入原核表达载体pGEX-4T-1, 并导入大肠杆菌BL21细胞中,经IPTG诱导培养,获得分子量约为43 000的蛋白带,表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到表达.     

鸡γ-干扰素的克隆·表达和序列分析

[目的]为鸡γ-干扰素的进一步研究奠定基础。[方法]根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,设计1对特异性引物。利用RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆鸡γ-干扰素基因,并在IPTG诱导下在大肠杆菌中表达重组菌。[结果]克隆的鸡γ-干扰素基因全长495bp,编码165个氨基酸,与国外克隆的鸡γ-干扰素基因序列的同源性为100%。鸡γ-干扰素蛋白含有12个α螺旋,3个β折叠,7个β转角。它具有强抗原性,而第16～23位氨基酸无抗原性。重组蛋白的分子量约18kD,其经IPTG诱导表达4h后,表达量最高,表达产率高达25%。[结论]鸡γ-干扰素具有一定的抗原性,预示其在免疫反应中起一定作用。     

鸡γ-干扰素基因的克隆与序列分析

为了研究鸡γ-干扰素（ChIFN-γ）基因的功能并进一步探究其在控制家禽传染病方面的应用，根据GenBank已发表的ChIFN-γ cDNA基因序列自行设计引物，应用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从伴刀豆球蛋白A（ConA）刺激培养鸡脾淋巴细胞中提取的总RNA中扩增得到ChIFN-γ，然后连接到pMD18-T载体上并转化到Top10感受态细胞中，获得阳性重组质粒并进行正确性序列测序．核甘酸序列结果表明，试验得到了长为513bp的ChIFN-γ基因，与原鸡（Gullus）IFN-γ的同源性可高达100％，其含有1个495bp的开放性阅读框架，编码164个氨基酸，推测其成熟蛋白的相对分子质量约为18000．     

抗鸡γ-干扰素单克隆抗体的研制及鉴定

应用淋巴细胞杂交瘤技术,以纯化的原核表达产物His-ChIFN-γ作为免疫原,以纯化的GST-ChIFN-γ作为检测原,制备抗鸡γ-干扰素(ChIFN-γ)mAb;采用ELISA、Dot-ELISA和ECL法鉴定单克隆抗体(mAb)的生物学特性。获得4株可稳定分泌抗ChIFN-γmAb的杂交瘤细胞株1G10、2C3、3E5、3E3,其腹水ELISA效价为2×104~8.2×105;Ig亚类分别为IgG1、IgG1、IgG1和IgG2a。Dot-ELISA和ECL试验结果均表明:4株mAb只与表达ChIFN-γ的重组大肠杆菌反应,而与未表达ChIFN-γ的菌株不反应,表明4株mAb均特异性针对ChIFN-γ。鸡脾脏淋巴细胞经PMA刺激后,经固定、破膜,用mAb 2C3标记,利用流式细胞术可成功地检测到表达ChIFN-γ的T淋巴细胞。mAb为家禽的免疫检测、免疫细胞功能分析和免疫调节等研究提供依据。     

应用重组抗原建立检测牛传染性胸膜肺炎的间接ELISA方法

 【目的】丝状支原体丝状亚种SC（Mycoplasma mycoides subsp mycoides SC，MmmSC）是引起牛传染性胸膜肺炎（contagious bovine pleuropneumonia，CBPP）的病原体。成熟的脂蛋白LppQ N端是亲水性的，在自然感染和人工感染时，特异性免疫反应产生早，持续时间长，抗体滴度高，因此有理由相信脂蛋白LppQ N端片段将有可能成为一种理想的CBPP诊断抗原。【方法】由于TGA密码子在支原体中编码色氨酸（Trp），而在细菌中则为终止密码子，故利用一步重叠延伸PCR突变方法体外诱变中国生产抗原用毒株HVRI Ⅹ的lppQ基因进行原核表达，利用重组抗原建立间接ELISA方法。【结果】序列分析表明，将lppQ基因第198位的A成功突变为G， 并将突变后的脂蛋白LppQ N端基因片段插入原核表达载体pET32a的多克隆位点，构建了原核表达载体。重组菌经诱导后，表达出了分子量约为42 kD、带有6个组氨酸标签的重组融合蛋白，纯化后蛋白质纯度高达95%，Western blot结果显示，重组蛋白具有很好的免疫活性。将纯化的蛋白质稀释至0.35 ?g·ml-1，包被酶标反应板，优化反应条件，P/N为4.8（0.934/0.193）。应用TG-ROC统计软件分析确定阴阳性血清临界OD值为0.376，敏感性为95.8%（46/48）， 特异性为98.9%（161/163）。应用间接ELISA和补体结合试验（CFT）对来自3个省自治区3 817头份牛血清进行了检测。【结论】Kappa值为0.63，两种方法存在中、高度一致性。     

猪α、γ干扰素的原核表达、纯化及抗病毒活性初步研究

提取猪白细胞DNA、猪脾脏RNA,特异性引物扩增猪IFN-α、IFN-γ基因,将IFN-α和IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ,转化大肠杆菌B121,在IPTG诱导下表达猪IFN-α及IFN-γ,SDS-PAGE分析重组表达蛋白;用细胞病变抑制法检测重组表达蛋白的抗病毒活性.结果表明成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ;SDS-PAGE可检测到相对分子质量为21.3 Ku和19.4 Ku的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在;经Ni2+-NTA亲和层析纯化,获得高纯度重组蛋白;纯化的猪IFN-α和IFN-γ抗星状病毒复制的活性分别为3.15×103 U·mg-1和2.48×103 U·mg-1.     

猪干扰素-γ基因的表达、纯化及活性分析

依照猪IFN-γ基因序列设计引物,将该基因克隆至原核表达载体pET-30a,构建pET-30a-pIFN-γ重组表达载体,转化入寄主菌BL21(DE3),经PCR、双酶切、测序鉴定正确后,用IPTG进行诱导表达,可溶性的表达产物分别经镍柱和Sephadex-G100纯化;包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化,然后进行SDS-PAGE、Western-blot分析,并用细胞病变抑制法进行重组猪IFN-γ活性测定.结果表明:试验得到了高纯度的重组pIFN-γ,且纯化的重组猪IFN-γ蛋白具有较高的干扰病毒复制的活性,对PRV的活性为2.0×103U.mg-1,而对标准O型口蹄疫病毒的活性为2.56×105U.mg-1.     

重组猪γ—干扰素在毕赤酵母中的表达及其生物学活性研究

采用RT-PCR从猪外周血液淋巴细胞中克隆出猪γ-干扰素基因cDNA,构建了重组酵母表达载体(pPICZα-PoIFN-γ),并在巴斯德毕赤酵母X33株中实现了高效分泌表达,经SDS-PAGE和Western-lot证实猪γ-干扰素分子量为18 kD,细胞培养试验结果表明,莺组猪γ-干扰素能抑制水泡性口炎病毒(VSV)对猪肾传代细胞(PK-15)的攻击;而在动物试验中,重组猪γ-干扰素可明显提高猪伪狂犬疫苗的免疫效果.     

鸡γ-干扰素的克隆·表达和序列分析

[目的]为鸡γ-干扰素的进一步研究奠定基础。[方法]根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,设计1对特异性引物。利用RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆鸡γ-干扰素基因,并在IPTG诱导下在大肠杆菌中表达重组茵。[结果]克隆的鸡γ-干扰素基因全长495bp,编码165个氨基酸,与国外克隆的鸡γ-干扰素基因序列的同源性为100％。鸡γ-干扰素蛋白合有12个α螺旋,3个β折叠,7个β转角。它具有强抗原性,而第16～23位氨基酸无抗原性。重组蛋白的分子量约18kD,其经IPTG诱导表达4h后,表达量最高,表达产率高达25％。[结论]鸡γ-干扰素具有一定的抗原性,预示其在免疫反应中起一定作用。     

鲤鱼干扰素γ-2β 全长cDNA的克隆及序列分析

[目的]进行鲤鱼干扰素γ-2β(IFNγ-2β)全长cDNA的克隆、鉴定及序列分析。[方法]以鲤鱼外周血白细胞干扰素γ-2β(inter-feronγ-2β,IFNγ-2β)EST序列为基础,以地高辛标记作为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IFNγ-2β的全长cDNA,并进行序列分析。[结果]获得了3个阳性克隆,对其进行序列分析,结果显示,该序列包含119 bp的5'非编码区,218 bp的3'非编码区,开放阅读框ORF长537 bp,共编码178个氨基酸,在其3'非编码区存在几个ATTTA不稳定基序;序列同源性比较结果表明,所获序列与GenBank上登录的鲤鱼IFN基因的同源性达97%;蛋白质序列和结构分析发现,该序列具有IFN家族的典型序列特征。[结论]为进一步研究IFNγ-2β在体内的表达方式、功能特点和调控机理以及在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。