三种红豆杉属植物中紫杉烷类化合物含量的检测与分析

优化色谱条件,利用高效液相对天然生长的南方红豆杉.中国红豆杉和东北红豆杉枝条中的3种紫杉烷类物质含量进行了检测和分析.结果表明:3种红豆杉中,紫杉烷类化合物总含量的高低依次为:东北红豆杉为0.427 mg·g-1、南方红豆杉为0.396 mg·g-1、中国红豆杉为0.350 mg·g-1;紫杉醇含量的高低依次为:南方红豆杉为0.153 mg·g-1、东北红豆杉为0.142 mg·g-1、中国红豆杉为0.0102mg·g-1.该方法把3种紫杉烷类化合物:10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-deacetyl-baccatin Ⅲ)、巴卡亭Ⅲ(baccatin Ⅲ)和紫杉醇(Taxol)置于同一色谱条件下检测,以比较不同种类紫杉烷类化合物的含量,为红豆杉资源的开发和利用奠定了基础.     

南方红豆杉枝叶与果实中6种紫杉烷类化合物含量分析

以南方红豆杉的枝、叶、果实为材料,建立了高效液相色谱法同时测定6种紫杉烷类化合物(紫杉醇、三尖杉宁碱、7–表–10–去乙酰紫杉醇、7–表–紫杉醇、巴卡亭III、10–去乙酰巴卡亭III)含量的方法。结果表明:以甲醇–乙腈–水(体积比为25∶36∶39)为流动相,等度洗脱,检测波长227 nm,6种紫杉烷类化合物在35 min内完全分离;南方红豆杉的枝、叶、果实中6种紫杉烷类化合物含量存在差异,其中,紫杉醇和7–表–10–去乙酰紫杉醇在种胚中含量最高,分别为866.47、722.50μg/g,10–去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III和7–表–紫杉醇在叶中的含量最高,分别为301.20、234.08、11.74μg/g,三尖杉宁碱含量最高的部位是枝,为392.69μg/g。     

云南红豆杉幼树不同径级枝干生物量与紫杉烷含量特征分析

将4.5年生云南红豆杉样株的枝干径级划分为9个等级,分析相应径级样枝树皮与木质部的生物量特征,对各径级混合样中10-DAB、巴卡亭III、7-木糖-紫杉醇、10-去乙酰-紫杉醇、三尖杉宁碱、紫杉醇等紫杉烷类物质含量进行检测与对比。结果表明:当样枝直径0.50 cm时,样枝树皮所占比例大幅下降;当样枝直径0.80 cm时,样枝木质部直径明显增加;当样枝直径为0.30~1.49 cm和4.00 cm时,其树皮干质量与木质部干质量比值随径级增加而显著降低;云南红豆杉幼树枝干木质部中存在一定量的紫杉醇及其他紫杉烷类物质,其枝干直径Φ=0.30 cm是该树种枝干中紫杉烷类物质含量变化的重要节点。建议在实际生产中将Φ0.30 cm的小枝叶作为云南红豆杉药用原料林培育、枝叶采收的主要目标,以及收购云南红豆杉鲜枝叶的重要定价指标。     

红豆杉属植物中紫杉烷类物质含量比较

建立5种紫杉烷类化合物的含量检测方法,并分析研究5种红豆杉(西藏红豆杉、云南红豆杉、南方红豆杉、东北红豆杉、曼地亚红豆杉)中5种紫杉烷类化合物含量差异,为红豆杉种源选育及野生资源保护利用提供理论依据。采用两种流动相的高效液相色谱检测10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)、7-表-10-脱乙酰基紫杉醇(10-DAT)、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱的含量和紫杉醇的含量。西藏红豆杉、云南红豆杉、南方红豆杉、东北红豆杉、曼地亚红豆杉枝叶中紫杉醇含量分别为0.113 3、0.522 8、0.686 2、1.670 6、1.199 4 mg·g^-1,10-DAB含量分别为0.711 1、0.821 3、0.739 2、0.770 9、0.339 2 mg·g^-1,10-DAT含量分别为0.083 3、0.290 8、0.192 3、0.352 6、0.306 0 mg·g^-1,巴卡亭Ⅲ含量分别为0.190 9、0.828 7、0.442 5、0.771 2、0.289 7 mg·g^-1,三尖杉宁碱含量分别为0.186 0、0.183 2、0.235 3、0.837 5、0.530 4 mg·g^-1。紫杉醇和三尖杉宁碱含量以东北红豆杉最高,曼地亚红豆杉次之;10-DAB含量以曼地亚红豆杉最低,不到其他品种的一半;巴卡亭Ⅲ含量以云南红豆杉最高,东北红豆杉略低;10-DAT含量普遍较低。5种紫杉烷类化合物总含量以东北红豆杉最高,曼地亚红豆杉、云南红豆杉和南方红豆杉含量相近,西藏红豆杉最低。     

不同培养基对东北红豆杉愈伤组织诱导的影响

[目的]研究不同培养基对东北红豆杉（Taxus cuspidate Sied.et Zucc.）愈伤组织诱导的影响。[方法]研究了不同基本培养基、不同植物生长调节剂种类及水平对东北红豆杉愈伤组织诱导的影响。[结果]东北红豆杉愈伤组织诱导最好的基本培养基是WPM培养基,其次是B5培养基;生长素2,4-D的诱导效果在MS培养基上优于NAA,而在B5培养基上不如NAA;在MS培养基上,细胞分裂素KT对愈伤组织诱导起促进作用,2,4-D＋0.1mg/L KT、NAA＋1.0mg/L KT的诱导效果最好,6-BA不利于东北红豆杉叶片愈伤组织的诱导。[结论]该研究可为进一步研究东北红豆杉的组织和细胞培养以及快速繁殖提供依据。     

不同肥料处理对云南红豆杉树苗生长量的影响

[目的]研究16种基肥和1个对照处理对云南红豆杉生长量的影响。[方法]采用两段式育法培育云南红豆杉苗木,采用单因素随机区组设计研究不同处理对其生长量的影响。[结果]各处理云南红豆杉的平均树高为125.1 cm,变幅为109.1~152.9 cm;平均地径为2.63 cm,变幅为2.29~3.02 cm。17种处理云南红豆杉树苗的地上部分干重的均值为225.4 g,变幅为122.0~389.0 g;地下部分干重的均值为108.4 g,变幅为84.1~128.0 g;全株干重的均值为333.8 g,变幅为206.1~517.0 g。（4.8 kg牛粪＋3.0 kg锯末）株/处理的树高、地径、地上部分干重、地下部分干重、全株干重分别比对照高40%、32%、219%、52%和151%。[结论]（4.8 kg牛粪＋3.0 kg锯末）/株处理的红豆杉树苗生长期间的综合表现最好。     

南方红豆杉枝叶中10-DABⅢ与紫杉醇HPLC检测及检测样的制备

采用单因素、多因素正交试验研究南方红豆杉枝叶中10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)、紫衫醇的高效液相色谱(HPLC)检测方法及检测样制备。结果显示,检测样制备采用10倍量甲醇于40℃恒温水浴条件下浸提3 h,即可使10-DABⅢ、紫杉醇得率达到峰值,且提取时间不宜超过3 h,否则会导致检出结果比实际含量偏低。由于采用10-DABⅢ、紫杉醇混合同时检测,结果发现选择适当的流动相梯度洗脱方案较为关键,较好的洗脱方案会使检测图谱的基线分离较好。     

抗逆菌株沼泽红假单细胞菌Ⅲ-3的培养特性

[目的]研究不同培养条件对沼泽红假单细胞菌（Rhodopseudomonas palustris）Ⅲ-3生长的影响。[方法]探讨不同环境条件、培养基组成和分离方法等对抗盐、抗重金属菌株R.palustrisⅢ-3生长的影响。[结果]R.palustrisⅢ-3菌株在30℃、光强约6000lx、pH值7.0、接种量10%、碳酸氢钠3g/L、氯化铵6g/L条件下培养34d,可获得最大活菌数3.17×108个/ml,12000r/min离心30min能有效保持菌株活性和数量。[结论]该结果可为R.PalustrisⅢ-3菌种的工厂化生产提供技术参考。     

魔芋细胞悬浮培养生产葡甘露聚糖的研究

[目的]对影响魔芋细胞悬浮培养及其次生代谢物葡甘露聚糖产生的主要影响因子进行研究。[方法]利用3,5-二硝基水杨酸测定葡甘露聚糖含量。[结果]在魔芋细胞悬浮液体培养葡甘露聚糖的过程中,采用MS培养基为基本培养基,pH值为6.0时有利于葡甘露聚糖的合成,25g/L乳糖可作为最适碳源;2,4-D在1.0mg/L时葡甘聚糖的积累效果明显;细胞分裂素6-BA使葡甘露聚糖积累明显高于KT,且1.5mg/L时葡甘露聚糖积累量较高,培养15d左右葡甘露聚糖含量达到最大。[结论]MS＋2,4-D1.0mg/L＋6-BA1.5mg/L＋乳糖25g/L,pH6.0,为魔芋细胞悬浮培养生产葡甘聚糖的较优培养基。     

鸡油菌菌丝体培养技术研究

[目的]为鸡油菌的驯化和推广提供理论依据。[方法]野外采集鸡油菌,分别配制10种不同pH值和活性碳添加量的培养基对其进行培养,25℃连续培养45d,通过测定不同处理菌丝体的生物量,研究培养基pH值和活性碳添加量对鸡油菌菌丝体生长的影响。[结果]培养基过酸、过碱都会抑制鸡油菌菌丝体生长,培养基pH值为6.0时,鸡油菌菌丝体干重最大,为40.3mg/瓶,增殖倍数为26.85倍;活性碳对鸡油菌菌丝体生长具有明显的促进作用,当培养基中活性碳含量为0.03%时,鸡油菌菌丝体干重最大,为65.7mg/瓶,增殖倍数为43.77倍。[结论]鸡油菌生长的最适培养基pH值为6.0,活性碳添加量为0.03%。     

一株产巴卡亭Ⅲ红豆杉内生真菌的分离与鉴定

[目的]分离鉴定产巴卡亭Ⅲ红豆杉内生真菌。[方法]采用常规分离方法,从东北红豆杉（TaxuscuspidataSieb.etZucc.）树皮中分离并筛选内生真菌35株;通过高效液相色谱（HPLC）技术对菌株发酵物进行检测,并结合选择性离子质谱（MS）进行确认,从中获得1株能产紫杉醇前体物质巴卡亭Ⅲ的菌株Z-1;利用ITSrDNA通用引物对产紫杉烷类物质的内生真菌进行分子生物学鉴定,并结合菌落特征、孢子与分生孢子梗的形态特征进行分类鉴定。[结果]在未经诱导的情况下,Z-1产巴卡亭Ⅲ的量约为39μg/L;形态和分子鉴定分析判定Z-1属于木霉属（Trichoderma sp.）真菌。[结论]该研究可为植物内生真菌产紫杉烷类化合物的种类多样性和产紫杉烷类内生真菌的生物多样性提供依据。     

产类胡萝卜素的海洋红酵母的培养条件优化研究

[目的]优化产类胡萝卜素的海洋红酵母的培养条件。[方法]以海洋红酵母Z44为试验菌株对其培养条件进行优化,同时,研究了添加物及培养条件对细胞量及类胡萝卜素产量的影响。[结果]得到的培养基组成为:蔗糖25.0 g/L,酵母膏20.8 g/L,草酸铵4.2g/L,KH2PO44.0 g/L,Na2HPO44.0 g/L,MgSO4.7H2O 0.2 g/L,CaCl20.2 g/L,氟化铵10 mg/L,柠檬酸30 mg/L,L-亮氨酸30 mg/L,L-缬氨酸40 mg/L。在培养基中加入氟化铵、柠檬酸、L-亮氨酸及L-缬氨酸时,红酵母的类胡萝卜素产量是对照值的1.5倍。对培养条件的优化结果为:装液量为250 ml三角瓶中装60 ml的培养基,接种量8%,培养温度30℃,初始pH为5.5,培养结束时间为66 h,培养条件优化后,红酵母的生物量及类胡萝卜素产量分别为28.2 g/L和6.72 mg/L,分别是未优化时的1.26倍和1.87倍。[结论]研究可为海洋红酵母生产类胡萝卜素的工业化应用提供参考。     

培养基N含量对螺旋藻生长的影响

[目的]探索培养基N含量对螺旋藻生长的影响。[方法]通过抽滤分离培养基与螺旋藻,测量滤液稀释10倍后的OD值来观察N含量变化,测量滤渣干重来观察螺旋藻的生长情况,从而找到最佳N浓度。[结果]当硝酸钠浓度为0.8 g/L时,螺旋藻生成最快,此时所得细胞密度为1.18 g/L,产量为21.8 g/(m2·d)。[结论]为家庭或办公室内生产螺旋藻时氮素的添加量提供指导。     

盐胁迫对飞廉悬浮细胞的生长及黄酮类物质合成的影响

[目的]研究盐胁迫对飞廉悬浮细胞的生长及黄酮类物质代谢合成的影响。[方法]在培养细胞的不同生长时间添加不同浓度的盐溶液,在接种后不同时间测定细胞的鲜重和黄酮含量,考察不同盐胁迫时细胞生长和黄酮代谢合成的影响。[结果]在接种后第6天,往培养基中加入40mmoL／L的NaCl溶液进行盐胁迫处理,飞廉细胞的鲜重为对照组的0．930倍,黄酮类物质的舍量为对照组的2．015倍。[结论]盐胁迫处理可以显著提高飞廉悬浮细胞中黄酮类次生代谢产物的含量,但对细胞的生长有一定的抑制作用。     

金针菇液体发酵条件初探

[目的]为金针菇的开发利用提供依据．[方法]以金针菇菌种为材料,根据菌丝干重,对影响其生长的因素（碳源、氮源、培养基配方、培养温度、培养基初始pH值、摇床转速、培养时间）进行筛选。[结果]不同碳源对金针菇菌丝生长的影响为玉米粉〉淀粉〉绵白糖〉葡萄糖．2％牛肉膏作为氮源的效果较好。23℃时金针菇茵丝生长较好。培养基初始pH值为6．5时,金针菇菌丝的生长最好。摇床转速以140r／min为宜。振荡培养7d,金针菇菌丝生长量最大。[结论]金针菇适宜的液体培养基为：3％玉米粉,8％牛肉膏,2ml／L维生素母液500倍液,0．1％KH2PO4,0．5％MgSO4;适宜摇瓶的培养条件为：培养基初始pH值为6．5,在23℃,140r／min转速下,振荡培养7d。     

培养时间对小麦猴头中多糖含量的影响

[目的]明确培养时间对小麦培养猴头菌(即小麦猴头)多糖含量的影响。[方法]用小麦培养基对猴头菌进行不同时间的固体培养,用碘-二甲基亚砜去除培养物中的剩余淀粉,苯酚-硫酸法测定猴头多糖含量。[结果]随着培养时间的延长,猴头多糖的含量逐渐增加,在培养35 d时达81.99 mg/g,是猴头子实体多糖含量的2.65倍。还初步建立了在样品含有植物淀粉时测定真菌多糖的简便方法。[结论]小麦猴头多糖含量很高,可代替猴头子实体提取多糖或进行其他深加工。     

紫杉醇及其前体在中国红豆杉植株中合成和积累部位探讨

研究紫杉醇及其重要前体物质巴卡亭Ⅲ在中国红豆杉(Taxus chinenesis)中合成和积累部位,通过HPLC分析代谢产物在中国红豆杉植物中的空间分布,定量PCR技术研究代表紫杉醇合成途径中不同步骤的6种关键酶基因在植株中的表达特征。结果表明,巴卡亭Ⅲ主要分布在针叶中,而紫杉醇主要分布在树皮和树根皮中;针叶中,紫杉醇代谢途径上游步骤的关键酶基因表达水平较高,树皮中催化紫杉醇侧链连接的酶转录表达水平高,而树皮中能检测到较高含量的6种关键酶基因的表达。表明紫杉醇的骨架结构主要在针叶中合成,而树皮中转化这些前体物质生成紫杉醇的能力较强,树根中含有完整的紫杉醇代谢酶系,暗示根组织培养是生产紫杉醇很有前景的方法。进一步建立了组织扦插培养红豆杉离体组织体外生产紫杉醇的系统。在茉莉酸甲酯的诱导下,红豆杉针叶在体外能够生产紫杉醇;树皮中由于缺乏足够的前体物质,离体培养中紫杉醇含量不断下降;枝叶培养中,产生的紫杉醇主要集中在树皮中。上述研究结果暗示,紫杉醇及其前体物质在中国红豆杉体内存在转移现象。     

食蟹猴支持细胞的分离、纯化以及不同血清浓度对其增殖的影响研究

[目的]纯化培养食蟹猴支持细胞,并测定不同血清浓度对细胞增殖的影响。[方法]分离并纯化食蟹猴支持细胞后,分别以5%、10%、15%、20%4种不同血清浓度的培养基对食蟹猴支持细胞进行培养。利用MTT比色法判断支持细胞的增殖情况,从而确定最佳的血清培养浓度。[结果]5%血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响与10%血清浓度的培养基差异不显著,15%与20%的血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响差异不显著,5%、10%与15%、20%的血清浓度的培养基对细胞增殖能力的影响差异极显著。[结论]15%的血清浓度是支持细胞增殖的最佳比例。     

红曲霉转化中药葛根固体发酵条件研究

[目的]研究红曲霉转化中药葛根固体发酵的条件,以期提高其转化率。[方法]对菌株YM3207转化葛根干粉的固体发酵培养条件和培养基进行了优化试验,通过菌种活化、种子培养、固体发酵培养方法以及正交试验考察了种子培养基、底物投入量、转化温度、转化时间因素的影响与红曲霉转化条件。[结果]红曲霉菌YM3207菌株在YPD液体培养基中28℃、200r/min下培养3d作为种子培养条件最为合适;采用固体发酵方式,以中药葛根为底物,10%接种量,28℃培养10d为红曲霉菌最佳转化条件;培养基组成为葛根粉：鲜豆渣：米粉为1：1：1,含水量为50%时,能够获得较高葛根素含量的转化产物。[结论]采用该条件发酵转化葛根能够提高葛根主要有效成分含量,利用微生物转化提高中药药效是可行的。     

不同培养条件对草麻黄愈伤组织麻黄碱含量的影响

[目的]探寻适宜草麻黄愈伤组织麻黄碱生成的最佳培养条件。[方法]采用乙醚抽提法提取麻黄碱,用紫外分光光度计测定麻黄碱含量,分别试验水解酪蛋白浓度、基本培养基、取材时间、摇床转速对麻黄碱含量的影响。[结果]适宜草麻黄愈伤组织麻黄碱生成的条件为以MS为基本培养基,以继代培养25 d的愈伤组织为材料,添加300.0 mg/L的水解酪蛋白,在转速110 r/min的摇床上悬浮培养。[结论]该研究为麻黄碱的植物细胞体外工厂化生产奠定了基础。