金堂黑山羊FSHR启动子克隆及转录活性分析

[目的]分析金堂黑山羊FSHR启动子的克隆和转录活性,为分子水平研究金堂黑山羊FSHR的可变剪接提供基础。[方法]从金堂黑山羊子宫中提取总的DNA,设计1对引物用于扩增FSHR启动子片段,并进行测序和同源性分析。将克隆得到的FSHR启动子片段替换CMV启动子构建pcFSHRB2表达载体,分别将pcFSHRB1和pcFSHRB2表达载体转染到HEK293细胞中,用2mIU/mlFSH处理细胞,在处理后24、48h分别检测环磷酸腺苷（cAMP）的产量,用以分析FSHR的转录活性。[结果]克隆得到的FSHR启动子序列与鸡和家鼠的同源性分别为34.2%和41.6%,推测其转录起始位点为-576bp处,其上游含有2个TATA-box、4个CAAT-box、1个E-box和1个W1-box。所构建的pcFSHRB2和pcFSHRB1表达载体转染细胞后用FSH处理24和48h时产生的cAMP的量分别为299.5813、125.5281pmol/L和120.0571、109.9407pmol/L。[结论]金堂黑山羊的FSHR启动子是一个典型的Ⅱ型真核启动子,是一个强启动子。     

贵州黑山羊FSHR基因第1外显子遗传多态性分析

以贵州黑山羊为对象,研究促卵泡素受体（FSHR）基因的遗传多态性。测定表明FSHR基因第1外显子,没有任何突变,显示在15只母羊中的FSHR基因第1外显子661bp核苷酸系列中不存在多态性,本研究为探索该受体基因在繁殖中的作用打下基础。     

日粮不同能量水平对绵羊卵巢FSHR基因表达的影响

通过半定量RT-PCR的方法,检测日粮不同能量水平对绵羊卵巢组织中FSHR基因表达的影响,以期对提高绵羊的繁殖性状起到一定的指导意义。选择4～5月龄、体重相近的杂交母羔(道赛特♂×小尾寒羊♀)36只,随机分为3组,分别饲喂不同能量水平的日粮:中能量组日粮(10.33 MJ/d)、低能量组日粮(7.21 MJ/d)和高能量组日粮(13.49MJ/d),饲养40d后,屠宰取绵羊卵巢组织样进行试验。结果表明:高、低能量组FSHR基因的表达均低于中能量组,其中中能量组和低能量组差异极显著(P<0.01);中能量组与高能量组差异显著(P<0.05),高能量组与低能量组差异不显著(P>0.05)。     

山羊FSHR基因编码蛋白的结构及功能分析

通过Prot Param和ProtScale等在线软件对山羊FSHR基因编码蛋白的理化性质、亚细胞定位及功能进行分析,分别使用Chou-Fasman和同源建模方法对二级、三级结构进行预测,并对采用邻近法构建的不同物种FSHR基因编码蛋白的系统发育树进行分析。结果显示,山羊FSHR基因编码蛋白由695个氨基酸残基组成,包含7个跨膜域和1个G蛋白耦合受体,属于不稳定蛋白,具有较高的亲水性;亚细胞定位结果显示,FSHR基因编码蛋白分布在内质网、液泡和线粒体内;二级结构主要是α螺旋,三级结构富含helix螺旋结构域和长链卷曲。对不同物种FSHR基因编码蛋白进行系统发育分析发现,与其他物种相比,山羊与绵羊、家牛、野猪亲缘关系较近,系统发育分析结果与其动物学分类结果一致。     

6个牛品种在FSHR基因位点的遗传关系及其多态对双胎性状的标记

用PCR-RFLP技术,对秦川牛、中国荷斯坦牛、晋南牛、南阳牛、延边牛、中国西门塔尔牛6个牛品种176个个体的促卵泡素受体(FSHR)基因5′端进行多态性分析,4种内切酶对PCR产物的单酶切结果发现,Pst ,Sin 和Hae 3种内切酶的酶切产物均为单态,而Taq 的酶切产物出现多态性,表现为3种基因型(AA,BB,AB),品种间基因频率和基因型频率均有较大差异。对3个有单双胎记录牛的品种分析发现,秦川牛双胎母牛的等位基因A(0.5500)及基因型AA(0.5000)的频率高于单胎母牛(A:0.3500,AA:0.3000);而荷斯坦牛双胎母牛的等位基因B(0.5937)及基因型BB(0.6875)的频率均高于单胎母牛(B:0.5416,BB:0.4167),在后代中有同样的趋势;在中国西门塔尔牛的双胎母牛、随机母牛及种公牛3种类群中,双胎母牛和种公牛的等位基因B(0.5909,0.5417)和杂合子基因型AB(0.8182,0.9167)的频率高于随机母牛(B:0.3182;AB:0.4546)。根据Nei氏标准遗传距离聚类分析,表现为西门塔尔牛和延边牛首先聚在一起,然后晋南牛、秦川牛、荷斯坦牛、南阳牛依次加入。     

沂蒙黑山羊子宫中FSHR和LHR基因在发情周期内的表达规律

为了探讨低繁山羊子宫中FSHR基因和LHR基因的表达变化规律,本研究从沂蒙黑山羊子宫中提取总RNA,使用相同的RT-QPCR方法,分别对处于发情周期不同阶段沂蒙黑山羊子宫各段中FSHR基因和LHR基因在mRNA水平上进行定量分析.结果显示:FSHRmRNA和LHRmRNA在整个发情周期的子宫各段中都有表达.FSHRmRNA的整体表达量水平均高于LHRmRNA的表达量;FSHRmRNA在子宫角发情后期表达量最高,渐低至发情前期最低;子宫肉阜在间情期表达量最高,至发情前期最低,四时期之间差异不显著(P＞0.05);子宫颈在发情期表达量最高,间情期表达量最低,与其它时期差异显著(P＜0.05).LHRmRNA在子宫角、子宫肉阜、子宫颈均在间情期表达量最高,且与其它三个时期差异显著(P＜0.05).两基因在子宫体的表达量较低且规律不明显.     

三个山羊品种FSHR基因部分序列的克隆与分析

以波尔山羊、莱芜黑山羊、崂山奶山羊为研穷对象,对其FSHR基因5’端调控区及第一外星子部分序列进行克隆测序。结果表明,波尔山羊与莱芜黑山羊、崂山奶山羊三者序列的同源性为98．13%,相应的突变率为1．87%。三个品种间共有27处发生碱基缺失/插入,且碱基突变区段位于基因的5’端区转录启动调控区,主要集中在-210～—290bp之间,莱芜黑山羊与崂山奶山羊之间仅出现3个碱基的突变。     

辽宁绒山羊卵泡中FSHR基因表达研究

以β-Actin作为内源性内标,采用RT-PCR技术,研究了辽宁绒山羊不同发育时期卵泡FSHR基因mRNA的表达丰度。结果表明:辽宁绒山羊和本地山羊相同发育阶段卵泡FSHR基因表达水平差异不显著(P>0.05),随着卵泡发育,其表达水平的变化趋势也相一致;辽宁绒山羊直径<1mm卵泡和直径为3～4mm卵泡的颗粒细胞FSHR基因mRNA表达水平显著高于膜细胞。     

黄牛FSHR基因的生物信息学分析

利用生物基因组学数据库,对黄牛FSHR基因进行生物信息学分析,以预测FSHR基因编码产物的理化性质、结构与功能,同时构建FSHR同源系统进化树.结果表明:FSHR基因编码产物为疏水性跨膜蛋白,具有明显的信号肽,其切割位点位于17～18位的氨基酸之间,二级结构主要以α-螺旋与无规则卷曲为主,并主要在质膜中发挥生物学作用,跨膜区域分为跨膜域、胞外域和胞内域3个部分.序列分析表明,FSHR编码产物可能具有离子通道、运载体、受体、信号转导和阳离子通道等功能,在离子跨膜与信号传递过程中发挥重要作用,并对黄牛的激素调节有影响.FSHR基因编码产物系统进化树表明,黄牛FSHR与水牛、成都麻羊、绵羊等物种FSHR遗传距离较近,具有高度同源性.     

双羔型辽宁绒山羊FSHR基因SNP分析的研究

分别选择遗传性能稳定的2．5岁的经产双羔、单羔辽宁绒山羊母羊,并以萨能奶山羊为对照。对FSHR基因第10个外显子的1487～1717bp碱基区段进行SNP分析;利用PCR法扩增FSHR第10个外显子的目的片段,用PCR-SSCP法对PCR扩增的目的片段进行单核苷酸多态性分析。结果表明：辽宁绒山羊FSHR基因第10个外显子突变率较大,并且其突变发生在第1606个碱基,由C→T,说明FSHR基因的第10个外显子可以作为双羔性状的标记基因。     

不同BMPRIB基因型小尾寒羊同期发情处理后FSHR和LHR表达量的研究

 【目的】根据小尾寒羊BMPRIB突变位点进行基因分型。研究发情期小尾寒羊BMPRIB基因型（BB、AB和AA）与FSHR和LHR mRNA表达量的关系。【方法】利用半定量PCR技术。【结果】在发情期BB型右侧卵巢FSHR 的mRNA水平（1.14±0.11）显著高于AA（0.44±0.11）和AB（0.36±0.08）型（P<0.01），但左侧卵巢在基因型间无显著性差异；BB型右侧卵巢LHR的mRNA水平（0.42±0.02）也显著高于AA（0.23±0.02）和AB（0.25±0.04）型（P<0.01），左侧卵巢各基因型间无显著性差异。【结论】FSHR和LHR的mRNA的高表达量可能是引起小尾寒羊较高的产羔数的原因之一。     

多浪羊和卡拉库尔羊卵巢促卵泡素受体的定位研究

[目的]探讨多浪羊和卡拉库尔羊卵巢组织中FSHR基因表达变化规律.[方法]采用免疫组织化学SP方法对两种绵羊卵巢组织上FSHR进行定位研究.[结果]FSHR阳性细胞主要表达在颗粒细胞上,在卵母细胞和膜细胞上也有少量表达,两地方品种绵羊卵巢上原始卵泡和闭锁卵泡时期表达差异不显著(P＞0.05),而在初级卵泡、次级卵泡时期和成熟卵泡上表达差异显著(P＜0.05);对同种绵羊分析时又发现原始卵泡与其他卵泡之间FSHR阳性细胞表达差异显著(P＜0.05),成熟卵泡时期阳性细胞表达显著(P＜0.05)高于初级和次级卵泡.闭锁卵泡是阳性细胞率与其他各级卵泡差异极显著(P＜0.01).[结论]推测出多浪羊对FSH的敏感性高于卡拉库尔羊,表明FSHR含量越高繁殖率越高.FSHR可能也参与其他因子的调控.     

海兰褐蛋鸡卵巢与输卵管FSHR及LHR基因定量的研究

为了研究鸡卵巢、输卵管子宫部、输卵管漏斗部FSHR及LHR基因表达水平差异,实验从海兰褐蛋鸡的子宫部、卵巢、漏斗部中提取总RNA,利用RT-PCR技术获得FSHR、LHR目的基因,并应用实时荧光定量PCR进行定量检测。结果显示卵巢组织FSHR m RNA表达水平显著高于子宫部与漏斗部组织(P0.01),子宫部与漏斗部组织FSHR m RNA表达水平没有显著性差异;子宫部组织LHR m RNA表达水平极显著高于其他两组(P0.01),但卵巢、漏斗部组织LHR m RNA表达水平没有显著性差异。实验通过研究鸡卵巢、输卵管子宫部、输卵管漏斗部FSHR及LHR基因表达水平差异,研究为今后研究禽类生殖生理提供基础数据和科学依据。     

金定鸭FSHR基因第1～7外显子的克隆及SNP位点的筛查

动物的繁殖活动主要受内分泌生殖激素的调控,FSHR存在于卵泡颗粒细胞膜上,属于G蛋白偶联受体家族,对动物卵巢细胞的发育、成熟和排卵具有重要的作用。本研究以高产和低产金定鸭基因组为模板,通过PCR扩增、目的基因片段克隆和测序等方法,获取金定鸭FSHR基因1~7外显子序列,并对基因序列进行比对分析。结果显示,序列a包含第1外显子(185bp)的完整序列,第1内含子(145bp)的部分序列;序列b包含第2(75bp)、3外显子(75bp)、第2内含子(463bp)的完整序列,第1(40bp)、3内含子(47bp)的部分序列;序列c包含第4外显子(75bp)的完整序列,第3(180bp)、4内含子(55bp)的部分序列;序列d包含第5外显子(78bp)的完整序列,第4(232bp)、5内含子(56bp)的部分序列;序列e包含第6(69bp)、7外显子(75bp)、第6内含子(117bp)的完整序列,第5(133bp)、7内含子(146bp)的部分序列。根据基因序列特征,对获取的5段金定鸭FSHR基因序列进行扩增序列测序比对。结果发现:在外显子1第50bp处存在A/G突变;在外显子2第30bp处存在A/G突变;在外显子4第33bp处存在C/T突变;在外显子5第45bp处存在A/G突变,第19bp处可能存在A/T突变,33bp处可能存在C/T突变。金定鸭FSHR基因序列的克隆及SNP突变位点的发现可为后续开展FSHR基因的多态性与金定鸭产蛋性能的相关研究奠定一定的基础。     

FSHR基因第10外显子多态性及其与小梅山猪产仔数的相关性

【目的】研究猪FSHR基因第10外显子的多态性及其与小梅山母猪产仔数的相关性。【方法】采用 PCR-SSCP和直接测序方法检测基因多态性,利用最小二乘法分析其对母猪产仔数的关系,同时对多态位点的方差组分进行分析,并预测选择反应。【结果】在小梅山猪、枫泾猪和大白猪这3个群体中,引物P1和P3上分别检测到1个多态位点,其中P1位点可导致氨基酸的改变;引物P6仅在大白猪中检测到1个多态位点;对小梅山猪而言,P1位点的A等位基因和P3位点的D等位基因为优势基因;在P1位点上,两胎以上小梅山母猪中,AA型个体的总产仔数（total number born,TNB）和产活仔数（number born alive,NBA）比BB型分别高出1.95和1.66头（P＜0.01）;在P3位点上,在两胎以上及所有胎次的母猪中,DD型个体的TNB和NBA均极显著高于CC型（P＜0.01）;小梅山母猪的TNB和NBA在P1和P3位点上的遗传主要受到加性效应的影响。【结论】FSHR基因第10外显子P1和P3位点的A和D等位基因对小梅山猪产仔数有显著影响。