甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测体系研究

甘蔗黄叶综合症(yellow leaf syndrome,YLS后称甘蔗黄叶病)是由甘蔗黄叶病毒(sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)引起的一种重要的甘蔗病害,为更快、更准确地检测ScYLV,合成了一对特异性引物s-pf和s-pr,建立了运用SYBR Green I荧光染料法检测ScYLV的实时荧光RT-PCR体系,并对该体系的特异性、灵敏性和适用性进行了测试。结果表明:该检测体系能特异地检出ScYLV,对测试的高粱花叶病毒不能检出,灵敏度比常规PCR高100倍,适用性广。实时荧光RT-PCR检测整个过程完全闭管,无需PCR后处理且SYBR Green I荧光染料成本较低,适用于检测甘蔗体内含量较低的ScYLV病毒。     

抗原直接包被间接ELISA检测甘蔗黄叶病毒

利用正交设计L9(34)方法优化甘蔗黄叶病毒(SCYLV)抗原直接包被间接ELISA实验条件,统计结果表明,甘蔗蔗汁和蔗叶SCYLV粗提液包被抗原合适体积为150μL,最佳的抗体浓度SCYLV-IgG多克隆抗体(一抗)稀释1500倍,碱性磷酸酶羊抗兔IgG(二抗)稀释20000～30000倍,最佳反应时间为1～2h。应用这一优化体系,分析甘蔗不同部位的蔗茎和不同叶位的叶片SCYLV滴度的差异,结果表明,上部甘蔗蔗茎SCYLV病毒含量显著高于中下部蔗茎组织,最高可见肥厚带叶(+1叶)及其上一叶(-1叶)的嫩叶组织SCYLV病毒含量显著高于最高可见肥厚带叶以下第2叶(+3叶)和第4叶(+5叶)的老叶组织。甘蔗幼嫩组织部位SCYLV滴度较高,更适合于病毒检测。     

甘蔗黄叶病毒基因型研究进展

综述了世界甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)基因型的研究进展,研究表明,ScYLV为正单链RNA病毒,全基因组由5895～5899个核苷酸组成。目前基于ScYLV基因组核苷酸序列的对比可将ScYLV划分为7种基因型,其中BRA基因型为主要基因型。不同基因型的ScYLV存在致病性差异。     

甘蔗宿根矮化病的I-ELISA快速检测

利用从澳大利亚引进的RSD标准抗原抗体,研究建立了I-ELISA检测甘蔗宿根矮化病（RSD）的方法。通过对田间采集的样本进行检测,同时以电镜负染检测法印证,检测结果一致,表明I-ELISA能简便、快速、准确、有效地检测出RSD,为甘蔗宿根矮化病的诊断和防治、脱毒种苗的生产、对外甘蔗品种／材料交换检疫检测提供了技术支撑。     

多重PCR快速检测甘蔗转基因成分研究

以单子叶植物常见外源转基因元件Ubiquitin启动子、NOS启动子、NOS终止子、Bar基因和Bt基因序列设计多重PCR引物,通过对PCR扩增体系中退火温度、Premix TaqTM浓度、引物浓度的优化,建立一种快速检测转基因甘蔗成分的多重PCR方法。结果表明:建立的体系一次能有效检测5个参数,其检测的最低DNA质量百分比可达1.0%,并在多个转基因甘蔗品种检测中得到验证。     

海南50个甘蔗品种黄叶病毒的分子鉴定

为明确国家甘蔗体系集成示范及区试甘蔗品种在海南省被甘蔗黄叶病毒(SCYLV)侵染情况及病毒基因型类型,从集成示范及区试的50个甘蔗品种上采集带有显著病症或不显病症样品50份,采用特异引物通过RT-PCR方法进行甘蔗黄叶病毒检测和病毒基因型鉴定。结果表明:50个甘蔗品种中有31个被检测到SCYLV,检出率为62%;病毒基因型有古巴(CUP)基因型、巴西-秘鲁(BAR-PER)基因型和留尼汪岛(REU)基因型3种,主要以CUP基因型为主,占58.06%,其次是BAR-PER基因型,占51.61%,REU基因型最少,占29.03%;未发现CHN1、CHN2、CHN3基因型。另外,不同基因型混合侵染现象普遍存在,总混合侵染率达32.26%。可见,海南国家甘蔗体系集成示范及区试甘蔗品种严重感染甘蔗黄叶病毒(SCYLV),且存在不同基因型混合侵染,建议推广种植脱毒种苗来控制甘蔗黄叶病的发生。本研究为在海南蔗区推广和种植甘蔗脱毒种苗及抗病育种提供了理论支持。      

甘蔗黄叶病毒与花叶病毒CP基因RNAi载体构建与转化甘蔗研究

甘蔗黄叶病和甘蔗花叶病是我国甘蔗最主要的病毒病,感病品种产量下降和品质变劣,传统方法难以防治。RNA干扰技术使培育抗病毒甘蔗品种成为可能。本研究根据甘蔗黄叶病毒和侵染甘蔗的高粱花叶病毒结构与功能特性,广泛收集不同来源病毒分离物CP基因序列,经过比对选取保守序列作为干扰序列。通过在序列两端添加酶切位点,合成并连接成双价甘蔗黄叶病和花叶病毒干扰序列,然后构建到中间载体p HANNIBAL上,形成双价RNAi干扰结构,最后插入到p ART27上形成干扰表达载体。利用基因枪轰击甘蔗品种福农15号愈伤组织进行转化,经G418筛选获得抗性再生植株。通过提取DNA和RNA分析,证实双价RNAi干扰结构不仅以不同拷贝整合到甘蔗基因组中,而且得到了转录表达。     

甘蔗黄叶综合症的RT—PCR检测初报

对2002年12月采自南宁的4个田间症状程度不同的样品作RT-PCR检测，结果表明，A1(粤糖93／159)、A2(粤糖93／159)、B1(CP88／1508)3个样品为阳性，确认田间发生的是甘蔗黄叶综合症(YLS)，是我国甘蔗新病害。建议尽快对病害加以控制，并加强甘蔗引用检疫工作。     

应用多重SYBR Green-I实时荧光定量PCR检测甘蔗黄叶病毒和高粱花叶病毒

基于已报道的甘蔗黄叶病毒(Sugarcane Yellow Leaf Virus,ScYLV)cp基因和高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)NSP基因序列设计特异性引物,建立了针对这两种病毒的实时荧光定量 PCR(real time-quantitative,RT-qPCR）检测方法。在此基础上,利用扩增产物Tm值的不同,建立了可区分ScYLV与SrMV的多重 SYBR Green-I实时荧光定量PCR方法,两种病毒扩增产物的Tm值分别为80.8～82.8℃和84.6～86.     

国外甘蔗品种斐济病的RT-PCR检测

应用RT-PCR技术对国外引进的甘蔗品种(材料)进行了甘蔗斐济病的检测,进一步改进和完善了该检测技术。     

槟榔黄化病病原及检测方法研究进展

黄化病是一种严重威胁槟榔生产种植的毁灭性传染性病害,目前主要在印度和我国槟榔主产区发生。本文从非生物与生物因素两方面对槟榔黄化病病原认识过程及检测方法进行详细的综述。     

甘蔗品种、施氮水平对甘蔗赤斑病严重度及产量损失的影响

比较粤西１０个甘蔗生产品种甘蔗赤斑病的发病程度与产量损失率。结果表明：甘蔗品种间的发病程度和产量损失均有明显差异。增施氮肥后,甘蔗赤斑病严重度增加,但对产量的影响则因品种而异。在单株测定７个甘蔗生产品种的病害严重度与产量损失的关系中获知,用来衡量病害严重度的病级与产量损失之间有十分密切的关系,从而建立了病级（ｘ）与产量损失率（ｙ）之间的回归方程。      

甘蔗不同部位宿根矮化病分子检测研究

运用PCR检测技术对粤糖93-159和ROC25的不同部位进行了RSD检测,结果表明,在同一个样品的5次重复检测中,两个品种叶片的平均检出率为20％,叶鞘的平均检出率为90％,茎尖的平均检出率为40％,茎部组织和蔗汁的平均检出率均为100％.本研究表明今后可以使用甘蔗茎部组织或叶鞘代替蔗汁进行RSD的检测.     

甘蔗宿根矮化病巢式PCR检测体系

利用LG和Cxx两对引物,通过实验优化设计,建立了比较可靠的甘蔗宿根矮化病巢式PCR检测体系.