miR-376b-5p调控绵羊产羔性状相关基因IGF1的表达

为探讨miR-376b-5p靶向调控IGF1影响绵羊多羔性状的分子机制，本研究根据产羔记录选取高、低产羔数小尾寒羊各5只，同期发情处理后，采集卵泡期卵巢及其他6个组织，通过RT-qPCR、Western blot和双荧光素酶报告基因检测系统分析miR-376b-5p与IGF1在高、低产羔数小尾寒羊各组织中的表达量；并确定二者之间的靶向关系；随后，将体外合成的miR-376b-5p模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)转染至绵羊卵巢颗粒细胞中，检测miR-376b-5p对IGF1表达水平的调控情况，同时对多羔性状TGF-β信号通路中TGFβ1和PTGS2标志因子的表达进行分析。结果表明：1)组织表达谱显示，IGF1在绵羊卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P<0.05);RT-qPCR和Western blot显示，IGF1在高产羔数小尾寒羊卵巢组织中的表达量极显著高于低产羔数小尾寒羊(P<0.01);miR-376b-5p定量结果显示其表达趋势与IGF1相反(P<0.01);2)在线软件预测和双荧光素酶报告系统检测显示，miR-376b-5p可靶向结合IG...     

鸭脂肪生成相关的miR-184-3p分析及关键靶基因筛选

为筛选miR-184-3p影响鸭脂肪生成的关键靶基因,本研究首先利用在线数据库预测miR-184-3p靶基因,并对靶基因进行富集分析和蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interaction,PPI）网络构建,寻找网络图中有意义的模块,然后分析靶基因在脂肪中的表达,再依据microRNA对靶基因负相关的作用机制筛选关键靶基因。最后,通过RNA22 v2对筛选结果进行评估。结果表明：1）共获得225个靶基因。2)GO富集分析显示,靶基因参与细胞和大分子生物合成过程的负调控过程;KEGG富集结果包含Notch信号传导途径、动物线粒体自噬和内吞作用3条显著通路。3)PPI网络图共筛选4个核心基因;4）表达谱分析共筛选到4个基因,DVL3(Dishevelled segment polarity protein 3)、HOXA9(homeobox A9)、LIFR(LIF receptor subunit alpha)和SPECC1L(Sperm antigen with calponin homology and coiled-coil domains 1 like);而R...     

miR-302a-3p在食管鳞癌中的表达及临床意义

为探讨miR-302a-3p在食管鳞癌组织和细胞中的表达及其对细胞生物学特征和食管鳞癌患者临床病理特征的影响,qRT-PCR检测食管鳞癌组织和对应癌旁组织,以及食管鳞癌细胞ECA109和正常食管上皮细胞HEEC中miR-302a-3p的表达;ECA109细胞处理后分为NC组、miR-NC组和miR-302a-3p mimic组,MTT检测各组细胞的活力,Transwell试验检测各组细胞的侵袭和迁移能力;TUNEL试验检测各组细胞的凋亡情况;卡方检验分析miR-302a-3p与食管鳞癌临床病理特征的关系。结果表明：miR-302a-3p在食管鳞癌组织和食管鳞癌细胞ECA109中低表达;与miR-NC组相比,miR-302a-3p mimic组ECA109细胞增殖能力和迁移能力明显减弱(P<0.01),细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。临床数据分析显示,miR-302a-3p表达与食管鳞癌的分化程度、临床分期、TNM分期和转归(P<0.01)相关。这一研究提示miR-302a-3p通过抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭,在食管鳞癌的发展中起到肿瘤抑制作用,其低表达有望成...     

鹅源H5N1禽流感病毒感染对雏鸭红细胞免疫功能的影响

将100只21日龄雏鸭随机分为AIV感染组(I)和对照组(C),应用免疫学和细胞培养及MTT等方法动态检测AIV感染雏鸭血液红细胞免疫黏附能力、红细胞免疫自身调控能力以及红细胞促外周血淋巴细胞增殖能力。结果表明,雏鸭感染AIV后1～14 d,红细胞C_(3b)受体花环(E-CRR)率明显低于对照组,而红细胞免疫复合物花环(E-ICR)率明显高于对照组;AIV感染雏鸭后3～21 d,红细胞C_(3b)受体花环促进率(RFER)显著低于对照组,且红细胞C_(3b)受体花环抑制(RFIR)率显著高于对照组;AIV感染雏鸭的红细胞对血液T、B淋巴细胞增殖促进能力明显低于对照组。表明AIV感染引起的雏鸭红细胞免疫黏附功能、自身调控能力和T、B淋巴细胞增殖能力下降,与AIV感染导致雏鸭外周血免疫功能降低密切相关。     

商品鸭H9亚型禽流感病毒与鸭疫里默氏杆菌混合感染的诊断

[目的]对某肉鸭场病死鸭进行病原学诊断。[方法]通过细菌分离培养等常规细菌学鉴定方法,并结合PCR、RT-PCR等分子生物学手段对病死鸭的病原体进行分离与鉴定,并对分离到的细菌进行药敏试验。[结果]该批病死鸭的发病原因确定为H9亚型禽流感病毒与鸭疫里默氏杆菌混合感染。药敏试验结果表明,分离的鸭疫里默氏杆菌只对多西环素、头孢他啶以及环丙沙星、诺氟沙星等喹诺酮类药物敏感。[结论]该药敏试验结果可为临床预防和治疗鸭疫里默氏杆菌感染的用药选择提供一定的参考依据。     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

【背景】H9亚型禽流感病毒（AIV）存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量（10 ³-10 ⁶TCID₅₀）rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制（HI）抗体,并在免疫后28 d,以10 ⁸EID₅₀的剂量静脉注射H9N2 AIV（A/duck/GD/08）,攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10 ³TCID₅₀剂量免疫组HI抗体效价达到1:2 ⁴,而10 ⁴-10 ⁶TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:2 ^2.4-1:2 ³。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10 ³、10 ⁴、10 ⁶TCID₅₀免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10 ⁵TCID₅₀免疫组保护率为80%（4/5）,1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

miR-222-3p在鹅肥肝形成中的作用及靶基因验证

为了检测miR-222-3p在填饲鹅不同组织中的表达情况，并对其靶基因进行预测和验证，探讨miR-222-3p在鹅肥肝形成中的功能。运用实时荧光定量 PCR技术检测miR-222-3p 在填饲鹅肝脏、胸肌和腹脂中的表达量；采用生物信息学方法对鹅miR-222-3p的靶基因进行预测，荧光定量PCR技术检测预测靶基因在肝脏中的表达量，并利用双荧光素酶基因报告系统验证其靶向关系。结果显示：相比对照组，miR-222-3p 在填饲鹅肝脏和腹脂中的表达量均显著升高；生物信息学预测结果显示MARF1和B4GALNT3基因在3’UTR区域存在miR-222-3p的潜在结合位点，且这两个基因在鹅肥肝中均显著下调，而双荧光素酶基因报告系统显示只有MARF1基因与鹅 miR-222-3p存在靶向关系。结果表明，miR-222-3p在鹅肥肝中表达量显著上调，且可能通过其靶基因MARF1对鹅肥肝的形成发挥调控作用。     

小鼠miR-151-3p靶基因筛选和鉴定

采用生物信息软件系统分析miR-151-3p的保守性,并筛选出与小鼠肌肉发育和肿瘤发生相关靶基因:蛋白激酶3(serine/threonine kinase 3,Akt 3),Twist碱性螺旋-环-螺旋转录因子(twist basic helix-loophelix 1,Twist 1)和T型电压依赖性钙通道α1g亚基(calcium channel,voltage-dependent,T type,alpha 1g subunit,Cacna1g)。采用实时定量PCR及双荧光素酶报告基因检测技术对以上靶基因进行初步验证,结果表明,超表达miR-151-3p显著抑制Akt 3mRNA表达,而Twist 1和Cacna1g mRNA表达变化不显著;双荧光素酶报告系统分析发现,miR-151-3p显著抑制野生型Akt 3报告载体相对荧光素酶活性,突变Akt 3 3′UTR与miR-151-3p结合的位点后,相对荧光素酶活性得到恢复,而Twist 1和Cacna1g基因双荧光素酶报告载体无此现象,结果证实Akt 3是miR-151-3p的靶基因。     

miR-142-3p在MCF-7细胞中靶向调节AKT pathway活性机理

为探究miR-142-3p在MCF-7细胞中作用机理,采用RNA免疫共沉淀技术和双荧光素酶报告基因技术筛选及验证miR-142-3p作用靶基因;蛋白质免疫印迹技术验证靶基因及其介导的PI3K-AKT-mTOR信号通路蛋白表达量及通路活性;应用实时荧光定量PCR验证靶基因PTEN对miR-142-3p调节关系。结果表明,miR-142-3p靶向调节AKT和PTEN表达;miR-142-3p过表达组中PI3K-AKT-mTOR通路活性显著降低;miR-142-3p抑制组中PI3K-AKT-mTOR通路活性显著上升;抑制PTEN表达显著提高miR-142-3p表达量。因此miR-142-3p靶向调节AKT和PTEN表达继而抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路活性,PTEN与miR-142-3p存在调节关系。     

绵羊miR-376e-3p的靶基因预测与GO功能分析

[目的]研究miRNA对脂肪代谢的调节作用,在一定程度上揭示脂肪代谢的分子机制。[方法]本研究选取实验室前期高通量测序结果中的miR-376e-3p进行研究,其在不同脂尾型绵羊尾部脂肪组织中差异表达显著,是脂肪代谢的关键miRNA。用3种软件对miR-376e-3p进行靶基因预测,并对预测结果进行GO通路富集分析。[结果]MiR-376e-3p有25个潜在的靶基因,其中21个基因富集到3种分子功能,23个基因富集到14个生物学过程中,其中Vldlr具有脂蛋白粒子受体活性。[结论]推测miR-376e-3p可能通过调节其潜在靶基因Vldlr参与脂肪代谢。为进一步研究miR-376e-3p和Vldlr在绵羊脂肪代谢中的作用奠定了基础。     

gga-miR-130b-3p对鸡MDCC-MSB1细胞中肿瘤相关基因表达的影响

为鉴定MD淋巴瘤转化细胞中gga-miR-130b-3p 调控的肿瘤相关基因,本研究在MDV转化的鸡淋巴细胞系MDCC-MSB1中过表达该miRNA,转染48 h后收集并提取RNA,利用高通量测序获得过表达gga-miR-130b-3p组和阴性对照组（Negative control, NC）的转录组数据,筛选这些数据中的差异表达基因（Differential expressed genes, DEGs）,对DEGs进行基因本体 GO功能富集分析、信号通路分析以及基因集富集分析,筛选过表达gga-miR-130b-3p前后基因表达变化可能参与的信号通路,并对两组中的差异可变剪切进行分析。结果表明：1）与NC组相比,过表达gga-miR-130b-3p组中共鉴定出117个DEGs,其中83个DEGs显著上调,34个DEGs显著下调。其中MCM10、KCNA3、PTK2、FGL2、GPAM、BMP4、LOXL3、DDO和KRAS等基因可能影响MD肿瘤转化。2）DEGs注释到46个GO条目中,其中生物过程包含免疫系统过程等在内的22个条目,分子功能包括10个条目,细胞组分包括14个条目。3）mimics NC和mimics转染组中的DEGs以及微效基因富集到7个与肿瘤发生相关的通路,其中主要是通过甲状腺激素信号途径、胆碱代谢等通路发挥抑癌作用。4）过表达gga-miR-130b-3p后差异可变剪切类型最多的是外显子跳跃（Exon skipped,ES）,其次是内含子滞留（Intron retained,IR）,最少的是外显子互斥（Mutually exclusive exon,MXE）。综上, gga-miR-130b-3p高表达会引起MSB1细胞中的部分基因差异表达,这些DEGs通过抑癌信号通路抑制MD的肿瘤发展进程,该研究可为解析miRNA在MD肿瘤转化过程中的作用机制提供理论依据。     

鸭TTR基因cDNA克隆和表达研究

为研究转甲状腺素蛋白(transthyretin,TTR)与肉鸭脂肪代谢的相关性,通过快速扩增cDNA末端技术(RACE)获得北京鸭TTR基因全长cDNA序列,并采用实时荧光定量PCR法对鸭TTR基因表达谱进行研究。结果显示:鸭全长TTRmRNA编码150个氨基酸的前体肽,该肽含20个氨基酸的信号肽和130个氨基酸的成熟肽;与哺乳动物相比,鸭TTR亚基N-末端序列多出的3个氨基酸Val-Ser-His,可能使鸭TTR结合甲状腺素T3的亲合力增加。定量检测结果表明,鸭TTRmRNA在脉络丛中的表达量最高,与鸡、爬行类和哺乳动物类似。本实验证实鸭TTR基因在脉络丛中的表达量比鸡更高,并首次发现TTRmRNA在鸭皮下脂肪组织中表达。     

鸡白细胞介素2真核表达质粒的构建、表达及对AIV疫苗免疫增强作用研究

将鸡白细胞介素2(ChIL-2)基因亚克隆入pCI载体中,pEGFP-N1载体中的EGFP基因酶切后连入质粒pCI-ChIL-2中,构建真核表达质粒pCI-ChIL-2-EGFP,该载体表达ChIL-2-EGFP融合蛋白.重组质粒在脂质体作用下转染Vero细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)和外周血淋巴细胞(PBLC),荧光显微镜观察到融合蛋白在体外能稳定表达.HI试验显示,pCI-ChIL-2-EGFP与AIV疫苗共注射可明显提高AIV疫苗的免疫原性.     

MiR-433-3p靶向调节绵羊BCKDHB表达

【目的】通过理论预测与试验验证,旨在揭示miR-433-3p对BCKDHB的调节机制。【方法】利用Target Scan、miRanda和DIANA-micro T 3个在线软件,以BCKDHB的序列预测与BCKDHB有靶标关系的相关miRNAs。为了验证理论上的预测结果,用设计好的BCKDHB 3′-UTR的特异性引物进行PCR扩增,得到目的片段并进行割胶回收和纯化,并将Pmir-GLO与目的片段同时使用Xho Ⅰ和Xba Ⅰ两个限制性内切酶进行双酶切,再用T4连接酶连接双酶切之后的目的片段和Pmir-GLO,成功构建BCKDHB 3′-UTR的双荧光素酶报告载体。从公司购买miR-433-3p的过表达载体mimics和阴性对照载体NC,设置miR-433-3p过表达、阴性对照、空白对照3个组,分别将2组载体和双荧光素酶报告载体利用lipofectamineTM3000转染试剂共转染至miR-433-3p过表达、阴性对照组的HEK-293T细胞中,空白对照组中的HEK-293T细胞正常培养,之后分别检测3组细胞中的荧光活性,得到萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性,以海肾荧光素酶活性为内参计算萤火虫荧光素酶的相对活性。便于了解miR-433-3p和BCKDHB在绵羊前体脂肪细胞中的调控机制,对采取的绵羊尾部前体脂肪细胞进行离体培养。用过表达miR-433-3p的方法探索miR-433-3p在绵羊前体脂肪细胞中对BCKDHB的调控,提取过表达miR-433-3p前后细胞的总RNA和总蛋白,利用RT-qPCR检测过表达miR-433-3p前后的miR-433-3p和BCKDHB m RNA的表达量、以及利用Western blotting技术检测BCKDHB在过表达前后的蛋白水平。为了解绵羊前体脂肪细胞分化过程中BCKDHB和miR-433-3p表达量的变化,用RT-qPCR检测前体脂肪细胞分化过程中BCKDHB和miR-433-3p的时序表达。为增加结果的可信度,还对分化过程中不同时段的细胞进行了照片采集和油红O染色。【结果】miR-433-3p在BCKDHB3′-UTR的第8—28个碱基处存在理论上的结合位点。通过比较过表达组,阴性对照组,对照组的相对荧光活性发现过表达miR-433-3p后,BCKDHB 3′-UTR重组双荧光载体的相对荧光活性降低(P0.01),说明miR-433-3p可以与BCKDHB 3′-UTR特异性结合,验证了预测结果的准确性。在绵羊前体脂肪细胞中过表达miR-433-3p后,通过比较过表达组和阴性对照组BCKDHB的m RNA和蛋白的相对表达量,发现过表达组BCKDHB m RNA和蛋白的相对表达量低于阴性对照组(P0.05),说明miR-433-3p在绵羊前体脂肪细胞中对BCKDHB有负调控作用。在诱导绵羊前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的过程中,从采集到的图片和油红O染色的结果发现此过程中脂滴聚积得越来越多,油红O染色验证了脂滴的聚集。另外,在分化过程中检测到miR-433-3p和BCKDHB m RNA的表达量呈现负相关关系。【结论】这些结果充分说明miR-433-3p通过与BCKDHB 3′-UTR的结合负调节该基因及其编码蛋白的表达,为进一步研究BCKDHB调节绵羊脂肪代谢的分子机理提供了科学依据。     

miR-22-3p/5p抑制小鼠成肌细胞增殖的功能研究

[目的]丰富家畜骨骼肌生长发育的分子调控机制.[方法]选择能够在低血清诱导条件下分化为多核肌管的小鼠成肌细胞(C2C12)作为细胞模型,在C2C12细胞中转染携带荧光标记的mmu-miR-22-3p、mmu-miR-22-5p模拟物;利用实时荧光定量PCR法检测mmu-miR-22-3p/5p在C2C12细胞中的表达;采用CCK-8法、流式细胞术检测mmu-miR-22-3p/5p对C2C12细胞增殖的影响.[结果]实时荧光定量PCR的结果显示,在C2C12细胞增殖的过程中,mmu-miR-22-3p的表达量在增殖第4天显著升高(P＜0.05),mmu-miR-22-5p的表达量逐渐升高(P＜0.01).CCK-8细胞增殖的检测结果显示,分别转染mmu-miR-22-3p模拟物组的OD值均低于NC对照组;流式细胞术的结果发现,转染mmu-miR-22-3p后,S期的C2C12细胞数量极显著低于NC对照组(P＜0.01).转染mmu-miR-22-5p后,S期C2C12细胞数低于对照组,但差异不显著.[结论]mmu-miR-22-3p和mmu-miR-22-5p对小鼠成肌细胞的增殖过程具有不同程度的抑制作用.