药用野生稻有利基因发掘与利用研究进展

药用野生稻具有丰富的遗传多样性并含有大量的优异基因,发掘与利用这些基因对改良栽培稻和培育新种质具有重大意义.因此,通过综述了国内外药用野生稻有利基因发掘及其利用的研究进展,结果表明,药用野生稻在抗病性、抗虫性以及稻米品质方面具有优良性状,目前对这些优异基因的利用的途径主要包括单片段附加系的培育、渗入系的建立及单个基因材料的获得,但在利用过程中仍存在遗传学背景不清楚、常规育种效率不高两方面障碍.针对这些问题,许多研究者提出通过建立药用野生稻全基因组基因嵌入突变体库,利用可转化大片段基因组文库和转基因技术,将大片段克隆导入栽培稻中,通过这些技术方法可将药用野生稻的优良基因转入栽培稻,并已获得了一些极有价值的基因与种植材料.     

双元细菌人工染色体基因组文库研究进展

酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)是伴随着人类基因组计划的实施而产生的,这些大片段基因克隆载体的应用推动了分子生物学、遗传学等学科的快速发展。以农杆菌介导的直接转化植物为代表的双元细菌人工染色体(BIBAC)载体的发展,加速植物基因组的研究,成为植物基因组分析、基因功能鉴定、染色体结构与功能关系研究的重要工具。介绍了人工染色体文库的发展史,根据建库经验,着重阐述了BIBAC文库的构建、鉴定与应用。     

双元细菌人工染色体基因组文库研究进展

酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)是伴随着人类基因组计划的实施而产生的,这些大片段基因克隆载体的应用推动了分子生物学、遗传学等学科的快速发展。以农杆菌介导的直接转化植物为代表的双元细菌人工染色体(BIBAC)载体的发展,加速植物基因组的研究,成为植物基因组分析、基因功能鉴定、染色体结构与功能关系研究的重要工具。介绍了人工染色体文库的发展史,根据建库经验,着重阐述了BIBAC文库的构建、鉴定与应用。     

栽培稻、斑点野生稻、药用野生稻基因组比较分析

以栽培稻总DNA为探针,对栽培稻(AA)自身、斑点野生稻(BB)以及药用野生稻(CC)体细胞染色体进行基因组荧光原位杂交(GISH),并以斑点野生稻总DNA为探针,对自身和药用野生稻体细胞染色体进行基因组荧光原位杂交,以此研究A、B、C 3个基因组型之间的关系.结果显示,A、B、C基因组之间都存在较高的同源性,其中AA与CC之间的信号最强,BB基因组与AA基因组次之,BB基因组与CC基因组的信号最弱.说明A、B、C 3个基因组之间的亲缘关系,A与C最近,B与C最远.     

毛竹大片段双元细菌人工染色体基因组文库的构建

从毛竹Phyllostachys pubescens幼嫩叶片中提取纯化得到高质量的基因组DNA,经限制性内切酶BamH I对它们进行梯度酶切,脉冲场电泳选择合适酶切DNA片段,与脱磷酸化处理过的质粒载体pCLD04541按质量比3∶1相互连接,转化大肠杆菌Escherichia coli DH10B感受态细胞进行蓝白斑筛选,挑取白色克隆,获得重组率较高的阳性克隆,构建了含有10⁴个克隆的双元细菌人工染色体（BIBAC）基因组文库,并通过脉冲场电泳检测分析后确定,所构建的毛竹BIBAC文库平均插入片段为105 kb,约覆盖5倍毛竹基因组。该文库的构建为毛竹基因组研究做好了前期的基础工作。图8参18     

水稻培矮64S(PA64S)基因组BAC文库的构建与分析

9311和培矮64S(PA64S)分别是我国超级杂交稻两优培9(LYP9)的父母本,9311的基因组已由北京基因组研究所测序,而PA64S至今仍无任何可供公众使用的基因组资源,对PA64S基因组的研究将有助于对9311和PA64S这对亲本基因组的比较研究和其上优良基因的克隆,为LYP9的基因组研究提供帮助。以水稻PA64S的幼嫩叶片作为材料,为该品种构建了第一个高覆盖率、高质量的BAC文库。该文库一共有37 632个克隆,平均插入片段为138 kb,覆盖水稻全基因组12倍左右,空载率仅为1.5%,线粒体和叶绿体污染率仅分别为0.35%和1.85%。该文库克隆被存放于98个384孔板中并储存在-80℃冰箱中,将作为公共基因组资源向研究者开放。     

野生稻可转化基因组文库的构建

利用广泛应用于水稻转化的双元载体pCAMBIA1301构建了二倍体东乡野生稻和四倍体小粒野生稻可转化基因组文库，插入片断长度分别为9．54kb和13．3kb，稳定性实验证明含20kb插入片断的文库质粒可以稳定遗传，较长插入片断的文库质粒在农杆菌中的稳定性较差。     

云南药用野生稻种质资源的白叶枯病抗性评价

[目的]鉴定评价云南药用野生稻对白叶枯病菌株的抗性,为药用野生稻的保护及抗病新品种选育提供理论依据.[方法]利用24个近年在云南稻作区流行的白叶枯病菌株及国内外部分标准强致病菌系对云南8个居群(OF1~OF8)的31份药用野生稻材料进行接种鉴定,测量病斑长度,按照抗性分级标准进行抗性等级划分,建立抗病谱,比较分析不同药用野生稻材料间和不同居群间的抗性差异.[结果]接种24个白叶枯病菌株21 d后,感病材料金刚30的病斑长度均超过20.00 cm,而未接种的叶片未发生任何变化,说明24个白叶枯病菌株均未丧失致病力;31份药用野生稻材料大多出现典型的白叶枯病症状,但抗病等级存在差异,其中,67.7%的供试药用野生稻对XOO8菌株表现抗病,说明XOO8菌株的致病性最强,所有材料均抗XOO14菌株,说明XOO14菌株的致病性最弱.31份药用野生稻的抗菌率均在50.0%以上,其中OF2-1的抗菌率最高,为100.0%,OF4-2的抗菌率最低,为50.0%.8个居群中,以OF5和OF7的抗菌率最高,均为100.0%,说明二者对24个白叶枯病菌株均表现抗性;OF4的抗菌率最低,为79.2%,仅抗19个菌株.8个居群抗性由强至弱排序为:OF5=OF7>OF6>OF1=OF2=OF8>OF3>OF4.各居群内样品个体间抗性差异明显,推测是由于野生稻杂合程度较高所导致.[结论]云南药用野生稻种质资源对当前在云南流行的白叶枯病小种及国内外部分强致病菌整体抗性较好,其抗性差异来源于居群内的杂合度,与地理分布无关,推测云南药用野生稻具有特异的优良抗白叶枯病基因,其在遗传研究和品种改良方面具有较大应用潜力.     

云南药用野生稻快繁苗在育种中的利用研究

药用野生稻具有抗虫、抗病、抗旱、分蘖力强等优良特性,但是,药用野生稻结实率低,落粒性强,很难收种和保存繁殖。本研究利用药用野生稻种子离体培养方法获得植株再生苗。组培实验设计了3种不同的愈伤诱导培养基:筛选出MS+2,4-D 5.0 mg/L+植物凝胶2.8 g/L+蔗糖30 g/L,pH值5.8最适合愈伤诱导培养基,也筛选出愈伤继代、增殖培养基;设计了10种分化培养基:筛选出MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+ZT 3.0 mg/L+植物凝胶2.8 g/L+蔗糖30 g/L,pH值5.8最为适合分化的培养基,同时筛选出继代、增殖、壮苗的培养基;设计了10种生根培养基:筛选出MS+NAA 0.8 mg/L+植物凝胶2.8 g/L+蔗糖30 g/L,pH值5.8最适合生根的培养基。在培养技术方面采用磨去种皮,利用种子芽诱导愈伤,弱光培养愈伤,加快形成紧实、绿色颗粒愈伤,进行了有效改进。通过实验,建立了一套完整的药用野生稻快繁体系。以组培苗药用野生稻为父本,3个品系栽培稻为母本,3个杂交组合获得了远缘杂交后代。因此,远缘杂交在杂交育种中是可行的。     

药用野生稻基因组DNA提取方法比较

以药用野生稻为试验材料,分别选用传统的CTAB提取法、CTAB改良方法、碱裂解法、磁珠法、吸附柱法、尿素提取法及酶消化法7种方法提取水稻叶片组织DNA,7种方法分别标记为A～G。通过比较这些方法提取出DNA的浓度和纯度,分析这些方法的优劣势。7种方法均能获得较好的基因组,按获得DNA浓度表现为A>B>F>C>G>E>D,纯度表现为D>E>C>G>B>F>A。综合考量DNA的纯度、浓度、提取时间、成本、安全无毒等方面因素,若对基因组的质量要求不高,只是做简单的检测且考虑成本问题,可以选择CTAB提取法、CTAB改良方法和尿素提取法;若需要高纯度基因组,可以选择磁珠法、吸附柱法、碱裂解法;若考虑安全无毒、快速提取及成本可控,可以选择磁珠法、吸附柱法;若样品稀有,可以选用CTAB提取法和CTAB改良法。     

野生稻细胞核DNA提取的研究

药用野生稻是中国最具利用价值的野生稻资源之一,具有许多优良的性状和有利基因,是改良栽培稻培育新品种的宝贵基因库,而其CC基因组的优良基因有望以大片段形式通过BIBAC等载体转化到栽培稻中.BIBAC文库不仅能作为大片段基因组文库的载体,而且能通过根癌农杆菌介导将克隆片段导入植物基因组直接进行转化,可用于筛选分离基因等研究.如何获得基因组DNA大片段非常关键,本研究采取 琼脂糖包埋基因组的方法获得大片段DNA,并对其中的一些步骤进行了优化,为构建药用野生稻BIBAC文库打下了很好的基础,值得在其它植物类似研究中参考.     

Cytological Behavior of Hybridization Barriers Between Oryza sativa and Oryza officinalis

Oryza officinalis is one of the important wild species in the tertiary gene pool of Oryza sativa.It has a number of elite genes for rice breeding in resistance or tolerance.However,breeding barriers are so serious that the gene transfer is much difficult by sexual cross method between O.sativa and O.officinalis.Characteristics of the breeding barriers were systemically studied in this paper.When both the diploid (AA,2n=2x=24) and autotetraploid (AAAA,2n=4x=48) cultivated rice were crossed as maternal parents with O.officinalis (CC,2n=2x=24),none F1 hybrid seeds were obtained.The young hybrid ovaries aborted at 13-16 d after pollinations (DAP).By rescuing hybrid embryos,in vitro F1 plantlets were obtained in 2x×2x combinations with the crossabilities lower than 0.5％.Lower rates of double-fertilization and abnormal development of hybrid embryo and endosperm were mainly observed in both combinations of 2x×2x and 4xx2x.Free endosperm nuclei in hybrid degenerated early at 1 DAP in a large scale.Almost no normal endosperm cells formed at 3 DAP.Development of a lot of embryos ceased at globular- or pear-shaped stage as well as some degenerated gradually.The hybrid plantlets were both male and female sterility.Due to the abnormal development,a diversity of abnormal embryo sacs formed in hybrids,and hybrid pollen grains were typically abortive.It showed that conflicts ofgenome A and C in hybrid induced abnormal meioses of meiocytes.     

筛选和转化药用野生稻TAC克隆获得耐旱水稻

【目的】利用分子生物学技术建立一种可有效转移药用野生稻有利基因的方法,为进一步大量开展利用药用野生稻有利基因提供技术基础。【方法】以植物抗性相关转录因子AP2/EREBP和bZIP家族基因保守序列为探针,采用同位素α-32P对探针进行标记,通过Southern 杂交对药用野生稻TAC文库进行第一轮筛选;所获得阳性克隆用地高辛标记的探针进行第二轮筛选;最后利用PCR方法对第二轮筛选所获得的阳性克隆进行验证。通过农杆菌介导法将阳性克隆转入栽培稻品种日本晴,利用TAC载体插入片段两端的抗性标记Hpt和SacB,通过PCR扩增检测和和Southern杂交对转化植株进行鉴定。采用PEG胁迫法和生理指标变化对转基因T2植株的芽期、苗期耐旱性进行鉴定。【结果】第一轮TAC文库筛选共获得1 073个阳性克隆,其中,以AP2/EREBP的保守序列为探针筛选出606个、bZIP为探针筛选出467个。对这些阳性克隆进行第二轮筛选,从中共获得147个阳性克隆,其中,AP2/EREBP为探针筛选出95个、bZIP为探针筛选出52个。PCR验证有103个阳性克隆能够扩增出目的片段,分别是利用AP2/EREBP设计的引物筛选出63个克隆和bZIP的40个克隆,阳性克隆得率分别为66.32%和76.92%。通过农杆菌转化,以编号为52D-M16和22D-P2（与AP2/EREBP相关）以及55R-A17、49R-O14和8-A24（与bZIP相关）的克隆转化水稻日本晴均获得转化植株,转化试验结果发现外源插入片段越大则克隆转化的成苗率越低。抗性鉴定、PCR和Southern杂交结果均证明外源片段已转入受体水稻品种日本晴中。芽期抗旱性鉴定表明R12-23、R15-41和R1-8 3份材料的耐旱性优于受体日本晴,苗期鉴定显示M63-9和R12-23的耐旱性较强。综合认为,R12-23具有较好的耐旱性。【结论】通过构建药用野生稻TAC文库并结合特异克隆筛选和遗传转化方法,可以进行有利基因的转移,结合进一步的育种,有望实现药用野生稻在育种上的利用。     

利用药用野生稻培育耐光氧化和 耐荫水稻新种质的研究

将药用野生稻总DNA 通过穗茎注射法导入恢复系R225,创制耐荫、耐光氧化的水稻新种质。结果表明, 在T0和T1代幼苗期进行全天侯遮光处理15 d后,有90%~75%的秧苗黄化甚至枯萎;在T2和T3代孕穗期和灌浆结 实期,通过测定耐光氧化指数,最终筛选到耐荫、耐光氧化的3 个导入系;经SSR 标记检测,RM219 和RM5490 在导 入系中扩增出了与受体R225 不同的3 种带型,表明药用野生稻DNA 被成功导入受体R225 中,并据此推测,标记 RM219 和RM5490 很可能与耐荫或耐光氧化QTL 位点紧密连锁。     

药用野生稻(Oryza officinalis Wall)和转bar基因水稻(Oryza sativa L.)花粉杂交的基因漂移

采用生殖生物学方法研究了药用野生稻和转bar基因水稻花粉杂交的基因漂移。结果表明，供试水稻花粉在药用野生稻柱头上的萌发生长与药用野生稻自花授粉花粉的萌发生长有一定差异，表现在穿过桩头的花粉粒百分率及内容物释放和正在凝缩、释放的花粉粒百分率较少，虽然转基因水稻花粉能在药用野生稻柱头上正常萌发生长，并能释放内容物，但杂交后结实率为0，表明转基因水稻和药用野生稻杂交不亲和，他们的不亲和性不是在花粉的萌发和穿过柱头这一阶段，具体原因有待进一步研究。在本实验条件下转基因水稻和药用野生稻没有发生成功的基因交流。     

用荧光显微镜技术观察药用野生稻(Oryza officinalis Wall)和转基因水稻的不亲和性

 采用荧光显微镜技术观察转基因水稻花粉在药用野生稻柱头上的萌发及在花柱内的生长过程,以明确两者之间不亲和性发生的阶段,为判断其能否发生基因漂流提供依据。结果表明,两种转基因栽培稻(Y003和99t)的花粉在药用野生稻柱头上的萌发率均比药用野生稻自花授粉的低,花粉管在花柱中的生长速度较慢,且分别在到达花柱中部(Y003)或花柱基部(99t)时停止生长,顶端异常膨大,杂交子房逐渐萎缩,结实率为0。药用野生稻与栽培稻杂交不亲和的原因是花粉管在花柱中停止生长、不能进入胚囊完成受精,在自然条件下转基因栽培稻中的外源基因     

黑龙江镜鲤基因组DNA文库的构建

纯化镜鲤体组织的高分子量基因组DNA,经限制性内切酶Sau3A Ⅰ部分消化后,10％-40％蔗糖密度梯度离心分离并回收9—23kb的DNA片段。以λDASHⅡ为克隆载体,与9—23kb的DNA片段进行连接和包装,构建了镜鲤的基因组DNA文库。随机选取5个独立的噬菌斑,提取DNA后用EcoR Ⅰ与BamH Ⅰ进行酶切分析,证明克隆插入率为100％。经测定,该文库的滴度是108pfu/mL,根据公式N=ln(1-P)/In(1-f),99％的镜鲤基因组包含在该基因组文库中。以鲤IGF-Ⅱ基因探针对该基因组文库进行Southem杂交,筛选到相关的阳性克隆,证明这是一个较为完整的镜鲤基因组DNA文库。     

黑龙江镜鲤基因组DNA文库的构建

纯化镜鲤体组织的高分子量基因组DNA,经限制性内切酶Sau3A Ⅰ部分消化后,10％-40％蔗糖密度梯度离心分离并回收9—23kb的DNA片段。以λDASHⅡ为克隆载体,与9—23kb的DNA片段进行连接和包装,构建了镜鲤的基因组DNA文库。随机选取5个独立的噬菌斑,提取DNA后用EcoR Ⅰ与BamH Ⅰ进行酶切分析,证明克隆插入率为100％。经测定,该文库的滴度是108pfu/mL,根据公式N=ln(1-P)/In(1-f),99％的镜鲤基因组包含在该基因组文库中。以鲤IGF-Ⅱ基因探针对该基因组文库进行Southem杂交,筛选到相关的阳性克隆,证明这是一个较为完整的镜鲤基因组DNA文库。