水牛体细胞核移植相关影响因素的研究

主要是探讨水牛卵母细胞的体外成熟与供体的年龄和性别对其核移植效果的影响。体外成熟培养22～24h的水牛卵母细胞,在含有5μg／mL细胞松弛素的操作液中进行去核,然后将经0．1μg／mL蚜栖菌素（Aphidicolin,APD）培养处理24h,再用0．5％胎牛血清（FBS）培养2d的水牛耳皮成纤维细胞注射到去核的卵母细胞卵周隙中,再经电融合形成重构胚。重构胚经5μmol／L离子霉素激活处理5min并在2mmol／L的二甲氨基嘌呤（6-DMAP）中培养3h后,在含有颗粒细胞单层细胞的微滴中（30μL）培养7d,观察其卵裂和胚胎发育情况。结果显示：在添加有10ng／mL上皮生长因子（EGF）成熟液中培养的受体水牛卵母细胞的融合率和重组胚卵裂率与对照组无显著差异（P〉0．05）,但其囊胚发育率明显高于对照组（18．53％vs．7．56％,P〈0．05）。来自胎儿（3个月）或成年（一头5～6岁,另一头22岁）水牛的耳皮成纤维细胞核移植后重组胚的卵裂率差异不显著（P〉0．05）,但水牛胎儿体细胞构建的重组胚囊胚率显著高于成年体细胞（22．55％vs．10．77％和8．09％,P〈0．05）。雌性水牛成纤维细胞构建的重组胚的囊胚发育率（20．23％）显著高于雄性水牛体细胞的囊胚率（10．16％,P〈0．05）。以上结果表明：（1）成熟液中添加EGF能提高受体卵母细胞核移植后的胚胎发育率;（2）水牛体细胞核移植效果受供体的个体年龄和性别的影响：胎儿成纤维细胞的核移植效果优于成年的成纤维细胞,而且以雌性的效果较好。     

电脉冲激活对体外成熟猪卵母细胞卵裂率和囊胚率的影响

探索了电脉冲结合细胞松驰素B(CB)、放线菌酮(CHX)以及6-二甲基嘌呤(DMAP)等化学物质,对猪卵母细胞激活后发育的影响.在电脉冲激活时,0.6 kV/cm和1.3 kY/cm,80μs,1次电激活后,(1)用2 mmol/LDMAP处理6 h的卵裂率分别为(60.39±6.71)%和(60.35±8.95)%,差异不显著(P＞0.05),囊胚率分别为(9.51±5.93)%和(14.53±3.38)%,差异显著(P＜0.05);(2)用7.5μg/mL CB+10μg/mL CHX处理6 h的孤雌胚,卵裂率[(1.82±10.76)%vs(58.50±8.33%)]和囊胚率(8.91±4.37)%vs(14.53±3.38)%]均存在显著差异(P＜0.05).卵母细胞经1.3 kV/cm、80μs和单次电脉冲激活后,分别用7.5μg/mL CB、10μg/mL CHX、2 mmol/L DMAP、7.5μg/mL CB+10μg/mLCHX和7.5μg/mLCB+2 mmol/LDMAP处理2～8 h,结果表明CB处理4 h,CHX、CB+CHX和CB+DMAP处理6 h,DMAP处理8 h的卵裂率和囊胚率高于其它时间处理组.在电脉冲/CB、CHX、DMAP、CB+CHX和CB+DMAP 5种激活方法中,CB+CHX和CB+PMAP的卵裂率和囊胚率分别为(78.46±8.46)%、(33.13±7.84)%和(75.84±10.61)%、(39.12±7.15)%,囊胚率显著高于其它各组(P＜0.05).     

自体或异体小鼠卵丘细胞核移植胚胎的发育

体细胞核移植胚胎发育到成体和许多因素有关,如供体细胞的种类(Wakayama et al.,2005;Saito et al.,2004),性别和基因型(Wakayama et al.,2005),线粒体(Bruggerhoff et al.,2002)等.供体细胞核在卵胞质因子作用下重编程,抑制自身基因表达,恢复为胚胎发育所必需的基因表达状态.本研究比较了来自同一雌鼠(SI)或者不同雌鼠(DI)的供体细胞对核移植胚胎的发育影响.     

猪体细胞核移植重构胚发育异常及印迹基因表达特征研究的进展

由于猪的器官极可能成为人类未来器官的供应源,猪体细胞核移殖及转基因等方面的研究已成为全球的热点。近几年来,猪体细胞核移植研究取得了一定的进展,但总体来看核移植效率还很低(1%~2%),还需要不断完善核移植程序及对一些基础问题的深入研究。本文主要对猪体细胞核移植重构胚发育异常及“印迹”基因表达特征作一综述与分析,旨在为研究者提供一些有益的启示。     

牛体细胞核移植胚和孤雌激活胚的两步法体外培养

摘要：研究了牛体细胞核移植胚和孤雌胚在不同体外培养系统中的发育效果。结果显示：牛孤雌胚在培养液BECMaa＋10％FBS中的囊胚发育率明显高于SOFaa＋10％FBS或TCM199＋10％FBS （16.5% ∶ 13.6% / 12.8%, P＜0.05）；而在SOFaa＋10％FBS中添加还原型谷胱甘肽（GSH）后，牛孤雌囊胚的发育率显著提高（18.5% ∶12.8%, P＜0.01）。成纤维细胞生长因子4（FGF4）或胰岛素添加进无血清SOFaa（含GSH）中，可明显提高牛体细胞核移植胚的囊胚发育率（8.7% / 9.3%∶5.5%, P＜0.05），血清存在时，这两种生长因子无明显作用。依据上述结果及牛早期胚胎的代谢特征，以SOF为基础液合成两组培养液分两步培养牛胚胎，即先用胚胎培养液Ⅰ（SOFnaa＋GSH＋EDTA＋insulin）培养72 h，然后换用胚胎培养液Ⅱ（SOFaa＋GSH＋5％FBS＋葡萄糖＋insulin）继续培养，与对照组（SOFaa＋GSH＋10％FBS一步培养）相比，牛孤雌胚和核移植胚的囊胚发育率都明显提高（22.3%∶18.5%; 15.0%∶11.7%, P＜0.01），说明两步法培养体系更符合牛早期胚胎不同发育阶段的代谢特征和营养需求，是一种适宜的牛胚胎培养方法。     

Scriptaid处理可提高近交系五指山猪克隆胚胎的发育能力和克隆效率

为探讨一种新型低毒的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid处理克隆胚胎时对其发育能力和克隆效率的影响,本研究以近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞为供体细胞进行体细胞核移植构建重构胚胎,重构胚胎激活后培养在添加Scriptaid不同浓度（0～300nmol/L）的胚胎培养液中培养不同的时间（0～36h）,观察克隆胚胎的卵裂率和囊胚率,评价克隆胚胎体外的发育能力。实验结果发现100nmol/L Scriptaid处理24h组克隆胚胎的囊胚发育率（30.4%）较对照组（17.5%）显著提高,P〈0.05。将100nmol/L Scriptaid处理24h组克隆胚胎和对照组胚胎分别移植到4头受体母猪中,进一步观察其体内的发育能力。处理组克隆胚胎的受体在平均窝产仔数和克隆效率（分别为5头,2.4%）均显著高于对照组（分别为1.5头,0.7%）,P〈0.05。以上结果表明,100nmol/L Scriptaid处理24h近交系五指山小型猪克隆胚胎,有利于提高克隆胚胎的发育能力和克隆效率。     

氧分压、培养基及生长因子对猪孤雌激活胚胎体外发育的影响

体外培养是猪胚胎体外生产的关键环节。近年来在孤雌激活以及体外受精胚胎的培养方面已经取得了很大的进展,但是,和体内生产的胚胎相比,胚胎早期发育率还很低,体外培养     

兔和牛卵母细胞核移植的研究

通过显微操作，将１６～３２细胞期胚胎的单个卵裂球注入去核卵母细胞的卵周隙内，用适当电压（兔１６０Ｖ、牛１２０Ｖ）和脉冲时间的两次电脉冲诱导卵裂球与卵母细胞的融合；融合后的胚胎体外培养观察发育或移植到同步受体。体内成熟的免卵母细胞操作后存活率为９３．７％（１５０１／１６０２），融合率为９４．３％（１２８１／１３５９）。融合卵再用１６０Ｖ４０μｓ电脉冲电激一次，可显著提高其卵裂率（７５．９％比１８．２％，Ｐ＜０．０１）。用体外成熟的兔卵母细胞进行核移植，存活率和融合率分别为７８．５％（９５／１２１）和９５．７％（８８／９２），融合胚卵裂率为５１．４％（３７／７２）。初步表明体外成熟的兔卵母细胞可作为核移植的受体卵。此外，还尝试了用体外受精的牛胚胎和体外成熟的牛卵母细胞进行核移植，操作后存活率和融合率分别为９８．０％（５０／５１）和７５．５％（３７／４９），核移植胚的卵裂率为５４．１％（２０／３７）。     

Aurora A对猪卵母细胞向胚胎转换过程中纺锤体结构的影响

极光激酶A(Aurora A)是一种参与体细胞中心体复制、纺锤体组装与胞质分裂等生物学事件的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶.为了探讨AuroraA在猪(Susscrofa)卵母细胞向胚胎转换这一特殊时期的动态表达及其相关功能,本研究采用间接免疫荧光结合激光共聚焦显微成像技术检测AuroraA在转换过程中动态表达与亚细胞定位,并在此基础上通过特异性抑制实验分析Aurora A在该特殊转换时期的调节作用.结果表明,AuroraA在猪卵母细胞向胚胎转换的各个时期均有表达,并与α-微管蛋白(α-tubulin)具有相似的亚细胞定位;使用AuroraA特异性抑制剂MLN8054处理卵母细胞,卵母细胞的第一极体排出率呈浓度依赖性下降,且纺锤体异常率显著升高(P＜0.05);将经MLN8054处理且排出第一极体的卵母细胞孤雌激活后,胚胎卵裂率与对照组相比无显著差异.结果表明,在猪卵母细胞向胚胎转换过程中,AuroraA 的表达与α-tubulin分布密切相关,且呈现阶段性分布特点;AuroraA主要通过调节纺锤体组装及其稳定性参与猪卵母细胞成熟分裂的调控;MLN8054抑制AuroraA后,对所获得的第二次减数分裂中期(metaphaseⅡ,MⅡ)卵母细胞顺利向胚胎期转换并无显著影响.研究结果为进一步了解AuroraA在猪卵母细胞向早期胚胎转换这一特殊时期的调控作用提供了重要的实验依据.     

发情牛血清在猪卵母细胞成熟中的应用

为了检验发情牛(Bos taurus)血清在猪卵母细胞成熟中的应用,实验分别在成熟培养液中加入不同的血清,观察卵母细胞的成熟效果,并通过孤雌激活胚胎和重构胚的体外发育能力来判断血清对卵母细胞质量的影响:研究还进行了用发情牛血清成熟的卵母细胞构建的核移植胚胎的体内发育试验.结果表明,发情牛血清,成年牛血清和胎牛血清在猪卵母细胞的成熟率方面没有显著差异(P>0.05);卵母细胞成熟时加入不同的血清,对卵母细胞体外发育能力的影响不显著(P>0.05);来自含发情牛血清成熟液培养的卵母细胞,与胎儿成纤维细胞构建的克隆胚胎能够完成全期发育.     

粪污肥料化产物对土壤磷淋失的影响

以华北平原广泛分布的潮土为研究对象,采用室内模拟和室外淋溶试验,通过比较生物有机肥（BOF）、普通有机肥（OF）、沼液（BS）、猪场废水（WLF）、化学肥料（CF）和不施肥（NOP）6个施肥处理对土壤磷淋失量、土壤速效磷含量及小白菜产量的影响,以明确不同肥料施用后土壤磷的转化及淋失能力的差异。结果表明：（1）由于下层土壤对从上层淋溶下的磷的吸附作用,模拟淋溶及室外淋溶实验中各处理组之间磷淋失量差异性不一致,淋失量平均值最大的分别为CF及WLF组。（2）不同肥料处理组在不同土壤深度中速效磷（Olsen-P）含量存在差异,与NOP组相比,CF处理组在0?20cm、BOF处理组在0?60cm深度土壤的Olsen-P含量显著增加,其余处理组与NOP组在4个深度土壤中均无显著差异。（3）在室外淋溶实验中,CF组小白菜产量比施有机肥组高17.8%～82.0%,比NOP组高923.5%,施有机肥组的产量比NOP组高462.4%～768.7%;各组之间植株磷吸收量均存在显著差异,CF组磷吸收量比施有机肥组高22.0%～124.7%,比NOP组高1504.3%,施有机肥组磷吸收量比NOP组高614.0%～1214.9%。综合实验结果可知,从控制磷淋失量、促进植物生长及磷吸收的角度看,BOF和OF是最适合粪污处置的应用方式。     

超声和酸化对猪粪中Cu、Zn去除的影响

为了探讨利用超声和酸化来去除猪粪中的重金属,本文采用含固率为3％的猪粪溶液研究了超声和酸对其中cu、zn的去除以及影响因素。结果表明：酸可以去除猪粪中的cu、zn,且随着酸溶液加入量和JJn／k无机酸后反应时间的增加,猪粪中cu、zn的去除率提升,在猪粪溶液中加入酸调pH达到0．70,反应3h后猪粪中cu、zn的去除率可以达到58．70％、81．85％;超声也可以去除猪粪中的cu、zn,随着超声频率和超声时间的增加,猪粪中cu、zn的去除率提升,在40kHz超声90min,猪粪中cu、zn的去除率可分别达到87．43％、76．48％。超声与酸结合作用时,猪粪中cu、zn的去除率大于单独用酸或超声时的去除率。     

天然沸石对猪场厌氧发酵液中氨氮吸附作用的试验研究

为达到利用人工湿地处理高氨氮污水的目的,采用天然沸石作为人工湿地基质,对比研究了天然沸石对NH4Cl溶液和猪场厌氧发酵液中氨氮的等温吸附特征、吸附动力学过程,考察了吸附时间、氨氮初始浓度、沸石用量对沸石吸附氨氮的影响。结果表明,Freundlich方程较Langmuir方程能更为准确地描述天然沸石对两种水质中氨氮的等温吸附特征;在两种水质中,单分子层饱和吸附量分别为16.20mg·g-1和3.85mg·g-1。天然沸石对氨氮的吸附作用受吸附时间、氨氮初始浓度及沸石用量影响较大,在两种水质中,沸石对氨氮的吸附过程在0～8h内均随时间显著上升,到48h时达到吸附平衡;当采用NH4Cl溶液时,初始氨氮的浓度由10mg·L-1增加到500mg·L-1时,平衡吸附量由0.19mg·g-1增加到5.91mg·g-1;当采用猪场厌氧发酵液时,初始氨氮的浓度由39.4mg·L-1增加到502.9mg·L-1时,平衡吸附量由0.63mg·g-1增加到3.20mg·g-1;增加沸石用量,可以提高氨氮的去除率,但单位质量沸石的氨氮吸附量随之降低。准二级动力学可以很好地描述天然沸石吸附两种水质中氨氮的动力学过程;由模型得出的天然沸石对氨氮的平衡吸附量与试验所得最大吸附量偏差范围分别为5%～11%和2.9%～5.4%。     

规模化养猪场处理废水对水稻产量形成和稻米品质的影响

利用田间小区试验,以镇稻99和养猪场无害化处理的粪水为供试材料,研究了养猪场处理粪水替代化学氮肥模式对水稻产量及构成因子和稻米主要品质性状的影响。结果表明：各生育期干物质积累与产量间呈二次曲线关系且极显著正相关;养猪场粪水替代常规施氮量的40%、70%和100%均可实现常规施肥的产量,其中施用189m.3hm-2粪水替代常规施氮量70%氮化肥处理的产量最高（615.20kg.666.7m-2）,较空白对照和常规化肥处理分别提高28.38%～49.13%和3.1%～6.6%。在籽粒品质方面,与常规施氮处理相比,施用猪粪水替代氮化肥可以提高稻米籽粒的糙米率、精米率、整精米率和蛋白质含量,同时直链淀粉含量下降。其中,糙米率和整精米率均以40%H处理最高,与常规施肥相比均提高了5.9%;籽粒蛋白质含量在替代比例为40%和70%时,随着粪水施用量的减少而降低,在100%替代氮肥时,中量粪水处理的蛋白质含量最高;籽粒直链淀粉含量在各替代比例下均表现出随着粪水施用量的减少而增加。在本试验条件下,综合考虑产量、经济效益和环境效益的适宜猪粪水替代氮化肥施用模式为70%M处理。     

SE—Structures and Environment: Biofiltration of Odour and Ammonia from a Pig Unit—Biofiltration of Odour and Ammonia from a Pig Unit—a pilot-scale Study

A pilot-scale biofiltration unit was constructed at a pig finishing building on the University College Dublin research farm. The biofiltration system was investigated over three trial periods. Exhaust air from a single pen was extracted by a variable speed centrifugal fan and passed through a humidifier and biofilter. A 0·5 m depth of woodchips of over 20 mm screen size was used as the biofilter medium. The moisture content of the medium was maintained at 64±4% (wet weight basis) for trial one and 69±4% (wet weight basis) for trials two and three using a load cell method. The volumetric loading rate varied from 769 to 1898 m³ [air] m⁻³ [medium] h⁻¹ during the three trial periods. Odour and ammonia removal efficiencies ranged from 77 to 95% and 54 to 93%, respectively. The pH of the biofilter leachate remained between 6 and 8 throughout the experimental periods. The pressure drop across the biofilter ranged from 14 to 64 Pa. It is concluded that a wood chip media particle size >20 mm is suitable for use in biofiltration systems on intensive pig production facilities. This will minimize the pressure drop on the system fans to reduce overall operation costs. It is recommended that a filter bed moisture content (wet weight basis) of greater than 63% be used to maintain overall efficiency. An efficient air moisturizing system (humidification and bed sprinkling) along with a properly designed air distribution system must be incorporated in the overall design when operating at such high volumetric loading rates.     

8个猪种和野猪H-FABP基因分子标记与IMF含量的关系

利用PCR-RFLP（Hinf Ⅰ、HaeⅢ和MspⅠ）分子标记技术,检测了杜洛克猪、长白猪、大白猪、内江猪、荣昌猪、汉江黑猪、汉中白猪、八眉猪和野猪共计265头猪H-FABP基因5＇-上游区和第二内含子区的遗传变异,并利用最小二乘模型分析了H-FABP基因对猪肌内脂肪（IMF）含量的遗传效应.结果表明：（1）在Hinf Ⅰ-RFLP位点上,上述品种和野猪均存在多态性,其中大白猪、八眉猪、汉江黑猪、汉中白猪和野猪表现为低度多态（多态信息含量（PIC）小于0.25）,杜洛克、长白猪、内江猪和荣昌猪为中度多态（PIC介于0.25和0.5之间）;（2）除汉江黑猪（P＜0.05）和野猪（P＜0.01）外,其它猪种基因频率和基因型频率都处于Hardy-Weinderg平衡状态（P＞0.05）;而在HaeⅢ-RFLP和MspⅠ-RFLP位点上,仅内江猪、荣昌猪、汉江黑猪和八眉猪为单态;（3）9种基因型对IMF含量的影响,HH＞Hh＞hh,DD＜Dd＜dd,AA＜Aa＜aa,遗传效应值分别为：3.89、3.42、3.17、2.27、2.49、2.91、2.28、2.70和2.95,H-FABP基因可显著地提高猪IMF含量（P＜0.05）.结果提示：可通过提高“aa-dd-HH”基因型的频率来增加IMF含量,达到改善猪肉质的目的.     

辽宁省育肥猪生产环境影响的生命周期评价

采用生命周期评价方法,以1 000 头出栏育肥猪的规模化养殖场为功能单位,对辽宁地区育肥猪生产进行污染物排放清单分析,评价其环境影响。结果表明,1 000 头育肥猪生产的生命周期环境影响综合指数为56.59,环境影响大小依次为富营养化、酸化、全球变暖,环境影响指数依次为36.31、13.84和6.44;富营养化影响主要来源于猪粪尿中氮、磷的排放,酸化影响主要来源于猪粪尿中NH3的排放,全球变暖影响主要来源于种植饲料作物使用的化肥生产过程中NOx的排放。因此,加强养猪粪污无害化处理,促进养殖业废物资源化,增加育肥猪饲料中青饲料比例,提高饲料作物生产过程中化肥利用率是降低辽宁地区育肥猪生产环境负荷的主要措施。     

养猪发酵床垫料有机肥对辣椒产量及土壤微生物多样性的影响

随着环保压力的日益增加和农户环保意识的逐渐增强,发酵床养猪技术逐渐被农户接受,但是发酵床熟化垫料再利用难,而限制了发酵床养猪技术的推广。本研究将两种发酵床熟化垫料分别进行高温堆肥形成有机肥,总养分(氮、磷、钾)含量均超过50g/kg,重金属和粪大肠杆菌含量均未超标,蛔虫卵死亡率95%以上,完全可以作为成熟的有机肥产品。试验表明,在等氮量施用条件下,发酵床熟化垫料有机肥施用后青椒产量也能达到化肥和常规有机肥的产量,并能提高青椒品质,改善土壤肥力,提高土壤中矿质态氮的效果。PCR-DGGE结果表明,细菌群落结构分为三大类,对照(CK)和化肥(CF)处理群落结构相似,常规猪粪有机肥(POF)单独一类,两种发酵床熟化垫料有机肥(FOF和ROF)群落结构相似,结果表明施肥能够改变土壤中微生物多样性,施用有机肥(POF、FOF、ROF)对土壤微生物多样性改变的效果比化肥(CF)大;不同来源的有机肥(POF和FOF、ROF)对土壤中微生物区系改变方向不一样,来源接近的有机肥(FOF和ROF)对土壤微生物区系改变方向接近。     

养猪发酵床垫料有机肥对辣椒产量及土壤微生物多样性的影响

随着环保压力的日益增加和农户环保意识的逐渐增强,发酵床养猪技术逐渐被农户接受,但是发酵床熟化垫料再利用相对较难,限制了发酵床养猪技术的推广。本研究将两种发酵床熟化垫料分别进行高温堆肥处理,熟化垫料总养分(氮、磷、钾)含量均超过50 g/kg,重金属和粪大肠杆菌含量均未超标,蛔虫卵死亡率95%以上,符合商品有机肥标准。作物试验表明,在等氮量施用条件下,发酵床熟化垫料有机肥施用后辣椒产量与化肥和常规有机肥处理相当,并能提高辣椒品质,改善土壤肥力。PCR-DGGE结果表明,不同处理土壤细菌群落结构可大致分为3种类型,对照(CK)和化肥(CF)处理群落结构相似,为第一类;常规猪粪有机肥(POF)为第二类;两种发酵床熟化垫料有机肥(FOF和ROF)群落结构相似,为第三类。施肥处理能明显改变土壤微生物多样性,施用有机肥(POF、FOF、ROF)对土壤微生物多样性改变的效果比化肥(CF)大;不同来源的有机肥(POF和FOF、ROF)对土壤中微生物区系改变方向不一样,来源接近的有机肥(FOF和ROF)对土壤微生物区系改变方向接近。