绒毛白蜡NADH还原酶第二亚基基因(ndhB)的克隆及同源性分析

采用RT-PCR 技术克隆了绒毛白蜡NADH还原酶第二亚基cDNA 序列(FvndhB)。 FvndhB cDNA序列长893bp,由288个氨基酸残基组成,推测该序列编码的蛋白质相对分子质量为32.3kD,pI 为10.17。序列比对结果表明FvndhB与参考的8个物种的ndhBs在核酸水平上表现出较高的同源性,表明ndhB基因家族具有较高的保守性。其中与桑树的同源性最高,其次是银白杨,最后是日本柳杉。利用DNAMAN软件构建的系统进化树表明绒毛白蜡与其他植物亲缘关系较远。本研究首次从绒毛白蜡中克隆了ndhB基因,并对其进行了同源性分析,为进一步克隆绒毛白蜡ndhB全长基因及分析其表达特性奠定了基础。     

新城疫病毒河北分离株F基因的克隆及序列分析

参照GenBank中NDV的核酸序列设计一对引物,利用RT-PCR扩增,基因并得到长约1.7 kb的全基因片段,并将其构建到pMD.19T载体上.核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长1 662 bp,编码553个氨基酸,与GenBank下载的13株参考毒株,基因比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.2%～99.2%和96.9%～98.7%;但与IJasota、F48E9及Bl等常见疫苗株的氨基酸同源性仅为88.6%～91.5%.NDV分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F-I-G119,属于基因Ⅵ NDV.     

粘虫EF-1a和AK基因的克隆及实时RT-PCR方法建立

为今后利用SYBR GreenⅠ荧光定量法研究粘虫EF-1a和AK基因的表达情况,设计合成用于PCR扩增的引物,运用RT-PCR方法克隆EF-1a和AK基因片段,并进行序列同源性分析;然后采用SYBR GreenⅠ荧光定量法设计特异性引物进行RT-PCR扩增,通过熔解曲线和标准曲线分析等建立实时RT-PCR方法。结果表明,从粘虫中克隆获得EF-1a和AK基因片段长度分别为622 bp和1020 bp,分别编码207个氨基酸和339个氨基酸;序列同源性分析结果表明,粘虫EF-1a与鳞翅目昆虫家蚕、桦尺蠖和柑桔凤蝶的氨基酸序列同源性为95%以上;AK与鳞翅目昆虫草地贪夜蛾、烟蚜夜蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾和甜菜夜蛾的氨基酸序列同源性为98%以上。熔解曲线和标准曲线结果显示,设计的EF-1a和AK基因引物均可应用于实时RT-PCR扩增。     

猪干扰素IFNE1基因克隆及重组表达载体的构建

依据电子延伸序列设计一对克隆引物,用RT-PCR法从猪胃组织扩增出猪干扰素epsilon 1(IFNE1)基因的完整编码区并进行序列分析;再根据克隆的序列设计一对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出含EcoRI/XhoI酶切位点的猪IFNE1片段,插入原核表达载体,转化至宿主菌,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白。结果表明,克隆的猪IFNE1基因包含完整的开放阅读框架,长为586 bp,ORF为582 bp,编码193个氨基酸,与人、小鼠的同源性分别为83.6%和69.2%,推测的氨基酸序列与人、小鼠的同源性分别为76.2%和55.2%,表达的融合蛋白分子量约为47 kDa。     

全明星草莓乙烯受体Etr1基因克隆及序列分析

克隆了与草莓成熟有关的乙烯受体Etr1基因片段,为进一步研究Etr1基因功能并通过基因技术改善草莓贮运性能奠定基础.以全明星草莓成熟果实中分离到得基因组DNA为模板,经PCR扩增到一条约600 bp的特异片段,将该片段克隆到pEGM-T easy vector上经测序分析,基因全长617 bp,编码205个氨基酸.序列分析结果表明,该序列与Chandler-Etr1的cDNA序列同源性98%,氨基酸序列同源性97%.     

粘虫EF-1a和AK基因的克隆及real time RT-PCR方法建立

为今后利用SYBR GreenⅠ荧光定量法研究粘虫EF-1a和AK基因的表达情况,设计合成用于PCR扩增的引物,运用RT-PCR方法克隆EF-1a和AK基因片段,并进行序列同源性分析;然后采用SYBR Green Ⅰ荧光定量法设计特异性引物进行RT-PCR扩增,通过熔解曲线和标准曲线分析等建立实时RT-PCR方法。结果表明,从粘虫中克隆获得EF-1a和AK基因片段长度分别为622 bp和1020 bp,分别编码207个氨基酸和339个氨基酸;序列同源性分析结果表明,粘虫EF-1a与鳞翅目昆虫家蚕、桦尺蠖和柑桔凤蝶的EF-1a氨基酸序列同源性为95%以上;AK与鳞翅目昆虫草地贪夜蛾、烟蚜夜蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾和甜菜夜蛾的AK氨基酸序列同源性为98%以上。熔解曲线和标准曲线结果显示,设计的EF-1a和AK基因引物均可应用于实时RT-PCR扩增。     

无花果ACC合成酶基因克隆及序列分析

为进一步利用基因工程手段调控无花果乙烯的合成,以无花果果肉为材料提取基因组DNA,根据已报道的无花果ACC合成酶基因序列设计引物,采用PCR技术扩增得到一条约600 bp的特异片段,将该片段克隆到pGM-Teasy vector上经PCR、酶切和测序鉴定。序列分析结果表明,基因全长590 bp,编码196个氨基酸,该序列与GenBank上已登陆的Masui Dauphine-ACS1的cDNA序列同源性达99%,氨基酸同源性达98%。结果表明,成功克隆到了无花果ACS基因片段。     

龙眼胚性愈伤组织肌动蛋白基因(actin)片段的克隆与序列分析

采用同源克隆方法从龙眼胚性愈伤组织分离肌动蛋白基因（actin）。通过保守区和3’RACE扩增,分别获得347bp和837bp的特异片段,经过序列拼接得到895bp的龙眼actin基因3’端序列。与多种植物的肌动蛋白基因进行同源性比较,该片段的核苷酸序列同源性多在80%以上,氨基酸序列同源性大于90%,具有高度保守性。可作为龙眼体胚发生过程中基因表达分析的内参。     

黑曲霉木聚糖酶结构基因和5'调控区基因克隆及其分析

以黑曲霉(Aspergillus niger)A3的基因组DNA为模板,根据已报道的xynB基因序列设计简并引物,在合适的PCR反应条件下有效地扩增出了xynB的结构基因及其5＇调控区序列片段,并克隆到pBS-T载体上,序列测定表明,该目的片段全长1 611 bp.通过序列分析:结构基因部分长744 bp,其中含有一个66 bp的内含子和18个氨基酸的信号肽序列;xynB基因的cDNA序列大小为678 bp,编码225个氨基酸,与GenBank上检索的木聚糖酶基因的核苷酸序列同源性最高达98%,氨基酸序列同源性达99%.在翻译起始点上游92 bp和118 bp处找到转录起始位点和类"TATA"box的核心启动子区特征元件以及"CAAT"box,表明所克隆的调控区序列具有真核生物启动子特点,这为构建木聚糖酶高效表达载体,用于工业育种奠定了基础.     

苎麻COMT基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR法结合cDNA末端快速扩增（RACE）法从苎麻中克隆了与木质素合成相关的COMT基因的全长cDNA序列。所获得的COMT基因全长1318bp,包含一个开放阅读框1098bp,编码365个氨基酸。序列相似性检索结果表明,苎麻COMT全长cDNA与杨树COMT基因的序列同源性达82%,其编码的氨基酸序列与杏的COMT氨基酸序列同源性最高,达93%。同时还检索到该氨基酸序列包含一个O-甲基转移酶的保守结构。