传统药用菌蝉花退化菌株虫体活体复壮的研究

选择不同退化程度的蝉棒束孢（Isaria cicadae）菌株,用柞蚕蛹（Antheraea pernyi）和大蜡螟（Galleria mellonella）作为替代寄主进行复壮,并对复壮后的菌株进行了栽培验证实验。结果表明,蚕蛹复壮效果优于大蜡螟,但是复壮周期较后者长1倍。所有菌株均能通过注射接种侵染蚕蛹,但菌株退化程度不同对蚕蛹的侵染力不同;侵染大蜡螟的方法不同,其效果有显著差异,菌液浸蘸法优于固体培养物接触法。退化严重的菌种通过虫体复壮难以恢复产孢梗束能力。     

蝉棒束孢菌的生物学活性研究进展

蝉棒束孢菌（Icaria cicadae Miq．）是中药蝉花（Cordyceps ciecadae Shing）的无性型,作为一种功能食品被用于预防和治疗多种疾病,具有广阔开发利用前景。从蝉棒束孢菌化学成分、生物活性及发酵生产等方面的研究现状进行概述,探讨了该研究领域的发展前景。     

蝉花虫草多糖脱蛋白研究

蝉花虫草粗多糖中杂有蛋白、核酸、酚类等物质,给多糖的分离纯化带来许多干扰,为了排除杂质干扰,获得较为纯净的多糖组分,采用Sevag法和大孔树脂吸附法相结合对蝉花虫草粗多糖进行了脱蛋白试验。结果表明:采用大孔树脂法或Sevag法均不能完全去除粗多糖中的游离蛋白,两种方法结合脱蛋白除杂效果较为理想,蛋白去除率达96%以上。初步分离获得大孔树脂水相洗脱部位和20%乙醇洗脱部位2种主要多糖组分。综合分析,先用Sevag法脱蛋白2~3次,再用大孔树脂AB-8吸附分离,或先大孔树脂AB-8吸附分离获得不同多糖组分,再用Sevag法辅助脱蛋白1~2次,两种方法去除蝉花虫草粗多糖中蛋白的效果均较好。     

白纹象沫蝉线粒体基因组及系统发育分析

【目的】分析白纹象沫蝉(半翅目：尖胸沫蝉科)的线粒体基因组结构和沫蝉总科的系统发育关系,为更好地理解沫蝉总科的进化关系提供依据。【方法】利用高通量测序技术分析了白纹象沫蝉的线粒体基因组结构,并基于沫蝉总科已有的线粒体基因组数据采用最大似然法和贝叶斯法构建了系统发育关系。【结果】白纹象沫蝉线粒体基因组全长为15 091 bp(GenBank序列号：OQ682615),包含37个基因(13个蛋白质编码基因、2个核糖体RNA基因和22个转运RNA基因)和一段非编码控制区;13个蛋白质编码基因的起始密码子均为ATN;3个蛋白质编码基因cox2、cox3和nad4具有不完整的终止密码子T,其余10个蛋白质编码基因具有完整的终止密码子TAA或TAG;除trnS1因缺少DHU臂而无法构成稳定的三叶草结构外,其余tRNA基因均能形成典型的三叶草结构;rrnL基因的全长为1 217 bp, AT含量为80.7%;rrnS基因的全长为775 bp, AT含量为80.5%。最大似然法和贝叶斯法构建的系统发育树基本一致,均显示尖胸沫蝉科为非单系群。【结论】本研究获得了象沫蝉属昆虫第一条线粒体基因组全序列;尖胸...     

纤维素降解细菌的分离、鉴定及其系统发育分析

采用选择性培养基从不同地区土壤中筛选得到具有纤维素分解能力的菌株共65株,从中选取纤维素降解能力较高的细菌1株并对其进行表型、生理生化和分子鉴定。结果表明株菌NJ2-008属于不动杆菌属（Acinetobacter）,与乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoacetirum）的序列相似度达98%。     

一株高耐镉菌株的分离、鉴定及系统发育分析

采用梯度浓度驯化方法,从极度重金属污染环境的土壤中取样分离、纯化1株具有较强镉耐受性的菌株(编号为LY29-1-5)。经菌落、菌体形态观察、生理生化及系统发育分析,该菌株初步鉴定为大肠杆菌(Escherichia coli)。该菌株能耐受镉离子的最高浓度为15 mmol/L,在最低抑制浓度试验中,该菌株对铅、铜、锌也表现出了一定的耐受性。     

蝉棒束孢交配型基因MAT的群体分布特征

【目的】探明药用真菌蝉棒束孢Isaria cicadae的交配型基因MAT的群体分布特征及其对蝉花有性生殖的影响,为提高蝉花的生殖率提供参考。【方法】从全国7省12市采集的100份蝉花标本中分离培养菌种,经形态观察、显微鉴定和ITS序列分析,获得各蝉花的无性型菌株;从各菌株DNA中克隆并分析MAT1-1-1和MAT1-2-1序列的结构和分布特征。【结果】在100株菌株中,13株菌株仅有1MAT1-1-1,79株菌株仅有MAT1-2-1,8株菌株兼有2个序列。2MAT1-1-1(缺HMGɑ-box)极少与1MAT1-1-1共存,常与MAT1-2-1伴存,但FJDH7和FJDH9菌株同时存在1MAT1-1-1、2MAT1-1-1和MAT1-2-1序列。聚类分析未发现MAT基因的地域分布相关性。【结论】群体中不同蝉棒束孢菌株的MAT基因有4种可能,兼有3种序列菌株的检出率极低,推测与蝉花有性生殖概率极低的现状有关。     

水开菲儿中一株细菌纤维素生产菌株的分离鉴定及系统发育分析

水开菲儿是国外非常流行的一种软性发酵饮料,其中的开菲儿粒子是透明和柔软的,主要包括了细菌、酵母两类微生物的共生体系,共生体系中包含了许多对人体健康有益的乳酸菌和酵母菌,如植物乳杆菌、明串珠菌,干酪乳杆菌、乳酸乳球菌、酿酒酵母、毕赤氏酵母等[1,2].这个共生体系是独特的和非常稳定的,而且不包含对人体有害的病源微生物.     

不同来源蝉棒束孢遗传异质性研究

蝉棒束孢是一种昆虫病原真菌,也是传统的中药材料,广泛分布于世界各地.利用ISSR-PCR分子标记技术对采集自不同地理位置的42株蝉棒束孢遗传异质性进行分析,9个引物共得到141个特异性条带,其中多态位点比率为94.7％.从种群水平上来看,宣城敬亭山种群(Pop A)的遗传多样性最高,达到81.6％,安徽石台县种群(PopF)的遗传多样性最低,只有27.0％.其中种群内遗传多样性(Hs)为0.2168,Nei基因分化系数(Gst)为0.276 3,不同地方的种群间的平均基因流(Nm)较大,为1.309 8.研究表明,蝉棒束孢遗传谱系是随机分布的,与地理来源没有明显的相关性,不同地理来源的种群间较高水平的基因交流是种群遗传变异的主要原因.     

条石鲷烂尾白浊症病原菌的分离鉴定及系统发育分析

从患烂尾白浊症的条石鲷肾脏和肝脏等病变组织分离出致病力较强的菌株TP0701,人工感染实验证实该菌株为条石鲷的病原菌。对该细菌进行了形态、生理生化特性测定和16S rRNA分子鉴定,测定16SrRNA基因序列,分析相关细菌相应序列的同源性,构建了系统进化树。结果表明菌株TP0701与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的亲缘关系最近,具有98.1%的同源性。结合该菌株的生理生化特性,可鉴定菌株TP0701为恶臭假单胞菌。     

广东省鹅细小病毒的分离及序列分析

从广东省鹅主要养殖区分离出2株鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV),分别命名为GDQY2017和GDYJ2017,纯化后测序分析。VP基因的系统发育分析结果表明,2株GPV单独形成一个分支,与疫苗株距离较远。选择压力分析结果表明,分离株的1位点有强烈的净化选择。氨基酸分析结果显示,与疫苗株相比,分离的GPV菌株含有22个不同的氨基酸残基,并且具有阳性选择的位点(Arg116Gln)。     

条石鲷烂尾白浊症病原菌的分离鉴定及系统发育分析

从患烂尾白浊症的条石鲷肾脏和肝脏等病变组织分离出致病力较强的菌株TP0701,人工感染实验证实该菌株为条石鲷的病原菌。对该细菌进行了形态、生理生化特性测定和16S rRNA分子鉴定,测定16SrRNA基因序列,分析相关细菌相应序列的同源性,构建了系统进化树。结果表明菌株TP0701与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的亲缘关系最近,具有98.1%的同源性。结合该菌株的生理生化特性,可鉴定菌株TP0701为恶臭假单胞菌。     

藏鸡NDV的分离鉴定及F基因的遗传进化分析

【目的】探讨藏鸡NDV的毒力和F基因的遗传进化特征。【方法】从采集的藏鸡病料中分离鉴定NDV,通过测定鸡胚平均致死时间（MDT）和1日龄雏鸡脑内接种致死指数（ICPI）来确定分离株的毒力。采用RTPCR方法克隆藏鸡NDV分离株F基因,测序后进行序列分析,并进行进化分析。【结果】共分离鉴定出F5、FX10、F20、F74、F75、F17、F72、FH2等8株NDV,其中F17、F72、FH2为强毒株,其余5株为弱毒株。8株病毒F基因ORF均为1 662 bp,编码553个氨基酸,强毒株ORF编码产物含有12个半胱氨酸残基,弱毒株有13个半胱氨酸残基,比强毒株在27位(强毒株C²⁷变为R²⁷)多了1个半胱氨酸残基;有6个潜在的糖基化位点。分离的8株NDV与GenBank中发表的20株NDV参考毒株比较结果表明,F蛋白氨基酸序列变异位点较多,主要集中在8-30,97-124,45,385-386,402-403,479-494,509-520位氨基酸处,强毒株AA替代较集中,而弱毒株保守区较多且AA替代较分散。分离NDV株之间F基因编码区核苷酸序列同源性为83.5%～99.9%,其中强毒株之间同源性为95.2%～99.4%,弱毒株之间同源性为99.4%～99.9%。分离NDV株之间F基因编码的氨基酸同源性为87.5%～99.5%,其中强毒株之间同源性为95.3%～98.2%,弱毒株之间同源性为98.6%～99.5%。进化分析显示,3株强毒株均为基因Ⅶ型,5株弱毒株均为基因Ⅱ型。【结论】分离了8株藏鸡NDV,其中3株为强毒株,属于基因Ⅶ型;5株为弱毒株,属于基因Ⅱ型。     

艾叶内生放线菌的分离、系统发育及相关特性研究

从艾叶药用植物中共分离得到19株内生放线菌,对这些菌株分泌胞外淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶特性以及拮抗农作物病原菌和人类病原菌活性进行了研究,并对部分活性菌株进行了16SrDNA系统发育分析。结果表明:在这19株内生放线菌中,具有产胞外淀粉酶活性的菌株11株,产蛋白酶活性的菌株11株,产纤维素酶活性的菌株8株;拮抗活性试验显示,有2株菌对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schw.)、水稻胡麻斑病菌[Bipolaris oryzae(Breda deHaan)Shoem]和肠球菌(Enterococcus sp.)具有拮抗活性,3株菌对耐青霉素类金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)具有拮抗活性。对其中的3株菌进行了16SrDNA系统发育分析,该3株菌均属于糖霉菌属,菌株IF11、IXS和IF22均同时与Glycomyces mayteni YIM61331T、Glycomyces sambucusE71T、Glycomyces scopariae YIM56256T亲缘关系最近,序列相似性分别为98.3%、98.3%和98.1%。     

1株黑斑蛙源蛙病毒的分离鉴定及系统进化分析

【目的】为探究四川某养殖场黑斑蛙Rana nigromaculata蝌蚪爆发传染病病因。【方法】通过对患病蝌蚪进行病理学检查与病毒分离,并结合人工感染试验、电镜观察、PCR检测和系统发育分析对分离的病原进行鉴定。【结果】黑斑蛙患病蝌蚪主要临床特征为体表出血、腹部肿胀、腹腔内淡黄色腹水;组织病理学上,患病蝌蚪肝、肾、脾与胰腺等组织器官受损,出现明显的变性与坏死病灶,且在一些病变细胞胞浆内见嗜碱性包涵体。患病蝌蚪组织匀浆接种鲤鱼上皮瘤(EPC)细胞,25℃培养4 d后出现明显细胞病变效应(CPE),TCID50为108 mL–1。用病毒液进行人工感染试验,感病蝌蚪表现出与自然患病蝌蚪相似的症状,死亡率达到80%,证实分离病毒的病原性。电镜观察发现,病毒颗粒为正六边形,有囊膜,对角线直径(135±8) nm,在胞质中呈晶格状排列或游离状。针对蛙病毒MCP基因的PCR检测显示,自然患病蝌蚪、饲养水源以及分离病毒均为阳性,基于MCP全序列的遗传进化分析发现,分离病毒与蛙病毒属病毒的相似性在99%以上,且与蛙病毒属FV3病毒类群聚为同一分支。【结论】证实导致此次黑斑蛙蝌蚪大量死亡的病原为蛙病毒属病毒,将其命名为黑斑蛙蛙病毒(Rana nigromaculata ranavirus,RNRV)。     

牛分枝杆菌广西分离株ESAT-6基因鉴定及遗传进化分析

根据GenBank中牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis,M.bovis）的ESAT-6基因序列（No：BX248347）设计1对引物,PCR扩增获得2株牛分枝杆菌广西分离株（mt359、mt370）,纯化产物与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,对经双酶切和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序及同源性比较分析。结果表明,牛分枝杆菌广西分离株mt359、mt370与GenBank中已发表的6株毒株（5株结核分枝杆菌和1株牛分枝杆菌）的核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性均为100.0%,与牛分枝杆菌标准株C680001的核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性均为96.6%。说明致病性牛分枝杆菌的ESAT-6基因十分保守,不存在种间差异。     

一株从原蚕分离的微孢子虫的生物学特性及其系统发育分析

[目的]研究从广西蚕种繁育中分离获得的微孢子虫,调查其感染性和分类地位,为蚕种生产掌握病原来源及有效控制家蚕微粒子病流行提供参考依据.[方法]采用生物试验测定从蚕种生产一线分离获得微孢子虫(GXM14)对家蚕的半数感染浓度(IC50)和胚种传染率,显微镜观察其孢子形态,采用吉姆萨染色法观察孢子的生活史;通过PCR扩增及测序获得GXM14的SSU rRNA基因序列和ITS序列,并利用MEGA 5.0和DNASTAR中的Megalign构建系统发育进化树及进行相似性和遗传距离分析.[结果]GXM14孢子呈卵圆形,大小为(1.68±0.15)μm×(3.06±0.15)μm,其孢子生活史中有双核,以二分裂方式进行增殖,符合Nosema属的特征.GXM14对家蚕的IC50为3.53×105个/mL,是家蚕微孢子虫(N.b)的5.8倍;对家蚕的胚种传染率为5.0%,只是N.b的1/9.GXM14的SSU rRNA基因序列长度1226 bp,G+C含量为34.42%;ITS序列长度503 bp,G+C含量为29.82%.GXM14的SSU rRNA基因序列与甜菜夜蛾微孢子虫(Nosema sp.SE)SSU rRNA基因序列(KT336240.1)的遗传距离为0.2,相似度达98.9%,即GXM14与甜菜夜蛾微孢子虫(KT336240.1)的亲缘关系很近.基于微孢子虫ITS序列的相似性和遗传距离分析结果表明,GXM14与12株已知No-sema属微孢子虫的相似度均低于91.0%,而遗传距离在4.0以上,证实GXM14是一种新的微孢子虫,故将其暂命名为Nosema sp.GXM14.[结论]从蚕种生产一线分离获得的家蚕病原性微孢子虫(GXM14)属于Nosema属,与N.b同属异种,是一株新的微孢子虫,可能是野外昆虫微孢子虫交叉感染家蚕的病原.因此,在蚕种繁育中加强防虫杀虫,防止昆虫微孢子虫污染桑叶交叉感染家蚕,是控制家蚕微粒子病暴发流行的重要措施.     

鳜致病性嗜水气单胞菌GYK1株的鉴定、毒力及溶血性

从患溃疡病的鳜肾脏中分离出一株病原细菌编号为GYK1。此株病菌人工感染鳜、银鲫、剑尾鱼,实验鱼出现出血、肌肉坏死或溃疡症状;腹腔注射攻毒,对鳜、银鲫、剑尾鱼、小鼠的半致死剂量(LD50)分别为8.33×104、1.06×105、1.26×105、1.05×106CFU/g;菌培养液上清能溶解鳜、加洲鲈、银鲫、小鼠、兔、绵羊、人O型血等的红细胞,在绵羊血平板上为β 溶血,不同代次和保存条件的细菌溶血性稳定。细菌在电镜下的形态、生化特性和ID32E系统自动鉴定的结果均符合嗜水气单胞菌的特征;PCR扩增检测到嗜水气单胞菌特异性的毒力基因气溶素基因(aerA)209bp片段,进一步说明此株病原细菌为含有毒力基因的嗜水气单胞菌。实验结果表明,GYK1是一株毒力和溶血性均较强的嗜水气单胞菌。     

鳜致病性嗜水气单胞菌GYK1株的鉴定、毒力及溶血性

从患溃疡病的鳜肾脏中分离出一株病原细菌编号为GYK1。此株病菌人工感染鳜、银鲫、剑尾鱼,实验鱼出现出血、肌肉坏死或溃疡症状;腹腔注射攻毒,对鳜、银鲫、剑尾鱼、小鼠的半致死剂量(LD50)分别为8.33×104、1.06×105、1.26×105、1.05×106CFU/g;菌培养液上清能溶解鳜、加洲鲈、银鲫、小鼠、兔、绵羊、人O型血等的红细胞,在绵羊血平板上为β 溶血,不同代次和保存条件的细菌溶血性稳定。细菌在电镜下的形态、生化特性和ID32E系统自动鉴定的结果均符合嗜水气单胞菌的特征;PCR扩增检测到嗜水气单胞菌特异性的毒力基因气溶素基因(aerA)209bp片段,进一步说明此株病原细菌为含有毒力基因的嗜水气单胞菌。实验结果表明,GYK1是一株毒力和溶血性均较强的嗜水气单胞菌。