重叠区扩增法合成抗菌肽B基因

人工设计并合成了抗菌肽 B基因的 4个寡聚核苷酸片段 ,通过重叠区扩增法 ,扩增出了相当于抗菌肽基因全长的寡聚核苷酸片段。经克隆测序 ,证明成功地实现了抗菌肽基因的人工合成、拼接和克隆。     

大肠杆菌多重耐药基因AcrA、AcrB内标准DNA的构建

在克隆AcrA、AcrB部分基因片段并进行基因及编码蛋白的同源性分析的基础上，设计合成构建AcrA、AcrB的内标准DNA所需引物，经过3次（12个）PCR成功地合成了AcrA、AcrB的内标准DNA。合成法构建定量RT－PCR内标准DNA快速、成功率高。     

大豆天冬氨酸蛋白酶基因启动子的克隆及其表达活性分析

【目的】克隆大豆天冬氨酸蛋白酶基因(soyAP1)启动子,并对其表达方式及活性进行分析。【方法】利用TAIL-PCR方法从大豆基因组DNA中克隆soyAP1基因启动子片段。利用启动子在线预测工具分析soyAP1基因启动子片段的启动子元件,并用克隆得到的SAP片段替换pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-SAP。通过农杆菌介导法,使其在大豆各组织中进行瞬时表达,用GUS组织化学染色法分析SAP在各组织中的表达活性。【结果】克隆获得了大豆soyAP1基因的启动子片段,长1 650bp,并将之命名为SAP,其转录起始位点可能是553bp处的A;PLACE分析表明,SAP序列中含有多种典型的种子特异性表达元件;GUS组织化学染色显示,SAP驱动的GUS基因在大豆根、茎、叶中基本不表达,但在种子中有较高的表达活性,且表达强度与CaMV35S启动子相近。【结论】大豆SAP启动子可能具有种子特异表达特性。     

衣藻肌动蛋白基因的克隆及核苷酸序列分析

提取衣藻总 DNA,以此为模板并参照肌动蛋白基因编码区端的序列合成寡聚核苷酸引物,进行聚合酶链式反应,扩增到一个1.2 kb 的 DNA 片段.将此片段进行克隆并经分子探针杂交,证明此片段为衣藻肌动蛋白基因.经限制性核酸内切酶处理,构建了衣藻肌动蛋白基因的物理图谱.根据物理图谱进行亚克隆以后,测得了编码区5′端的618个核苷酸的顺序.衣藻肌动蛋白基因的编码序列与高等植物之间的同源性大于90%,高于与高等动物、原生动物及真菌的同源性.但在基因的结构上,衣藻肌动蛋白基因又明显地不同于高等植物,在已经测定的基因片段上,没有发现内含子的存在.经限制性内切酶片段多态性分析,衣藻中含有一个肌动蛋白基因拷贝.     

人CD46基因启动子的克隆和启动特性研究

为研究人CD46(hCD46)基因启动子的启动特性,研制具有hCD46组织特异性表达特征的转基因小鼠,设计扩增hCD46基因启动子的PCR引物,用HeLa细胞基因组DNA为模板扩增hCD46基因启动子DNA片段,测序结果表明:其序列与GenBank中hCD46完整基因5′端某片段的同源性高达99.9%。用此DNA片段替换表达载体pcD-NA3EGFP中的CMV启动子,且在该片段与EGFP基因之间插入兔β-球蛋白基因的第2内含子RGI。重构的表达载体在2种鼠源细胞CHO和SP2/0中均可启动EGFP表达,表达量与人体内同源组织中hCD46的相似,说明该研究克隆了结构和功能正确的hCD46基因启动子。     

抑制素基因疫苗的构建

使用猪抑制素α亚基上的第1－32位所基酸所对应的DNA片段作为目的基因，并与乙肝表面抗原基因串联，插入原核表达质粒（pUC18)中，构建重组原核表达质粒，经过在大肠杆菌中扩增后提取目的基因片段，手稿真核表达质粒(pcDNA3.0）中，构建重组真核表达质粒，经过扩增和提取，并经过测定获得了抑制素基因疫苗。     

新城疫病毒La Sota株F基因重组pGAPZα的构建

根据新城疫病毒(NDV)La Sota株F基因序列和毕赤酵母表达载体pGAPZαA多克隆位点序列,设计并合成3对引物,以RT-PCR技术获得NDV La Sota株融合蛋白(F)基因的F1片段和F2片段。将目的基因和质粒pGAPZαA均以KpnⅠ和XbaⅠ进行酶切,以DNA连接酶进行连接并转化Escherichia coliDH5α,转化子经PCR鉴定和酶切鉴定,结果表明构建的重组质粒中含有目的基因片段。将目的基因片段的测序结果与NDV La Sota株F基因序列比对,长度和核苷酸序列一致。     

植物甜蛋白monellin基因的合成和克隆

根据已报道的单链monellin基因序列，设计合成5段核苷酸序列，利用这些片段末端的碱基互补序列经链延伸、PCR扩增合成双链DNA，克五笔型于质粒载体pUC18的BamHI、SalI位点之间，经限制酶切分析，序列分析等方法证实获得了monellin基因的克隆，与报道的monellin基因的序列完全符合，为下一步构建高效表达质粒，并将monellin基因转入植物并获得高含量的monellin转基因植物奠定基础。     

中国飞蝗线粒体COI基因片段的扩增

对中国飞蝗各亚种线粒体DNA的COI基因片段进行了扩增并测序。结果表明,扩增产物为单一带,大小约为1.3kb。对此扩增产物序列分析证明所扩增的COI基因序列是一个含混不清的序列,说明在中国飞蝗不同亚种的基因组DNA中存在线粒体的假基因序列,因此以飞蝗基因组DNA为模板PCR扩出的mtDNA COI基因片段不适宜用作分析飞蝗种群遗传和系统发育的分子标记。     

鸡Ii基因的克隆、鉴定及其原核表达

从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中提取总RNA,用自行设计的一对引物通过RT—PCR方法扩增出鸡恒定链(invariant chain,Ii)基因片段。经酶切鉴定后,再将该片段克隆到pcDNA3载体中,测定其DNA序列,结果表明该片段长度为669bp,其DNA序列与GenBank登录的基本一致。再将该片段插入原核表达载体PGEX-4T-1,并导入菌株BL21,经诱导培养、蛋白提取和SDS—PAGE,获得分子量约为50kD的特定蛋白条带,表明所克隆的鸡Ii基因在原核细胞中得到表达。     

恩诺沙星人工抗原的合成与鉴定

采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法,将恩诺沙星（ENR）分别与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）连接,制备人工免疫原ENR-BSA和包被原ENR-OVA,经紫外扫描分析和动物免疫试验证实人工抗原合成成功,研究结果对抗恩诺沙星单克隆抗体的制备具有重要意义.     

转基因拟南芥株系后代遗传稳定性鉴定

转基因材料的遗传稳定性是基因工程成败的关键内容之一,快速确证其多代遗传特性是进行大量后代材料分析的技术保证。该文主要利用PCR技术以提取出的DNA作为模板对外源基因进行扩增,从而鉴定外源基因的遗传特性。对提取出的DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析,实验结果表明,提取出的DNA产量和质量较高,PCR的结果快速确证了转基因拟南芥外源ADH1基因的遗传稳定性。     

黑曲霉中国株(3.758)葡萄糖氧化酶(GOD)基因的克隆与结构分析

[目的]为充分开发黑曲霉在轻工业中的用途。[方法]以黑曲霉中国株(3.758)基因组DNA为模板,用LATaqDNA聚合酶对葡萄糖氧化酶(GOD)基因进行PCR扩增,扩增片段纯化后与pUCm-T载体连接后,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,经琼脂糖凝胶电泳法、酶切和PCR鉴定获得阳性克隆。对获得含GOD基因的克隆进行测序,分析其蛋白质氨基酸序列及限制性内切酶的图谱。[结果]经PCR扩增获得约1.8kb的片段。获得的GOD基因编码序列共1818bp,与报道的黑曲霉(ATCC9029)GOD基因序列仅有3个碱基之差。该基因序列具有多个限制性内切酶位点。黑曲霉不同菌株与中国株(3.758)GOD基因的同源性比较表明,不同黑曲霉菌株中GOD基因不同,而菌株ATCC9029与菌株NRRL-3是同一菌株。[结论]该研究获得了GOD基因的全长序列,为GOD的生物工程生产和相关植物基因工程奠定了基础。     

舞毒蛾核型多角体病毒的基因及其在害虫防治中的应用

介绍了舞毒蛾核型多角体病毒（LdMNPV)的基因组结构、UDP－转葡糖基酶基因、增强子基因（enhancin基因）、蛋白激酶基因（vPK基因）、多角体蛋白（polyhedrin)基因、PE基因、P39－衣壳基因、DNA聚合酶基因（DNA pol)、25K FP基因以及LdMNPV的同源区（hrs)的结构和功能。这些基因或同源区的编码产物有的作为结构组分存在于包含体中，有的作为调节因子在病毒复制过程中参与病毒DNA的复制和基因表达的调节，有的负责协调病毒与虫体之间的关系。通过分析用于外源基因表达的LdMNPV的基因工程的实例，阐明了在害虫的防治领域，构建LdMNPV重组杆状病毒杀虫剂是LdMNPV分子生物学和基因工程的发展方向。     

DNA-AFLP分析用辣椒基因组DNA提取方法的优化

采用SDS法、CTAB-1法和CTAB-2法提取辣椒(Capsicu mannuum)叶片DNA,通过紫外吸收和琼脂糖凝胶电泳检测,证明CTAB-2法所提取DNA的质量和纯度较高;以此DNA为模板进行DNA-AFLP分析,特征条带清晰、基本无脱尾,适用于DNA-AFLP等分子生物学研究。     

Construction of a general human chromosome jumping library, with application to cystic fibrosis

In many genetic disorders, the responsible gene and its protein product are unknown. The technique known as "reverse genetics," in which chromosomal map positions and genetically linked DNA markers are used to identify and clone such genes, is complicated by the fact that the molecular distances from the closest DNA markers to the gene itself are often too large to traverse by standard cloning techniques. To address this situation, a general human chromosome jumping library was constructed that allows the cloning of DNA sequences approximately 100 kilobases away from any starting point in genomic DNA. As an illustration of its usefulness, this library was searched for a jumping clone, starting at the met oncogene, which is a marker tightly linked to the cystic fibrosis gene that is located on human chromosome 7. Mapping of the new genomic fragment by pulsed field gel electrophoresis confirmed that it resides on chromosome 7 within 240 kilobases downstream of the met gene. The use of chromosome jumping should now be applicable to any genetic locus for which a closely linked DNA marker is available.     

诱导番茄同源四倍体的研究

人工诱导番茄四倍体,当作遗传传递的工具,有重要的育种用途。籍助染色体重组工程,诱导番茄多倍化,实现基因转移,不仅可获得座果多而品质好的番茄新品系。还可克服远缘杂交中的不亲和性、杂种不孕性等,从而培育新品种。试验结果表明:用中等剂量的秋水仙素处理减数分裂前的细胞,并结合涂抹幼苗生长点的方法,产生番茄四倍体的频率大,植株茎部粗壮,叶色深而宽厚,座果多而果实大。但需加强田间管理,才可在生产中应用。     

植物基因工程研究的现状(综述)

本文从目的基因的分离和结构分析、基因载体的开发利用、基因转化途径的发展以及外来基因在植物细胞中的表达等几个方面对植物基因工程的研究概况进行了综合介绍。指出,只有进一步深入研究植物基因的结构和表达,深入研究植物组织培养技术,植物基因工程才可能最终进入实际应用。     

牛乳素Lfcin B基因的合成及其在酵母菌中的表达研究

[目的]为临床研究和治疗某些病原微生物引起的感染提供依据。[方法]参照LfcinB的氨基酸序列,利用化学合成法合成LfcinB基因并克隆到pPIC9K载体中,转化到酵母菌GS115感受态细胞中,用抗性选择标记G418筛选出高拷贝酵母菌转化子。利用甲醇诱导表达重组LfcinB,经Tricine-SDS-PAGE电泳检测目的蛋白牛乳铁蛋白素的表达情况,同时通过体外抑菌试验检测表达产物的抑菌活性。[结果]提取的酵母菌DNA扩增出1条预期的560bp左右的特异性条带。目的基因已经成功克隆到pPIC9K载体中,并转到酵母菌GS115中而且获得了表达。重组酵母表达上清中牛乳铁蛋白素抗菌肽对沙门氏肠炎杆菌的抗菌活性为42.857IU/ml,表明LfcinB基因的酵母表达载体构建成功。[结论]该研究证明利用化学合成法直接合成编码LfcinB的DNA构建真核表达载体、通过生物发酵工程来制备LfcinB是可行的。     

粤黄鸡分化品系血液蛋白质多态性基因频率的变化

本试验采用醋酸纤维薄膜电泳和聚丙烯酸胺凝胶电泳方法测定了粤黄鸡4个分化品系(群体)以及石歧杂鸡和杏花鸡的血液蛋白质多态性,观察了多态性血液蛋白质基因频率的变化,根据基因频率计算出6个群体相互之间的相似系数和标准遗传距离及各群的平均杂合度,分别以系统聚类分析和主分量分析方法对这种变化进行研究。结果表明,4个粤黄鸡分化品系大多数多态性血液蛋白质基因频率相近,少数出现品系(群体)间差异,而相似系数和遗传距离说明品系(群体)间分化与选育目的相符;系统聚类分析显示4个粤黄鸡分化品系(群体)与石歧杂鸡间关系较为密切;与杏花鸡相对地较为疏远,主分量分析却清楚地表明了粤黄鸡从石岐杂鸡中的分化以及与杏花鸡的区别。这两种分析方法结果相互补充,而两者的不一致有待进一步研究。另外,平均杂合度似乎也表明了品系(群体)选育程度的差异。