野生稻细胞核DNA提取的研究

药用野生稻是中国最具利用价值的野生稻资源之一,具有许多优良的性状和有利基因,是改良栽培稻培育新品种的宝贵基因库,而其CC基因组的优良基因有望以大片段形式通过BIBAC等载体转化到栽培稻中.BIBAC文库不仅能作为大片段基因组文库的载体,而且能通过根癌农杆菌介导将克隆片段导入植物基因组直接进行转化,可用于筛选分离基因等研究.如何获得基因组DNA大片段非常关键,本研究采取 琼脂糖包埋基因组的方法获得大片段DNA,并对其中的一些步骤进行了优化,为构建药用野生稻BIBAC文库打下了很好的基础,值得在其它植物类似研究中参考.     

药用野生稻BIBAC文库构建过程中质粒提取方法改进

水稻的生产一直受到生物和非生物逆境等因素的影响,容易造成遗传基础单一,迫切需要拓宽现有栽培稻品种的遗传基础,引进不同来源的抗性和耐性基因。而野生稻是一个重要的有利基因库,充分利用野生稻的有利基因可拓宽现有栽培稻品种的遗传基础,有利于选育优良品种应用于生产或创造出特殊中间材料。但对于野生稻的利用目前仍存在许多困难,通过常规杂交途径一般难以实现。为了拓宽栽培稻的遗传基础,利用云南药用野生稻有利基因,通过构建BIBAC文库的策略挖掘云南药用野生稻有利基因用于栽培稻的改良。而高质量的载体制备在文库的构建中起非常重要的作用,是文库构建的一个关键因素。本研究对高质量BIBAC载体制备中的关键技术如提取、纯化等进行了探讨。     

药用野生稻有利基因发掘与利用研究进展

药用野生稻具有丰富的遗传多样性并含有大量的优异基因,发掘与利用这些基因对改良栽培稻和培育新种质具有重大意义.因此,通过综述了国内外药用野生稻有利基因发掘及其利用的研究进展,结果表明,药用野生稻在抗病性、抗虫性以及稻米品质方面具有优良性状,目前对这些优异基因的利用的途径主要包括单片段附加系的培育、渗入系的建立及单个基因材料的获得,但在利用过程中仍存在遗传学背景不清楚、常规育种效率不高两方面障碍.针对这些问题,许多研究者提出通过建立药用野生稻全基因组基因嵌入突变体库,利用可转化大片段基因组文库和转基因技术,将大片段克隆导入栽培稻中,通过这些技术方法可将药用野生稻的优良基因转入栽培稻,并已获得了一些极有价值的基因与种植材料.     

利用水稻C0t-1 DNA和基因组DNA对栽培稻、药用野生稻和疣粒野生稻基因组的比较分析

【目的】研究中高度重复序列在稻属不同物种基因组进化中的作用。【方法】用栽培稻C0t-1 DNA和基因组DNA(gDNA)作为探针，分别对栽培稻、药用野生稻和疣粒野生稻进行荧光原位杂交(FISH)和比较基因组杂交(CGH)。【结果】C0t-1 DNA覆盖栽培稻、药用野生稻和疣粒野生稻基因组比例(%)和大小(Mb)分别为47.10±0.16，38.61±0.13，44.38±0.13和212.33±1.21，269.42±0.89以及532.56±1.68。栽培稻gDNA在药用野生稻和疣粒野生稻基因组中的覆盖率约为91.0%和93.6%，含量分别约为634 Mb和1123 Mb，各有365 Mb和591 Mb不属于源自栽培稻基因组的中高度重复序列，未被栽培稻gDNA所覆盖的部分，分别为64 Mb和78 Mb左右。此外，以C0t-1 DNA的组成为依据，对这3个种核型进行了同源性聚类。【结论】稻属中度和高度重复序列和功能基因一样，在不同种中也存在着高度同源性和保守性，并在进化过程中得以保存下来。药用野生稻和疣粒野生稻基因组增大的重要原因之一，可能是基因组中度和高度重复序列加倍的结果，药用野生稻这种序列扩增相对疣粒野生稻要缓和得多。另外，这两个野生种在长期进化过程中，由于存在加倍、重排和基因选择性丢失等现象，形成了具有自己种的特异性的基因组成分。     

栽培稻与Oryza officinalis相似群野生稻基因组VDAC基因的比较

根据水稻基因组文库日本晴的基因组VDAC基因的序列,设计引物分别扩增6种不同基因组的野生稻(BB、CC、BBCC及CCDD)和2种栽培稻(AA)的基因组DNA的VDAC基因片段.所有分别代表8个VDAC基因的8对引物中,除引物VDAC3外,其它7对引物均能扩增出预期大小的特异条带,其中一些片段是所有试验材料共有的,而另一些则具有明显的基因组或种的特异性.AA、BB、CC基因组均具有VDAC1、VDAC4、VDAC7和VDAC8引物的扩增位点,而DD基因组则不能确定.VDAC6的引物位点是AA基因组所特有.VDAC2引物的扩增位点存在于基因组AA、BB、DD,而CC基因组中则无此位点.而VDAC5则可区分同为CCDD的宽叶野生稻和高秆野生稻.栽培稻种与野生稻种基因组相比能扩增出更多的VDAC基因片段的试验结果,为进一步研究稻属中VDAC基因的起源及进化关系提供了基础.     

栽培稻、斑点野生稻、药用野生稻基因组比较分析

以栽培稻总DNA为探针,对栽培稻(AA)自身、斑点野生稻(BB)以及药用野生稻(CC)体细胞染色体进行基因组荧光原位杂交(GISH),并以斑点野生稻总DNA为探针,对自身和药用野生稻体细胞染色体进行基因组荧光原位杂交,以此研究A、B、C 3个基因组型之间的关系.结果显示,A、B、C基因组之间都存在较高的同源性,其中AA与CC之间的信号最强,BB基因组与AA基因组次之,BB基因组与CC基因组的信号最弱.说明A、B、C 3个基因组之间的亲缘关系,A与C最近,B与C最远.     

药用野生稻抗源对褐稻虱的抗性遗传及利用研究

利用广谱高抗褐稻虱的药用野生稻（CC染色体组）与感虫栽培稻（AA染色体组）品种进行远缘杂交，通过幼胚培养获得绿苗，经过4代回交和4代自交，成功地将抗性基因转移到栽培稻中，获得了高世代B4F4株系。对其亲本和后代的鉴定结果表明，药用野生稻抗性受1对显性主效基因控制；其抗性基因与药用野生稻主要农艺性状没有连锁遗传关系。     

基于水稻线粒体atp6基因的稻属CMS基因起源及DNA条形码的研究

【目的】探讨亚洲栽培稻CMS基因起源及水稻线粒体atp6特异性引物作为稻属DNA条形码标记的应用。【方法】用水稻atp6特异性引物通过PCR检测产于中国的4种水稻,共720个个体,并对111个个体测序。【结果】普通野生稻和亚洲栽培稻中均检测到atp6保守序列。药用野生稻中没检测到扩增产物。疣粒野生稻中检测到的5个单倍型间共计17个变异位点。澜沧、普洱、勐海居群共同拥有H1,单倍型H2、H3、H4和H5分别为新平、墨江、保亭和崖城居群特有。云南组和海南组,组内平均遗传距离为0,组间为0.02;组间遗传分化系数Fst为92.08%;变异位点数(S)、单倍型数(h)、核苷酸多样性(Pi)均显示:云南组(4、3、0.002 01)遗传多样性大于海南组(1、2、0.001 31);云南组单倍型多样性Hd为0.6,海南组为1。5个单倍型与水稻atp6保守序列的相似度最高为45.19%。最大似然法ML进化树显示:澜沧、普洱及勐海一带可能是疣粒野生稻的起源地,海南疣粒野生稻可能源自大陆。【结论】水稻atp6特异性引物可作为疣粒野生稻种内条形码标记,该标记也可区分普通野生稻、药用野生稻和疣粒野生稻。从线粒体DNA角度证实亚洲栽培稻CMS基因源自普通野生稻。     

用荧光显微镜技术观察药用野生稻(Oryza officinalis Wall)和转基因水稻的不亲和性

 采用荧光显微镜技术观察转基因水稻花粉在药用野生稻柱头上的萌发及在花柱内的生长过程,以明确两者之间不亲和性发生的阶段,为判断其能否发生基因漂流提供依据。结果表明,两种转基因栽培稻(Y003和99t)的花粉在药用野生稻柱头上的萌发率均比药用野生稻自花授粉的低,花粉管在花柱中的生长速度较慢,且分别在到达花柱中部(Y003)或花柱基部(99t)时停止生长,顶端异常膨大,杂交子房逐渐萎缩,结实率为0。药用野生稻与栽培稻杂交不亲和的原因是花粉管在花柱中停止生长、不能进入胚囊完成受精,在自然条件下转基因栽培稻中的外源基因     

利用水稻BAC克隆对Gm-2和Gm-6在药用野生稻中的FISH定位

 采用栽培稻遗传图第 4连锁群中与抗稻瘿蚊基因 ,Gm- 6和 Gm- 2等位的 RFL P标记 RG2 14和 RZ5 6 9筛选出来的两个 BAC克隆为探针 ,对药用野生稻进行了荧光原位杂交物理定位。两个 BAC克隆的大小分别为 5 0 kb和86 kb,在 Cot- 1DNA封阻的情况下它们均被定位于药用野生稻第 4染色体长臂 ,与着丝粒百分距为 72 .33± 4.40、77.10± 2 .40 ,信号检出率分别为 6 1.2 %和 5 9.5 %。与此同时 ,用 RG2 14和 RZ5 6 9对药用野生稻进行了杂交 ,它们也被定位于药用野生稻第 4染色体长臂 ,与着丝粒百分距分别为 74.18± 2 .6 2和 78.2 3± 2 .31,信号检出率分别为 8.3%和 9.4%。 BAC克隆的 RFL P标记探针杂交位置几乎一致 ,这表明在栽培稻和野生稻中 RFL P标记 RG2 14和RZ5 6 9都在同一 BAC克隆的大插入片段中 ,药用野生稻与抗性基因 Gm- 6和 Gm- 2同源顺序就在第 4染色体信号出现的相应位置。药用野生稻第 4染色体的确定是根据 Jena等 (1994)和本研究的 RFL P的杂交结果进行的。文中讨论了利用栽培稻 BAC克隆对药用野生稻进行原位杂交物理作图的可行性等问题。     

双元细菌人工染色体基因组文库研究进展

酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)是伴随着人类基因组计划的实施而产生的,这些大片段基因克隆载体的应用推动了分子生物学、遗传学等学科的快速发展。以农杆菌介导的直接转化植物为代表的双元细菌人工染色体(BIBAC)载体的发展,加速植物基因组的研究,成为植物基因组分析、基因功能鉴定、染色体结构与功能关系研究的重要工具。介绍了人工染色体文库的发展史,根据建库经验,着重阐述了BIBAC文库的构建、鉴定与应用。     

普通小麦5DL染色体分选及染色体BIBAC文库构建技术体系优化

 【目的】优化小麦染色体流式分选及特定染色体BAC文库构建技术体系,为加速小麦基因组学研究提供技术支撑。【方法】采用双阻断法对中国春5DL端体根尖分生组织进行细胞周期同步化处理,结合机械匀浆法制备染色体悬浮液进行流式核型分析,分选染色体5DL及PCR检测,对小麦染色体分选技术体系进行优化。对复合峰分选产物Bam HI酶切制备高分子量（high molecular weight,HMW）DNA,按10﹕1质量比与双元细菌人工染色体（binary-bacterial artificial chromosome,BIBAC）连接,电激转化感受态细胞DH10B,随机挑取100个重组子,经NotI完全酶切后脉冲电泳检测插入片段大小,优化小麦染色体BAC文库构建的技术体系。【结果】经1.25 mmol•L-1 羟基脲（hydroxyurea,HU）18 h,恢复6 h和1 µmol•L-1 氟乐灵（trifluralin）2.5 h的顺序处理的小麦根尖分生组织,细胞有丝分裂指数可超过60%。流式核型分析表明,5DL端体的流式核型图由清晰的三个复合峰和两个单峰组成。PCR鉴定表明,其中一单峰确由5DL染色体组成。部分酶切复合峰染色体3～10 min,可以获得50～300 kb 的HMW DNA。连接产物检测显示平均插入片段可达100 kb左右,根据荧光通道值,估算5DL端体的大小约为482 Mb,构建库容为19 000个克隆的5DL端体特异文库即可达到约4倍的覆盖率。【结论】上述两项优化技术适用于小麦染色体的分选及染色体特异文库的构建。     

索式桃花水母全长cDNA文库的构建

[目的]构建索式桃花水母的全长cDNA文库,为桃花水母的生长、发育、衰老过程功能基因的进一步筛选、克隆和表达奠定基础。[方法]利用RNAiso试剂盒提取桃花水母的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,经SfⅠi酶切消化后,将cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB,并对cDNA文库进行质量评价。[结果]经鉴定,原始文库的滴度为7.9×10^5cfu/ml,库容量约为1.0×10^6cfu。随机挑取28个克隆,经PCR快速鉴定,插入片段大小在0.5～2.5kb,平均大小在1.0kb左右,重组率达94%,表明获得了高质量的桃花水母cDNA文库。[结论]该试验成功构建了桃花水母cDNA文库,其cDNA原始文库的库容,根据真核生物能够满足建库的要求,同时文库的cD-NA插入片段序列是完整的,从而证实构建的文库质量较好,可以用于桃花水母目的基因的筛选。     

链格孢菌（Alternaria tenuissima）cDNA酵母表达文库的构建

为了解细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)遗传学背景,克隆及研究该菌功能基因,根据Gateway技术构建了既能在酵母细胞中表达外源基因又能在原核细胞大量复制的酵母表达载体pRS-DEST42,构建了细极链格孢菌(A.tenuissima)cDNA酵母表达文库.经检测,文库的平均滴度为2.44×106 cfu/ml,文库总容量为2.44×107 cfu(colony-forming unit),阳性克隆率为100%,平均插入片段约为1.38 kb.细极链格孢菌cDNA酵母表达文库是一个质量较高的表达文库,为克隆与分离全长目的基因及其功能奠定了坚实的基础.     

二斑叶螨cDNA文库的构建及鉴定

为研究二斑叶螨发育相关基因的功能,利用TRIzol试剂提取二斑叶螨总RNA,通过SMART技术构建cDNA文库.利用SMART IVTM Oligonucleotide和CDSIII/3忆PCR Primer为引物,在反转录酶作用下,合成cDNA第1链,利用LD-PCR方法合成cDNA第2链。合成的双链cDNA经酶切回收后,再连接pDNR-LIB载体,转化大肠杆菌感受态细胞Trans5琢,检验库容量和重组效率,并采用PCR方法检测插入cDNA片段的大小.结果表明,构建的二斑叶螨cDNA文库的库容量为3.54C6 CFU/mL,重组效率达95.8%,插入片段长度在0.3~2.0 kb之间。构建的二斑叶螨cDNA文库质量良好袁能够为进一步研究二斑叶螨基因的功能奠定基础。     

绿木霉ZBS6黏粒基因组文库的构建及质量鉴定

为开展绿木霉ZBS6(Trichoderma viride ZBS6)拮抗基因筛选及克隆工作,建立了高质量基因组DNA的提取方法,并采用SuperCos1载体构建了绿木霉ZBS6黏粒基因组文库。试验中共获得3.9×104个黏粒克隆,平均插入片段大小约为33kb,文库滴度约为4.2×108 cfu/mL。理论上,从该文库中筛选到任一DNA序列的精确概率可高达99.9%。     

细菌性条斑病菌JH01诱导水稻抗病均一化差减文库的构建

[目的]构建细菌性条斑病菌诱导下的水稻抗病均一化差减c DNA文库,对获得的差异表达ESTs进行生物信息学及抗病相关基因的表达分析。[方法]以水稻IR26(Tester)和两优培九(Driver)幼苗5~6叶期叶片为材料,采用双链特异性核酸酶(DSN)介导的均一化消减杂交技术,构建细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻抗病相关基因差减c DNA文库,以p LB-F和p LB-R为引物,通过菌液PCR扩增对差减文库的质量进行检测。[结果]c DNA文库的插入片段分布在0.5~2.0 kb,平均大小约为1.0 kb,重组率达95%。序列测定分析发现,随机挑取的504个克隆中有98条差异表达基因;经BLAST比对和GO注释发现,59条序列具有同源基因,分别参与信号转导、能量代谢、过敏性坏死反应、防卫反应等;另外39条序列无相似基因,有待进一步研究。通过实时荧光定量PCR发现,从该文库中分离得到的Os NDPK4参与细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻防卫反应。[结论]水稻受细菌性条斑病菌侵染的c DNA文库质量较好,为研究条斑病菌致病性因子与水稻互作机制奠定基础。     

乌金猪基因组文库的构建

 为探究与我国优良地方猪种乌金猪特性相关的基因机制,拟构建其基因组文库。取乌金猪肝脏组织,提取大小50kb以上的基因组DNA,利用限制性内切酶Bcl I对基因组DNA进行随机酶切和低熔点琼脂糖电泳方法回收10~23kb的DNA片段。以EMBL3作为载体,经BamH I酶切和去磷酸化处理后,与上述纯化的目的DNA片段连接,在体外包装成重组噬菌体,重组噬菌体转染宿主菌KW251,构建成乌金猪基因组文库。文库的效价为24×109pfu/mL。乌金猪基因组文库的成功构建,为进行其相关功能基因和基因组区域的识别,基因组DNA和调控元件的克隆与功能分析等后续研究奠定了良好的基础。