影响辣椒T-DNA标签突变体库构建的转化因素探讨

以辣椒自交系H8124无菌苗子叶和下胚轴为外植体,采用根癌农杆菌侵染转化法,将T-DNA标签导入辣椒,以探讨影响转化效率的主要因素,包括外源植物生长调节剂浓度、农杆菌类型、外植体材料、预培养时间、侵染时间等。结果表明,采用苗龄10-15 d的子叶为外植体,预培养2 d后用农杆菌GV3101侵染5 min,外源植物生长调节剂为5.0mg/L 6-BA,辣椒的T-DNA转化可以获得较高的转化效率。     

甜瓜T-DNA插入突变体的构建

[目的]构建激活标签载体并将其转入甜瓜中,获得甜瓜T-DNA插入突变体,为甜瓜功能基因组学的研究奠定基础.[方法]用PCR法扩增目的DNA片段,经EcoRI和SacI顺序酶切,将目的片段连接到pCAMBIA2301载体上,构建含4 ×35s Enhancer DNA片段的激活标签载体.以甜瓜品种‘伽师’为材料,利用农杆菌介导的转化体系转化甜瓜愈伤组织,获得甜瓜T-DNA插入突变体.[结果]获得4株T0代甜瓜转化幼苗,通过Kan筛选和PCR鉴定甜瓜转化幼苗的DNA中是否含有目的基因,证明其中3株甜瓜转化幼苗为转基因植株.[结论]获得了突变植株,为甜瓜重要性状基因发掘奠定基础.     

应用T-DNA标签进行基因功能分析的步骤和方法

概述了应用T-DNA标签进行基因功能分析的步骤及获得突变体后标签基因的分离方法,对应用T-DNA标签进行基因功能分析研究具有一定的参考价值。     

T-DNA插入突变及其研究进展

T-DNA插入突变在反向遗传学和功能基因组学研究中发挥着重要作用。文中综述了T-DNA插入突变的原理以及在拟南芥和水稻等模式植物中的研究现状,同时指出了该技术的优缺点及发展方向。     

水稻T-DNA插入启动子捕获系的初步筛选

利用农杆菌介导法将含报道基因β-glucuronidase(GUS)无启动子的转化载体pCAMBIA1300GUSAHyg导入籼稻明恢86获得水稻启动子捕获系.水稻启动子捕获系潮酶素抗感分离比χ2分析表明:39个水稻启动子捕获系中有28个为单T-DNA位点插入.2 653个水稻启动子捕获系报告基因GUS表达检测结果表明...     

插入T-DNA片段构建部分水稻突变体株系

 通过农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导,将T-DNA片段高效插入水稻中花11的基因组DNA中。利用二次枝梗种子和未成熟种子的盾片愈伤组织作为转化起始物,探索并优化了影响愈伤组织诱导率、再生率和转化率的试验条件,得到近10 000株转化植株。经PCR分析和Southern 杂交证明已将外源基因整合到水稻基因组中。当代转基因植株可抗0.2%的除草剂Basta。200余棵T0代转化株系出现白化苗、宽叶、狭叶、黄叶、高秆、矮化并杂草化、不育、白化穗、皱穗和抽穗延迟等突变表型,结实率普遍较低     

T-DNA标签技术及其在水稻基因克隆中的应用

T-DNA标签技术是一种高通量的分离和克隆植物功能基因的方法。本文介绍了T-DNA标签方法的基本原理和操作步骤,概述了该法的优缺点和在水稻基因克隆研究中的应用。     

双T-DNA反式串联植物表达载体构建与验证

通过对双T-DNA串联结构的改变,构建2个双T-DNA反式串联的植物表达载体p1300-DMAR-LF-GCMSAGS和p1300-DMAR-LF-GLCMSAGS。经过转化水稻后验证,结果表明:能够获得无选择标记基因的转基因植株;与顺式串联植物表达载体比较,反式串联的植物表达载体成功地将非连锁共整合的频率分别由47.37%和45.83%提高到了55.81%和51.28%,提高无选择标记基因转基因植株的筛选效率。     

重组质粒BT24的构建

用ＢａｍＨ Ｉ从植物表达载体ｐＢＨ１９中,酶切回收含３５Ｓ启动子与Ｎｏｓ终止子的胰蛋白酶抑制因子基因（ＨＲＴＩ）片段,将其克隆到植物表达载体ｐＴＨＹ４８的ＢａｍＨＩ位点,构具潮霉素选择标记的植物表达载体ｐＢＴ２４。经Ａｇｒｏｓｅ ｇｅｌ检测和酶切鉴定,获得具有胰蛋白酶抑制因子基因和潮霉素抗性基因的植物表达载体ｐＢＴ２４。     

基于酿酒酵母的多片段质粒的构建

为避免现有的多片段质粒构建技术的弊端,提高多片段质粒构建效率,以构建树干毕赤酵母Agglutinin-like基因的敲除载体为例,利用酿酒酵母活体细胞重组系统,一次性将多个外源DNA片段和线性化质粒重组,形成环状质粒。通过引物设计在相互连接的DNA片段之间引入50bp重叠序列,用PCR扩增DNA片段后,与线性化质粒一起转化酿酒酵母,再用PCR和测序等方法鉴定阳性酵母菌落中质粒的正确性。通过本方法构建的多片段质粒正确率高、耗时短。     

盐芥T-DNA插入突变体库的建立及初步分析

以盐芥[Thellungiella halophila(C.A.Mey.)O.E.Schulz]为材料,利用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的转化方法,获得T-DNA插入突变群体,构建了一个具有5 000株抗Basta/Kan的盐芥T-DNA插入突变体库,其中有若干个株系有明显的表型改变,包括花期的改变、株型矮小、叶片形状改变等。并优化了建库的各因素,确定了最佳的盐芥栽培技术及转化体系,盐芥春化温度及时间为4℃、30 d,转化用菌液浓度OD600≈2.0,侵染时间2 min,暗培养1 d,Kan筛选浓度50 mg/L,除草剂(Basta)筛选浓度为稀释1 500倍;这些因素可为根癌农杆菌介导的盐芥转基因、突变体构建等基因组学研究提供强有力的技术平台。     

转抗草甘膦基因烟草T-DNA侧翼序列的扩增与分析

[目的]研究抗草甘磷基因在烟草中的插入位点、T—DNA结构等整合情况。[方法]利用现有的3个转抗草甘膦基因的烟草材料,通过PCR Walking的方法扩增出携带抗草甘膦基因的T-DNA侧翼序列,并用DNAMAN、BLAST等生物信息学方法进行分析。[结果]对获得的PCR条带进行分析,结果表明这些侧翼序列均含载体骨架序列且结构各不相同。T-DNA和载体骨架序列都存在重组现象。[结论]研究在转基因植株中检测到了载体的骨架结构,说明转基因的同时有可能会造成非目的基因的转移,即转基因植物存在一定的风险,应对转基因植物转化载体和基因工程技术路线进一步改良。     

T—DNA诱发的小麦强分蘖突变体研究初报

利用农杆菌介导的小麦活体转化技术转化多个小麦品种,得到一定数量的小麦转化体植株。在小麦品种鲁麦21的遗传转化体T0代植株中发现一强分蘖突变体,通过PCR技术和Southern杂交技术证明该突变体含有T-DNA序列;该突变体表现为单基因隐性突变,在突变体T3代中均能通过PCR扩增到T-DNA内的序列,表明该突变体为T-DNA插入诱发的突变体。通过对该突变体初步分析表明突变基因与温度应答有关,随温度的降低,突变体分蘖速度加快。     

可去除选择标记的DREB基因双T-DNA载体共转化玉米

通过体外重组构建双T-DNA双元载体pCDMARpWDT-Hyg,选择标记基因hpt(hygromycin phospho-transferase)和抗逆转录因子基因DREB分别位于两个独立的T-DNA。用农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织,通过在抗性培养基上严格筛选,在获得的再生转化植株中,同时整合hpt基因和DREB基因的共转化率达到26·3%。该转化系统的建立为下一步得到无选择标记的转基因植株奠定基础。此外,本实验还通过gus基因的瞬时表达分析了农杆菌转化玉米的影响因素。     

稻瘟菌若干T-DNA插入突变体初步分析

为揭示稻瘟菌致病分子机制,创建了该菌T-DNA插入突变体库．部分突变体经表型分析,获得3个生长发育及致病性同时发生变异,5个生长发育正常但致病性变异及2个生长发育变异但致病性正常的突变体；以TAIL-PCR方法获得了这些突变体T-DNA插入位点及其边界序列,并用生物信息方法对被T-DNA标签的基因进行了分析,为进一步研究这些基因的功能提供了重要信息．     

利用小分子DNA鉴定重金属离子对DNA的损伤(英文)

[目的]利用小分子DNA鉴定重金属离子对DNA的损伤。[方法]将pUC18DNA分子暴露于Hg2+、Cr6+、Pb2+、Cd2+4种重金属离子环境中,经一定时间处理后对DNA分子进行生物活性研究,并用凝胶电泳和增色效应分析了重金属离子对DNA分子生物活性影响机制。[结果]DNA活性分析表明,4种重金属对pUC18的影响程度为Hg2+>Cr6+>Pb2+>Cd2+;凝胶电泳和增色效应结果表明,4种重金属离子主要是引起DNA分子交联导致其生物活性的降低,交联程度为Hg2+>Cr6+>Pb2+>Cd2+。[结论]该研究表明,pUC18DNA分子可用作鉴定重金属离子对DNA损伤的依据,为评价重金属对DNA毒害作用提供了一种简捷有效的技术方法。     

禾谷类作物T-DNA插入突变体库专用载体pBA9N的构建

为进行小麦等禾谷类作物的突变体库构建,以pBRACT806载体为基本骨架,通过Gateway克隆技术,将选择标记基因NptⅡ,置于玉米ubiquitin启动子的控制之下,构建了pBA9N载体.该载体适于在单子叶植物中进行遗传转化,且小仅有6 478 bp,易于操作;此载体与psoup载体共转化,保证了T-DNA片段高效整合到植物基因组中.应用该载体构建突变体群体,可稳定持续高效表达NptⅡ抗性标记基因,易于检测.     

利用小分子DNA鉴定重金属离子对DNA的损伤

[目的]利用小分子DNA鉴定重金属离子对DNA的损伤。[方法]将pUC18 DNA分子暴露于Hg2+、Cr6+、Pb2+、Cd2+4种重金属离子环境中,经一定时间处理后对DNA分子进行生物活性研究,并用凝胶电泳和增色效应分析了重金属离子对分子生物活性影响机制。[结果]DNA活性分析表明4,种重金属对pUC18的影响程度为Hg2+>Cr6+>Pb2+>Cd2+;凝胶电泳和增色效应结果表明4,种重金属离子主要是引起DNA分子交联导致其分子生物活性的降低,交联程度为Hg2+>Cr6+>Pb2+>Cd2+。[结论]该研究表明,pUC18DNA分子可用作鉴定重金属离子对DNA损伤的依据,为评价重金属对DNA毒害作用提供了一种简捷有效的技术方法。