猪伪狂犬病病毒LA株的分离鉴定

从辽宁省某猪场大批死亡的新生仔猪脑及内脏中分离到多株病毒，通过初步验证后选择其中一代表毒株进行了鉴定。该病毒株在PK-15细胞上连续传12代均出现典型的细胞病变，用适应PK-15细胞的病毒接种Veto细胞、猪肾传代细胞IBRS-2及SPF鸡胚成纤维细胞均出现典型的细胞病变。在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子。该病毒对氯仿、乙醚敏感，在pH5．0-9．0下稳定，56℃30分钟即可灭活该病毒。该病毒能被伪狂犬病病毒标准阳性．血清中和。取处理后的病料上清液和传代病毒接种家兔均出现典型的伪狂犬病症状。用所分离病毒提取的DNA及培养病毒液经简单的预处理后作为模板，应用特异性引物进行PCR能扩增出伪狂犬病病毒1240bp的gD基因的特异性片段。结果表明，所分离病毒为伪狂犬病病毒，并将该毒株命名为猪伪狂犬病病毒IA株。     

伪狂犬病病毒HB-98株不同保存条件下病毒含量的比较

将同一批次的伪狂犬病病毒HB-98株病毒液与同一条件下冻干生产的成品分别在2℃～8℃和-20℃以下保存,间隔一定时间分别测定其病毒含量。发现无论在何种环境下保存,随着时间的推移,病毒含量趋于下降。但在一定时期内,病毒液在不同保存条件下病毒含量有明显区别,在2℃～8℃保存明显好于在-20℃以下保存;冻干后的成品在两种存放条件下短期存放则无明显区别。     

伪狂犬病病毒鄂A株gG^—／LacZ^＋突变株的构建

以从湖北某猪场分离鉴定的鄂A株为亲本，提取其基因组DNA，克隆含gG基因的SphI/KpnI片段，然后将LacZ基因融合到gG启动子下游，得到重组质粒pUSKZ,将重组质粒与鄂A株基因组共转染PK－15细胞，待细胞完全病变后，在X－gal存在下，作蓝斑筛选纯化。经斑点杂交和PCR扩增证实得到的是基因型为gG^-/LacZ^ 的重组伪狂犬病病毒。     

伪狂犬病病毒TJ-1株生物学特性研究

为了解天津地区伪狂犬病病毒TJ-1株的生物学特性,对该病毒进行了理化特性、免疫荧光、细胞培养特性和动物接种试验。结果表明,TJ-1毒株对乙醚、氯仿和胰蛋白酶均敏感;病毒在pH 5.0～8.0时比较稳定,在56℃下60min可被灭活;在PK-15、BHK-21和Marc-145细胞上均可生长,但呈现不同的细胞病变;在感染的PK-15细胞胞浆内可见绿色荧光;接种鸡胚绒毛尿囊膜可见白色的痘斑;人工感染家兔后,可引起家兔出现典型瘙痒症状并死亡。     

狂犬病病毒3aG株糖蛋白重组质粒构建及其体液免疫的研究

将狂犬病病毒3aG株糖蛋白克隆至真核表达载体pCI-neo中，构建了重组表达载体pCI-neorabG，以此免疫昆明种小鼠，3周后，取血进行ELISA检测。结果，试验组的10只小鼠中有9只抗狂犬病病毒抗体为阳性，而对照组的10只小鼠全部为阴性。试验初步表明，pCI－neorabG重组质粒有预防和治疗狂犬病的潜在应用价值。     

猪伪狂犬病变异株及其疫苗的研究进展

猪伪狂犬病(PR)是由猪伪狂犬病病毒(PRV)引发的高致死率的一种急性传染病。PRV变异株的出现使得PR在全国范围内广泛流传,其发病特征和致病性也变得十分严重,并且现有疫苗起不到完全的保护作用。本文对PRV变异株的致病性、分子特征和分子基础及PRV变异株疫苗研制等方面的研究进展进行了综述,以期为PRV的防控和净化提供新思路。     

狂犬病病毒特异性抗体保护致死性疾病攻击的效价测定

抗体在对抗多种感染源中扮演重要角色。中和作用是抗体最主要的功能,这些多功能蛋白的Fc及补体依赖活性是其在提供对抗多种病毒感染的保护能力中最关键的。体内抗病毒的保护作用很复杂,其中病毒中和作用(抗体使病毒失去感染力的能力,通常在体外进行)很重要,通常它仅仅占保护作用的一部分。荧光焦点抑制试验仍是检测狂犬病病毒中和抗体的金标准。除了中和试验,抗体的狂犬病病毒特异性抗原结合活性也可以通过酶联免疫吸附试验及其他备用方法进行测定。对于任何一种疾病,选择适当的试验测定抗体滴度,验证检测及如何进行判定是重要的考率因素。在替代保护分析试验和结果判断方法的选择中,必须仔细考虑检测狂犬病病毒抗体的单一实验室方法的固有局限性及所选方法的有效性。     

伪狂犬病病毒Ra株体外感染ST细胞超微结构的研究

本研究以伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)Ra株体外感染ST细胞为生物模型,通过透射电镜对PRV的增殖规律和致细胞病变的显微结构进行观察。结果显示,PRV能诱导ST细胞发生明显病变,细胞的病变程度与PRV感染时间密切相关。PRV Ra株感染ST细胞,病毒吸附于ST细胞表面,以膜融合内陷的方式进入细胞和细胞核内,在细胞核内复制,出现包涵体结构,以出芽方式离开细胞核,在高尔基体等细胞内膜结构处完成病毒粒子的囊膜化过程。感染前期,病毒通过膜融合方式被释放到细胞外,完成细胞间病毒的传播;感染后期,细胞溶解,大量释放病毒粒子。感染细胞超微结构的变化主要体现为:线粒体肿胀、数目减少,嵴面积减少,核内出现包涵体,细胞融合,细胞内空泡化严重,溶细胞现象。     

1株伪狂犬病病毒的基因变异及其对小鼠的致病性分析

本研究旨在了解我国猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)流行毒株的分子遗传变异及毒力特点。对1株分离自1个接种了Bartha-K61疫苗的规模猪场的PRV ZJ株进行了主要糖蛋白基因序列(gB、gC和gE)的测定分析及对6周龄BALB/c小鼠的致病性研究。遗传变异分析显示,该毒株与我国2012年后的流行毒株高度同源,具有变异毒株基因特征,但gE基因的510位氨基酸出现了不同于变异株的独特变化S⁵¹⁰G。ZJ株对小鼠具有较高的致病性,攻毒小鼠呈现典型的神经症状,以100 LD₅₀感染小鼠,第5天死亡率达100%。本研究为进一步探索该病毒的毒株变异特点与致病机理奠定基础。     

伪狂犬病病毒弱毒株LY株的分离鉴定

从辽阳某猪场的10日龄仔猪中分离到1株病毒，经纯化后测得其毒价为10^7．29TCID50／mL。细胞中和试验表明，该病毒能被猪伪狂犬病病毒标准阳性血清所中和。电镜下可见到典型的疱疹病毒粒子，具有囊膜及外周纤突。所分离的病毒对氯仿、胰蛋白酶、乙醚敏感，在pH5．0-9．0下稳定，56℃ 30min可以灭活。应用特异性引物，通过PCR能扩增出伪狂犬病病毒1240bp的gD基因。分离病毒对3日龄乳鼠有一定的致病力，但对家兔、3—5日龄仔猪及妊娠母猪都有很高的安全性。用不同剂量的病毒培养液肌肉注射于3—5日龄仔猪，14d后用10^5.7TCID50伪狂犬病病毒强毒攻击，所有试验仔猪均可得到有效保护。用分离毒免疫母猪，其后代可获高滴度的母源抗体，15日龄的仔猪能抵抗10^5.7TCID50强毒的攻击。试验的结果初步说明，所分离的病毒为伪狂犬病病毒(命名为PRVLY株)，并可能是一株弱毒株，而且具有很好的免疫保护作用。     

狂犬病病毒ERA株在犊牛睾丸细胞(BTC)上连续传代的稳定性及毒种批的制备与检验

将狂犬病病毒ERA株接种犊牛睾丸细胞进行了 2轮传代 ,并逐代测定毒价 (LD50 )。结果 :第一轮从 1 5代传至 2 6代 ,其毒价均 >1 0 4 .0 LD50 /0 .0 3mL ,但 2 0代以后似有下降趋势 ;第二轮从 1代传至 2 8代 ,9～ 2 2代毒价为 1 0 4 .5～ 1 0 5 .33LD50 /0 .0 3mL ,2 3代为 1 0 4 .0 LD50 /0 .0 3mL ,2 7、2 8代均 <1 0 4 .0 LD50 /0 .0 3mL。将第 6、1 6、2 8、2 9代ERA/BTC培养物和第 3代ERA/BHK 2 1细胞培养物分别作电镜负染观察 ,比较病毒颗粒形态 ,未见明显差异。将第 1 1代ERA/BTC培养物经冷冻真空干燥制成毒种批 ,其病毒含量为 1 0 5 .2 2 LD50 /0 .0 3mL ,水分≤ 2 .38% ,安全性、免疫原性、特异性和纯净检验均符合规定     

从克隆的cDNA拯救狂犬病毒HEP-Flury株

为研究狂犬病毒基因的结构,将狂犬病毒HEP-Flury株全基因组cDNA与N、P、L、G4个基因的辅助质粒共转染BHK-21细胞,于体积分数为5％CO2培养箱中培养6d,以狂犬病毒N蛋白荧光抗体染色。结果显示,细胞中含有大量的狂犬病毒粒子,表明已建立了狂犬病毒的反向遗传操作系统。     

狂犬病病毒CTN株糖蛋白基因的克隆与序列分析

克隆分离自我国狂犬病病毒固定毒CTN株糖蛋白基因,分析它的主要功能位点表明它具有319位的糖基化位点和完整的抗原位点,说明其具有用作疫苗株的潜力。并与国内外疫苗株、我国的3株街毒株、CVS株和Mokola毒株进行了同源性分析,表明我国疫苗株和CVS株与我国的街毒株相距最远,而CTN株与我国的3株街毒株相距最近,同属一个分支。     

应用电镜技术对狂犬病不同毒株的形态学研究

将狂犬病固定毒ＣＴＮ株（中国济南株）、ＣＶＳ株（国际标准攻击毒株）、ＥＲＡ株（兽用疫苗弱毒株）,分别在小鼠脑组织增殖及ＥＲＡ毒株在ＢＨＫ２１传代细胞增殖,通过超薄切片和负染色制备样品,电镜观察。结果发现,在相同鼠脑组织中,ＣＴＮ株病毒粒子比较难查找,而ＣＶＳ株和ＥＲＡ株较易被发现。另外,在不同毒株的脑组织和细胞培养物另还发现了大量的非典型粒子,诸如削了顶的粒子以及锥形、柱形等形态,同时还发现了胞浆包涵体。通过试验,我们认为：⑴典型病毒数量与免疫原性呈正相关。⑵在观察鼠脑细胞中的病毒时,发现有神经髓鞘部位是难以找到病毒粒子的。⑶狂犬病病毒粒子存在于宿主细胞浆内,核内未发现。     

伪狂犬病病毒Ra株对不同细胞增殖特性及致病性研究

本研究以伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)Ra株体外感染不同的细胞系为模型,研究PRV Ra株最适细胞系。试验采用ST细胞、PK-15细胞、Vero细胞、F81细胞、DF1细胞、MDCK细胞和CEF细胞7种细胞作为该毒株的接种对象,观察毒株在这几种细胞上病变特点、细胞病变时间及病毒增殖规律等并进行比较。观察结果发现,受试的各种细胞在PRV感染期间均能表现明显的细胞病变,但不同细胞在病变时间上存在较大差异,其中PK-15和ST细胞在感染后24 h内出现明显细胞病变,时间最早。TCID₅₀测定病毒增殖力结果表明,ST细胞在病毒增殖传代中毒力保持最好,与原毒株毒力相当,为10^6.9 TCID₅₀/0.1 mL。本试验结果表明,ST细胞是较适合于PRV Ra株体外研究的细胞系。     

鸡传染性法氏囊病病毒BJQ902株在DF-1细胞系上增殖工艺研究

试验旨在通过DF-1细胞增殖获得高效价的鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）抗原。通过病毒接种量、收毒时间、接毒时间、温度和维持液血清浓度5个培养条件的筛选和优化,对IBDV BJQ902株在DF-1细胞上的增殖工艺进行了研究。结果表明,IBDV BJQ902株在DF-1细胞上最佳增殖条件为：在37℃条件下培养,接毒量在0.01%~0.1%之间,接种时间为细胞传代后生长48~72 h,维持液血清浓度为1%~2%,收毒时间为病毒接种后60~72 h。在此培养条件下增殖病毒毒价在10^8.3~10^8.7 TCID₅₀/0.1 mL之间。     

Study on Proliferation Technology of Chicken Infectious Bursal Disease Virus BJQ902 Strain in DF-1 Cell Line

In order to produce high titers of infectious bursal disease virus(IBDV) antigen,the proliferation technology of chicken IBDV BJQ902 strain in DF-1 cell line was studied by the selection and optimization of the following five culture conditions,including the amount of inoculated virus,harvest time,inoculation time,culture temperature and serum concentration in maintenance media.The results showed that the optimal proliferation conditions of IBDV BJQ902 strain in DF-1 cell line were obtained as follow:The culture temperature was 37℃,the inoculum concentration was between 0.01% and 0.1% (V/V),the inoculation time was between 48 and 72 h after cell passage,the serum concentration in maintenance media was between 1% and 2%,the harvest time was between 60 and 72 h after inoculation.Under the optimal conditions,the virus titers were between 10^8.3 and 10^8.7 TCID₅₀/0.1 mL.     

鸡传染性支气管炎病毒M41株毒种保存期试验

对保存于中国兽医微生物菌种保藏管理中心的4个不同年代(1991年4月、1996年6月、2001年1月、2006年12月)冻干的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株毒种进行了对雏鸡的毒力和病毒含量测定试验,结果表明:4个不同保存年代的IBV M41株毒种均能使雏鸡100%出现鸡传染性支气管炎典型症状,病毒含量均≥10~(6.0)EID_(50)/0.1 mL。其中一支毒种在-70℃以下保存22年11个月,其毒力和病毒含量均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二○○○年版)规定,能够满足检验需求。本试验为探寻IBV M41株毒种更加合理的保存期提供了参考。     

狂犬病病毒鹿源野毒株与人疫苗株G基因的分子差异

本文通过反转录—聚合酶链反应 (RT- PCR)扩增并克隆了我国狂犬病病毒 (RV)鹿源野毒株 (82 0 2 )糖蛋白 (G)基因膜外主要功能区的两个片段 ,共 742个 bp(40 5～ 1 1 46) ,含有可以诱导中和抗体的多个抗原决定簇和决定毒力及与神经细胞受体结合部位的基因片段。采用 Sanger双脱氧终止法测定了克隆 c DNA片段的核苷酸序列并推导出了氨基酸序列。将82 0 2株与已发表的人疫苗株 (3a G)的相应序列输入计算机进行比较分析。结果表明两者在这一基因片段核苷酸序列和氨基酸序列分子差异很小 ,同源性极高 ,分别为 97%和 95.5% ,抗原决定簇内的氨基酸均未发生改变 ,只是 82 0 2株在 N2 4 7位缺少一糖基化位点。结合流行病学调查可推断 82 0 2株与中国疫苗株属于同源毒株 ,本研究结果提示应用人狂犬病疫苗预防鹿狂犬病将具有很好效果。     

一株狂犬病病毒街毒株的分离鉴定与组织培养

对来自河北省无极县某地区疑似狂犬病病犬脑组织进行FAT、电镜观察、RT-PCR扩增,以及MIT法等确诊为狂犬病,对分离到的这株狂犬病街毒命名为WJ07-1,分析N蛋白和G蛋白序列,主要抗原位点发生轻度变异,同源性分析发现N基因与ZhejiangWz(H)株同源性最高为99.0%,G基因与JSL27株同源性最高为99.4%。对分离到的狂犬病病毒进行组织培养发现这株狂犬病病毒街毒株对细胞的适应性和感染性很弱,需要进行多次传代培养,才可以适应N2a、BHK-21细胞。