人促红细胞生成素基因和AcGFP1共表达真核表达载体的构建及鉴定

摘要：为构建重组人红细胞生成素（hEPO）真核表达载体，应用PCR及人工合成方法获得除第一内含子的hEPO基因组基因，并将其插入载体pIRES2-AcGFP1，成功构建hEPO基因和AcGFP1共表达载体phEPO-IRES-AcGFP1，然后用脂质体法使该载体转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）及山羊成纤维细胞，于转染后48h在荧263光显微镜下观察到绿色荧光。经G418筛选，在荧光显微镜下发现成簇的绿色荧光细胞，说明重组质粒被成功导入细胞并表达AcGFP1，为鉴定hEPO转染成功与否及阳性细胞筛选提供了方便。     

表达GFP和gpt基因的重组CVI988病毒的构建

以马立克氏病病毒（MDV）CVI988株基因组为模板,利用PCR技术扩增出约2.7和3.0 kb的基因片段,将上述片段同时插入pUC19中,获得约5.5 kb MDV同源重组臂;以该基因片段的US2区的BglⅡ为插入位点,分别插入基因表达盒CMV-gpt-ployA和CMV-gfp-polyA,构建转移载体pUS-gpt-GFP,将该载体瞬时转染CHO细胞,在荧光显微镜下,可以观察到绿色荧光蛋白的表达;将该转移载体转染已用MDV CVI998株感染的次代CEF细胞,利用MX-HAT培养基筛选重组病毒,并用荧光显微镜挑选表达绿色荧光蛋白的蚀斑,结果获得重组病毒rMDVgptGFP。通过PCR检测和病毒生长测定,证明重组病毒获得纯化。     

中华鼢鼠卵透明带3基因(mZP3)真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达

卵透明带3(zona pellucida 3,ZP3)蛋白是精卵结合最重要的受体。为了构建中华鼢鼠(Myospalax fontanierii)卵透明带3(mZP3)基因真核表达载体,本研究利用PCR方法得到加入酶切位点的mZP3片段,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,体外转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO cell)和尾静脉注射昆明小鼠(Mus musculus)体内,利用RT-PCR和Western bolt技术检测其表达情况。双酶切和基因测序鉴定结果表明,所构建的表达载体是pEGFP-mZP3;倒置显微镜观察到发绿色荧光的成功转染的细胞;RT-PCR和Western bolt检测结果表明,目的基因mZP3在CHO细胞中成功表达,并且小鼠肝脏内也检测到目的基因。研究结果表明,卵透明带3基因能够在CHO真核细胞内表达,为后期基因疫苗防治中华鼢鼠提供依据。     

真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA的构建及其在猪成纤维细胞的表达

α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义。本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,将其转染至猪(Susscrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人α-LA的细胞。根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2-Zs Green1真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2-Zs Green1-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了pIRES2-Zs Green1-opLA和pIRES2-Zs Green1空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到。本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞。     

绿色荧光蛋白与黄瓜花叶病毒运动蛋白融合基因的构建及在大肠杆菌中的表达

采用重组－PCR方法，扩增获得绿色荧光蛋白（GFP）与黄瓜花叶病毒运动蛋白（CMV MP）融合基因，将其克隆到pKEN上，构建了该融合基因的原核表达载体pKENG-M。SDS－PAGE及免疫印迹分析显示，57kD的融合蛋白基因在大肠杆菌DH5α中正确表达，激光共聚焦显微镜分析表明，在488nm光激发下，菌体呈亮绿色，表明融合蛋白保持绿色荧光特性。实验结果为进一步研究CMV MP的功能及其与胞间连丝和其他细胞成分的作用关系奠定了基础。     

NDV-F基因稳定表达P815细胞株的建立

在成功地构建NDV-F基因真核表达载体pCDNA3-NDV-F的基础上,应用脂质体LipofectamineTM2000介导使其转染小鼠肥大细胞瘤细胞株（P815）,以G418加压筛选（600μg/ ml）得到稳定的克隆并扩大培养成系。应用Trizol法提取细胞RNA,经RT-PCR鉴定,转染细胞在1600bp处出现目的条带。收集转染细胞,经Western blot和免疫荧光法检测到目的蛋白的表达。进一步将获得的细胞株在液氮中冻存6个月以检测其稳定性,实验证明该细胞株仍能很好的表达F基因。本实验采用脂质体法已成功建立了能够稳定表达NDV-F基因细胞株,为进一步研究ND核酸疫苗的效果奠定良好的实验基础。     

香蕉MaROP1基因表达产物的亚细胞定位

植物类Rho相关G蛋白（Rho-related GTPases from plants,ROP）属于小G蛋白超家族,是高等植物体内广泛存在的一类重要信号分子,在植物生长发育过程中起着关键的调控作用。本实验室从香蕉果实采后抑制差减杂交文库中获得一个香蕉ROP基因,命名为MaROP1。半定量RT-PCR表明该基因在香蕉的根、球茎、叶、花和果实中的表达存在差异,其中在球茎中的表达量最高且与其它器官的表达差异显著。为进一步研究该基因的功能,构建了以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）为报告基因的融合植物表达载体pCAMBIA1302-MaROP1,并利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,荧光显微镜检测表明该基因表达产物定位在细胞膜上。     

新城疫病毒（NDV）-F基因（NDV-F）稳定表达P815细胞株的建立

在成功构建新城疫病毒(NDV)-F基因真核表达载体pCDNA3-NDV-F的基础上,应用脂质体LipofectamineTM2000介导法,将其转染小鼠肥大细胞瘤细胞株(P815),经过加入G418(600 靏/mL),筛选得到稳定的细胞克隆株,并进一步扩大培养.应用Trizol法提取细胞RNA,经RT-PCR鉴定,转染细胞提取物在1 600bp处出现目的条带.收集转染细胞,经Westernblot和免疫荧光法检测到表达的目的蛋白.将获得的细胞株在液氮中冻存6个月后检测,该细胞株仍能很好表达NDV-F基因,表明其具有高度稳定性,证明采用脂质体法已成功地建立了能够稳定表达NDV-F基因的细胞株.     

马立克氏病病毒CVI988株病毒囊膜糖蛋白B启动子的克隆及活性分析

为了选择适宜的启动子调控外源基因的表达,以改善马立克氏病毒对载体的重组病毒的免疫保护力,克隆了马立克氏病病毒(MDV)CVI988株病毒囊膜糖蛋白B(gB)启动子,通过测序分析发现克隆的gB启动子与GenBank上发表的MDVGA株序列的同源性为99.5%。分别以β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)和虫荧光素酶(luciferase)为报告基因,构建pSK-gB-LacZ和pgB-Luc真核表达载体。将pSK-gB-LacZ转染的中国地鼠卵巢(Chinesehamsterovary,CHO)细胞进行染色,出现蓝色,说明在CHO细胞中,MDVgB启动子可以有效地调控lacZ基因的转录。在CEF细胞中,利用虫荧光素酶系统将gB启动子与SV40及hCMV启动子进行活性比较,发现hCMV启动子的活性为gB启动子的31倍,SV40启动子为gB启动子的27倍。     

稳定表达Wnt3a基因的猪胰腺干细胞株的建立

Wnt3a是经典Wnt通路上游的一个重要分泌蛋白,Wnt3a蛋白的活化可促进多种细胞的增殖和分裂。为了揭示Wnt3a在猪胰腺干细胞(PSC)增殖及分化中的调控机理,采用RT-PCR从pGKS2P(+)-Wnt3a质粒中扩增出Wnt3a全长片段,将测序正确的Wnt3a连接到带有水母绿色荧光蛋白(AcGFP1)报告基因的真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,构建重组质粒。经EcoRⅠ/BamHⅠ酶切鉴定后,用脂质体转染至猪PSC。用抗生素G418筛选3周后获得稳转pIRES2-AcGFP1-Wnt3a的细胞株。荧光显微镜下观察到几乎所有细胞表达绿色荧光蛋白。RT-PCR和Western blot的结果显示,稳转Wnt3a组的猪PSC中Wnt3a mRNA及蛋白表达水平比对照组明显升高。这些结果表明,稳定表达Wnt3a的猪胰腺干细胞株成功建立,为进一步研究Wnt3a在猪PSC增殖及分化中的作用机理提供了基础资料。     

ipt基因促进矮牵牛遗传转化效率及热激启动子驱动基因删除

本研究主要探讨ipt基因对矮牵牛遗传转化不定芽诱导影响及拟南芥热激启动子hsp18.2驱动重组酶基因flp的热诱导外源基因删除表达载体在矮牵牛中的基因删除效果。本研究中将植物表达载体pBin-hsp18.2：flp-35S：ipt及对照载体pBin-hsp18.2：flp遗传转化矮牵牛,以获得转基因植株,分析比较不定芽的诱导和转基因植株进行的热激基因删除。研究结果表明,ipt基因可促进矮牵牛遗传转化过程中不定芽的诱导,其不定芽诱导率为21.5%,显著高于对照的8.7%。在44℃,6h,热激6次的条件下,转基因矮牵牛植株表型恢复正常,经GUS蛋白表达分析及PCR、RT-PCR检测,证明外源基因已经被删除。转基因矮牵牛基因删除效率最高可达43.8%。本研究为ipt基因在一些遗传转化困难植物转基因中的应用奠定了基础。     

番茄GRX基因家族的鉴定及表达分析

GRX基因家族是从原核生物到真核生物中普遍存在的一类巯基-二硫键氧化还原酶,在植物的生长发育、器官构建及逆境胁迫和激素信号应答中均发挥重要作用.本研究在番茄基因组范围内,利用生物信息学方法对番茄的GRX基因组家族的成员、分布及结构和功能等进行分析.预测结果显示,番茄GRX家族包含55个蛋白质,分为4个亚族,其中植物特有的CC亚族成员最多,有35个,其他GRX基因成员与拟南芥GRX家族具有相似分类.在番茄GRX结构域中包含12个重要的基序,主要分布在序列的N端,相同亚族中的GRX成员蛋白序列的氨基酸保守域构成基本一致,且各亚族成员的氨基酸保守域组成特异,表明这些基序的存在对GRX蛋白功能的执行是必需的.利用实时荧光定量PCR对番茄GRX基因的组织表达和胁迫响应分析,结果表明,GRX基因具有组织特异性表达差异,CC型在根和花中表达较高,在果实中表达较低;在盐、SA、ABA、高温和低温胁迫条件下,22个番茄GRX基因的表达模式被阐明;其中部分基因的表达水平被显著地诱导增加或者降低,很可能参与了调控番茄逆境胁迫条件下的防御应答反应.本研究结果将为番茄GRX家族基因的深入研究提供依据,为进一步解析GRX基因功能奠定基础.     

基因融合技术及其应用

基因融合技术以其快捷、高效生产多功能蛋白的优势，近年来在生物学领域中得到了愈来愈广泛的应用，结合本实验室的相关研究，简要综述基因融合技术、影响基因融合的主要因素以及融合基因的主要应用。     

玉米DGAT基因家族的全基因组分析

为了进一步了解玉米中DGAT基因家族,本文利用生物信息学方法对玉米DGAT基因家族进行了鉴定和分类,并对其系统进化、基因结构以及表达模式进行了分析.结果表明:玉米中7个DGAT基因可以分成ZmDGAT1、ZmDGAT2和ZmDGAT3 3个亚组,分布在第4、5、6、9和10这5条染色体上,不同亚组的基因结构和跨膜区有明显差别,其表达也有一定差异,其中ZmDGAT1主要在胚乳中表达,ZmDGAT2表达范围较广,而ZmDGAT3的表达主要集中在叶片.研究明确了玉米中DGAT基因家族的基因结构和表达情况,为了解DGAT基因功能以及进一步提高植物油分含量提供了理论基础.     

五指山猪GH、IGFBP3基因SNPs检测及与生长性状的关联分析

以五指山猪为试验材料,采用PCR-SSCP和测序相结合技术,对GH基因和IGFBP3基因进行多态性检测,并分析其与生长性状（体质量,体高,体长和胸围）的相关性。结果表明,GH基因第2外显子存在一处G→A转换,属沉默突变,该位点与生长性状关联分析显示,BB基因型的体重显著高于AA基因型和AB基因型;IGFBP3基因第2外显子存在一处G→C颠换,属沉默突变,该位点与生长性状关联分析显示,AA基因型的体高显著高于BB基因型;IGFBP3基因第4内含子存在一处碱基C缺失,该位点与生长性状关联分析显示,AA基因型体重显著高于AB基因型和BB基因型。研究将为五指山猪生长发育规律、系统选育及矮小机制等方面研究提供了遗传学依据。     

可供利用的植物基因克隆技术

植物基因工程研究的首要目标是把特定的靶基因从植物基因组或其它生物基因组中分离出来，只要把基因分离并克隆，才有可能了解其遗传信息，然后进行分子操作。本文主树常用图谱克隆基因技术及克隆基因；转座子标鉴克隆基因技术及克隆基因；文库克隆基因技术；基于PCR技术克隆基因；人工合成基因技术进行了综述。     

棉花农杆菌基因转化体系的优化和转苜蓿抗菌肽基因(alfAFP)植株的获得

为了优化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的棉花(Gossypium hirsutumL.)下胚轴切段的基因转化体系,以苜蓿(Medicago sativa L.)抗菌肽基因(alflafa antifungul peptide,alfAFP)为目标,利用γ-葡萄糖甘酸酶基因(gus)和潮霉素抗性基因(Hpt)的检测方法,分析了根癌农杆菌菌种、菌液浓度、浸染下胚轴的时间、共培养中乙酰丁香酮(AS)的浓度、共培养温度和时间等因子对基因转化的影响.优化分析表明,用农杆菌菌株LBA4404,当OD_(600)值为0.5～0.7的菌液浸染5～7日龄的棉花无菌苗下胚轴切段10～15 min.在含200 μmol/L AS的共培养基中21℃暗培养60h,可更有效地提高转化率.经上述条件处理的下胚轴在含50 mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上培养3周可产生转化率最高的愈伤组织.愈伤组织经分化培养获得15株再生棉花,经过PCR和PCR-Southern分析.发现其中12株含有外源基因alfAFP.     

链霉菌(Streptomyces ST66)MalQ基因克隆与原核融合表达

利用PCR方法获得Streptomyces ST66 MalQ基因,将该基因插入原核表达载体pTrc-CKS中,对质粒所含外源片段双向测序,并经BLAST比较分析,发现其与GenBank中报道的Streptomyces coelicolor MalQ基因的同源性高达97%。重组质粒pTrc-MalQ转化大肠杆菌(Escherichia coli)Top10F',经IPTG诱导后以融合蛋白形式表达,SDS-PAGE电泳显示MalQ基因与CKS(CTP:CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonate cytidylyltransferase or CMP-KDO synthetase)基因表达的融合蛋白在目标位置约106kD处有明显条带。经薄层层析分析粗酶液处理的麦芽三糖溶液,证实粗酶液具有麦芽糖转糖基活性。     

胸腺肽基因对胡萝卜的遗传转化

胸腺肽(thymosin)是一种由胸腺分泌的促进淋巴细胞合成和成熟的多肽激素,对于淋巴系统的发育和维持免疫系统的平衡起重要作用(李金屏,1999;张符光和刘佃辛,1996)。市场上广泛使用的胸腺肽主要是从小牛胸腺和猪胸腺中提取制备的。从小牛胸腺和猪胸腺中进行胸腺肽的提取,生产成本     

农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化研究及转TPS1基因和VlmybA2基因玉米鉴定

本研究以优良玉米自交系交51为材料,通过农杆菌介导的茎尖转化将海藻糖-6-磷酸合成酶基因TPS1和葡萄花青素调控基因VlmybA2转入玉米中。确立了最佳的除草剂Basta筛选浓度,研究了不同真空渗透压、农杆菌液浓度、侵染时间等因素在转化过程中对玉米植株存活率的影响。结果表明80 mg/L除草剂Basta为最佳筛选浓度,真空渗透压为60 kPa、农杆菌液浓度OD600为0.8、侵染时间为8 min时是最佳转化条件,经过GUS组织化学染色和PCR检测,证明TPS1基因和VlmybA2基因已经整合到玉米基因组中。