pCAMBIA2300-betA-BADH双价基因植物表达载体的构建

摘要：本实验以载体pCAMBIA2300-35s-OCS为基础通过分子克隆手段,将甜菜碱合成途径的两个关键酶基因,即编码胆碱脱氢酶（CDH）的betA基因和编码甜菜碱醛脱氧酶（BADH）的BADH基因及启动子和终止序列构建在同一植物表达载体上,得到pCAMBIA2300-betA-BADH双价植物表达载体。并将其导入根癌农杆菌GV3101和LBA4404,进一步用于双子叶植物的遗传转化。     

植物表达载体pGMAR-BADH的构建

将甜菜碱醛脱氢酶基因BADH和植物表达载体pGMAR通过内切酶BamHI和KpnI双酶切,T4连接酶进行连接反应。重组质粒在大肠杆菌菌株DH5α内扩增,提取并纯化质粒。经鉴定,基因BADH已被完整、正确的插入到pGMAR载体中,并成功将BADH插入到载体pGMAR的两个MAR序列之间。     

粳稻和籼稻愈伤诱导和分化期间生理代谢差异初探

通过比较粳稻品种日本晴和籼稻品种9311成熟胚愈伤诱导和分化阶段,愈伤组织的基础生理代谢差异,探讨籼稻9311再生率低于粳稻日本晴的可能原因。研究表明,在愈伤诱导和分化的所有不同时期,在所有时期日本晴愈伤中的总氮和氨态氮含量均高于9311,在分化25天以前,硝态氮含量也高于9311。此外,在细胞代谢水平上,通过对可溶性蛋白含量的差异分析表明,在愈伤诱导一个月至分化15天时,日本晴的可溶性蛋白含量高于9311。     

甜菜碱合成酶CMO、BADH基因无抗生素标记植物表达载体的构建

利用基因工程技术,对植物表达载体进行改造,去除NptⅡ、Hyg等抗生素标记,获得安全载体骨架,分别构建了无抗生素选择标记的CMO、BADH以及双价基因的植物表达载体pROK-CMO、pCAMBIA-1301-BADH 1、pCAMBIA-1301-CMO+BADH.通过冻融法将其转入根癌农杆菌LBA 4404中得到工程菌株,为下一步安全转化奠定基础.     

LFY基因双T-DNA植物表达载体的构建

LFY基因是从从野生型拟南芥中克隆出的一个与调控花分生组织启动相关的基因,它有促进植物提早开花的作用。用PCR方法从克隆载体上扩增出LFY基因并在两端添加XhoⅠ酶切位点,将其连接在用XhoⅠ切除了hyg基因的pCAMBIA1301表达载体上,得到去除选择标记的LFY基因植物表达载pCAM-BIA1301-LFY。质粒pCAMBIA1301经HindⅡ/EcoRⅠ双酶切补平自连后得到去除多克隆位点的质粒pCAMBIA1301-,再经SacII/SphI双酶切后插入到经SacⅡ酶切的pCAMBIA1301-LFY中。建成双T-DNA植物表达载体pCAMBIA1301-LFY-hyg-,经酶切鉴定证明了所构建载体的正确性。将此双T-DNA载体用农杆菌介导法转化菊花叶片,期望得到无选择标记含LFY基因的转基因菊花。     

植物病原菌诱导表达载体构建及在烟草中的瞬时表达研究

根据GenBank中植物病原物诱导型启动子碱基序列设计引物,以烟草基因组DNA为模板,扩增PPP3启动子。用PPP3替换pCAMBIA1301中与gus基因相连的35S启动子,构建重组质粒pCOMBIA ＋PPP3＋gus后导入农杆菌GV3101。通过农杆菌介导的瞬时表达技术将受PPPs控制的gus基因导入烟草。分别接种青枯菌和水杨酸24 h后,烟草叶片中检测到gus基因转录效率分别提高了27．94,17．69倍。表明PPP3启动子具有本底表达水平低、诱导表达活性强的特点。     

维管特异启动子BSP驱动的基因Chi、Glu双价载体构建

几丁质和β-1,3-葡聚糖是绝大多数真菌细胞壁的主要成份,可分别被几丁质酶(Chitinase,Chi)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,Glu)降解,而且它们具有协同抗真菌的作用,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶存在于大多数植物细胞中。在正常情况下,植物体内的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶只有低水平的组成型表达,但在病原菌侵染、诱导物刺激及各种伤害下可诱导产生大量的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶。而真菌病害是危害植物的主要病害之一,这些病害主要通过韧皮部运输而进一步扩展到其他部位。如果利用维管特异表达启动子调节目的基因在韧皮部高效特异地表达,就可以更为有效地发挥目的基因的作用。为此,克隆了维管特异BSP启动子和Chi、Glu基因,并构建了以BSP驱动的Chi和Glu基因的双价表达载体pBIBCG。重组质粒pBIBCG经过PCR分析鉴定,结果表明,以维管特异启动子BSP驱动的含有双价抗真菌基因的植物重组表达载体已构建成功,为植物抗真菌基因工程育种奠定了基础,对提高植物的整体抗病性具有重要的作用。     

DREB1C-GFP融合基因植物表达载体的构建

为了便于转基因植株的分子检测,利用重叠延伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR）方法克隆来自于水母的绿色荧光蛋白基因（GFP）和来自于拟南芥的目的基因DREB1C转录因子,并对其进行改造获得融合基因。通过酶切和连接,将融合基因构建到表达载体pCAMBIA1301上,获得了具有DERB1C和GFP基因的重组表达载体pDR1-GFP,酶切和测序结果表明,该融合基因与设计相符。     

Gateway技术快速构建百合双价抗病毒RNAi表达载体

为获得适合转化百合的双价RNAi表达载体,以感病百合叶片的总RNA为模板,分别扩增400 bp左右的LSV和LMoV CP基因。通过重叠延伸PCR技术获得长约800 bp的LSV-LMoV融合基因。利用Gateway技术,通过BP反应及LR反应将LSV-LMoV融合基因克隆到双元载体pH7GWIWG2(Ⅱ),成功构建了含两种病毒基因的RNAi表达载体pH7GWIWG2(Ⅱ)-LSV-LMoV。将构建好的双价表达载体导入农杆菌EHA105,PCR和测序表明所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致。     

含双边界序列植物双价表达载体的构建

转基因植物的安全性是基因工程改良作物的一个重要问题.构建含双边界序列（双T-DNA区）载体,将选择标记基因和目标外源基因分开在不同的T-DNA区,通过转基因植株有性杂交及后代分离,可在转基因后代中获得无选择标记的转基因安全植株.将2个外源基因置于同一载体上,可以提高其共转化的效率.本研究构建了1个中间载体pAHC17-PTA和1个含双边界序列的植物双价表达载体pDB13PS.pAHC17-PTA含有由Ubiquitin启动子引导的具有抗虫效果的半夏凝集素基因（PTA）.pDB13PS含2个独立的T-DNA区,在其中一个T-DNA区,含两个目的基因的完整的表达盒,一个是由Ubiquitin启动子引导的半夏凝集素基因（PTA）,另一个是由水稻胚乳特异表达启动子（Glutelin-B1 promoter）驱动的马铃薯高赖氨酸蛋白基因的cDNA（SB401）.pDB13PS的成功构建,为提高PTA和SB401的共转化效率和获得无选择标记的转基因后代植株奠定了基础.     

葡萄糖氧化酶基因植物表达载体的构建

为进一步开展转基因研究创造条件,用限制性内切酶将葡萄糖氧化酶(GOD)基因从pMD/GO载体上切下,定向连接到植物表达载体pROKⅡ的CaMV35S启动子下游和NOS终止子上游,成功地构建了GOD基因植物表达载体pROK/GO。利用冻融法将此表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,提取转化质粒,经PCR和酶切鉴定表明,GOD基因植物表达双元载体构建成功。     

拟南芥CPK10双元TAP载体的构建及原生质体表达

为了研究拟南芥CPK10发挥功能的分子机理,通过PCR扩增克隆了CPK10基因,将该基因连接到带有FLAG和HA标签的双元串联亲和层析载体上,构建成p CM1307-3FLAG-3HA-CPK10植物表达载体,进而通过PEG介导转化拟南芥野生型原生质体,表达约10 h,通过Western Blotting检测融合有FLAG和HA标签的CPK10蛋白的表达情况,结果显示,可以分别利用FLAG抗体和HA抗体特异检测到CPK10蛋白的条带。融合蛋白的成功表达,为进一步通过串联亲和纯化技术(TAP)筛选CPK10的互作蛋白奠定基础。     

抗旱、耐盐基因P5CS植物表达双元载体的构建

以含有P5CS的重组质粒pBIP5CS—F129A为模板,通过PCR的方法获得了目的基因P5CS（1905bp）并将其克隆到pBS—T载体上。利用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ将P5CS基因从克隆载体上消化下来,定向插入到无GUS基因植物表达载体pCHF3的CaMV35S启动子和NOS终止子之间。通过冻融法将此表达载体导入农杆菌LBA4404中,经PCR鉴定表明,P5CS基因植物表达双元载体构建成功。     

小鼠 Dazl 基因真核表达载体的构建及表达检测

为研究小鼠Dazl基因的功能及探究Dazl基因过表达在干细胞向生殖细胞分化过程中的作用,采用RT-PCR方法,从13．5 dpc 雌性胎鼠卵巢中克隆出Dazl基因的全部编码区,测序正确后利用限制性内切酶将其连接到真核表达载体pcDNA3．1上。线性化后对小鼠成纤维细胞进行转染,qRT-PCR及Western Blot 技术显示外源基因Dazl已经成功转染并表达。为研究Dazl基因的功能及干细胞向生殖细胞的诱导分化奠定了基础。     

TMV、CMV双价抗性RNA沉默表达载体的构建

本研究以在植物体内转录出RNA沉默的高效诱导因子双链RNA（dsRNA）为目标,根据已报道的TMV ΔMP和CMV ΔRep的核苷酸序列设计特异性引物,分别从质粒pBIN-TMV ΔMP(i/r)、pBIN-CMV ΔRep(i/r)扩增MP基因、Rep基因,并在pGEM-T Easy 载体上将2片段串联起来,再用PCR扩增串联好的正反向MP-Rep基因。正向MP-Rep基因用BamHI和Kpn I切下,将所得基因片段与用同样酶切开的含内含子的pKAN-In相连,取名+pKAN;用同样的方法,将反向MP-Rep基因用Xba I切下,将所得基因片段与用同样酶切开的+pKAN相连,取名pKAN-In-MP-Rep,再用Not I将包括Intron和正反向MP-Rep基因在内的片段切下,将其定向插入同样酶切开的pART27上,获得重组质粒pART27-In-MP-Rep。获得的载体可以应用于植物转基因抗病毒育种工程中。     

AtFT基因植物表达载体的构建研究

FT是从拟南芥克隆得到的诱导植物开花调控基因。利用FT基因表达特点,克隆拟南芥FT基因片段,重组构建了以CaMV35S为启动子、GUS为报告基因的植物表达载体pCAMBIA2301-FT与pCAMBIA2300-FT:GUS,并采用农杆菌介导法转化橡胶树体细胞胚,通过GUS组织化学染色观察橡胶树体细胞胚瞬时表达情况,结果验证了重组构建的2个载体的有效性,为进一步研究FT基因在橡胶树中的功能及应用奠定基础。     

草莓乙烯受体FaEtr2基因植物表达载体构建

为通过转基因技术改善草莓的贮运性能,以全明星草莓为试材,克隆了与草莓成熟有关的FaEtr2基因的2个片段,并构建了该基因的反义和正义植物表达载体。根据已克隆的草莓乙烯受体FaEtr2基因序列及表达载体pBI221上的酶切位点设计2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个全明星草莓FaEtr2基因片段。两片段经双酶切消化后分别以正、反两个方向插入到植物表达载体pBI221的35 S启动子和NOS终止子之间,分别构建成All Star-FaEtr2基因的正、反义植物表达载体。