禽流感病毒H5和H9亚型RT-PCR检测方法的建立

根据H5和H9亚型的HA基因,设计合成2对特异性引物,分别建立了RT-PCR检测方法,优化了反应体系及反应条件,该方法敏感性可达10^-3,特异性好,与NFV、IBV与H5与H9相互间无交叉反应。利用所建立的RT-PCR检测了10份活禽及禽产品中存在的H5和H9亚型禽流感病毒,其检测结果与病毒的分离培养一致,比电镜和琼扩的检出率高30％,与其他NDV、IBV的病料无交叉反应,证明该方法具有很好的应用价值。     

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。     

H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

[目的]建立可同时鉴别检测H9和H10亚型禽流感病毒(AIV)的二重RT-PCR检测方法。[方法]根据GenBank中H9和H10亚型AIV的HA基因保守序列,分别设计2对特异性引物,优化引物之间的浓度与退火温度等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H10亚型AIV的二重RT-PCR检测方法。[结果]特异性试验结果表明,该方法可以特异性扩增出H9和H10亚型AIV对应大小的目的条带,而对其余亚型禽流感病毒及其他禽病病原体均未扩增出特异性条带。同时,该检测方法对H9和H10亚型AIV的扩增下限均为5×10~4拷贝/μL。临床样品的检测结果表明其与病毒分离结果相一致(100%)。[结论]该研究建立的二重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高,可在一管内同时鉴别检测H9与H10两种亚型AIV,为H9与H10亚型AIV的监测提供了技术支撑。     

H9和H10亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H9和H10亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因及所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计3对特异性引物,并优化退火温度和引物浓度及其配比等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H10亚型AIV的三重RT-PCR检测方法。特异性实验结果表明,该方法可以特异性地扩增出H9、H10亚型AIV及M基因对应大小的目的条带,而对其余亚型AIV仅M基因出现特异性条带,其它禽病病原体均未扩增出任何特异性条带。敏感性实验结果表明,该方法对H9、H10亚型HA基因及M基因质粒的扩增下限均为5×10~4拷贝/μL。此外,该方法对临床样品的检测结果与病毒分离及测序结果完全一致。     

H9和H10亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H9和H10亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因及所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计3对特异性引物,并优化退火温度和引物浓度及其配比等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H10亚型AIV的三重RT-PCR检测方法。特异性实验结果表明,该方法可以特异性地扩增出H9、H10亚型AIV及M基因对应大小的目的条带,而对其余亚型AIV仅M基因出现特异性条带,其它禽病病原体均未扩增出任何特异性条带。敏感性实验结果表明,该方法对H9、H10亚型HA基因及M基因质粒的扩增下限均为5×10⁴拷贝/μL。此外,该方法对临床样品的检测结果与病毒分离及测序结果完全一致。     

H9和H6亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

为H9与H6亚型禽流感病毒(AIV)的监测及其防控提供技术支撑,依据Genbank中H9和H6亚型AIV的HA基因及所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计3对特异性引物,优化退火温度和引物浓度及其配比等条件,建立并优化可同时鉴别检测H9和H6亚型AIV的三重RT-PCR检测方法,并对所建方法进行特异性、敏感性及临床样品检测验证。结果表明:三重RT-PCR反应的最佳体系为2×PCR Mix 12.5μL,H9与H6亚型AIV cDNA共2μL为模板,特异性引物M-F和M-R(20pmol/μL)加入量为0.6μL,特异性引物H9-F和H9-R(20pmol/μL)及H6-F和H6-R(20pmol/μL)的加入量分别为0.7μL和1μL,用RNA-free水补足至终体积为25μL,退火温度53℃。该方法可在一个反应管内同时鉴别检测H9与H6亚型AIV,特异性强,敏感性高,可推广应用。     

H5、H7、H9亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H5、H7、H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白(HA)编码基因,使用DNAStar软件比较分析筛选出特异的保守片段,设计3对引物H5-P1/H5-P2、H7-P3/P4和H9-P5/P6。在此基础上,建立了H5、H7、H9亚型禽流感的三重RT-PCR检测方法,本方法可同时检测出样品中的H5、H7、H9亚型禽流感病毒。敏感性试验结果表明,该方法检测H5、H7、H9亚型禽流感RNA的敏感性分别达2.80、10.50、5.73 pg/μL,该方法检测其他相关病毒时均为阴性,具有很高的特异性,此外,该方法具有良好的重复性。利用所建立方法对240份禽流感临床样品进行检测,结果与血凝试验和血凝抑制试验结果的符合率为100%。此诊断方法检出时间早,且特异、敏感、经济、快速,可普遍推广,在禽流感诊断和防制中具有重要意义和应用价值。     

鸭H9亚型禽流感油乳剂灭活疫苗的免疫原性

对从发病雏鸭体内分离到的H9亚型禽流感病毒NJ01株[A/Duck/Nan jing/01/1999(H9N2)]进行了免疫原性研究。以含有108.0ELD50和108.5ELD50的NJ01进行静脉注射攻击无H9亚型禽流感抗体的26日龄、44日龄和140日龄鸭,结果显示,对小于44日龄和大于44日龄鸭分别以108.0ELD50和108.5ELD50病毒含量的NJ01株静脉攻击,攻毒后1~2 d的喉拭子病毒分离率均为80%以上。将病毒含量为107.9ELD50的NJ01株油乳剂灭活苗,肌肉途径免疫8日龄和28日龄鸭,在免疫后的第7 d、14 d和21 d用含108.0ELD50和108.5ELD50的NJ01静脉注射攻击,攻毒后取1~2 d喉拭子进行病毒重分离,结果表明,免疫后7 d产生抗体,14 d产生坚强免疫力,21 d相对保护率达100%。     

H9亚型禽流感病毒免疫磁珠分离方法初步建立

禽流感病毒(AIV)严重危害世界养禽业,是举世瞩目的重大人畜共患病原,环境中微量病原是潜在的重要传染源,很难进行监测。为了提高畜禽环境中微量病原的监测效率,样品的必要预处理非常重要。制备了粒径约30~100 nm的Fe_3O_4纳米粒子,并利用戊二醛二步法偶联H9-HA单抗和磁珠,偶联效率约为130 mg/g;200μL免疫磁珠(5.6 mg/m L)可分离纯化100μL血凝价为28的AIV-H9。制备的免疫磁珠可以为纯化和富集畜禽生活环境中的微量病原提供便利,结合其他病原检测手段将有助于提高环境中病原的监测效率。     

商品鸭H9亚型禽流感病毒与鸭疫里默氏杆菌混合感染的诊断

[目的]对某肉鸭场病死鸭进行病原学诊断。[方法]通过细菌分离培养等常规细菌学鉴定方法,并结合PCR、RT-PCR等分子生物学手段对病死鸭的病原体进行分离与鉴定,并对分离到的细菌进行药敏试验。[结果]该批病死鸭的发病原因确定为H9亚型禽流感病毒与鸭疫里默氏杆菌混合感染。药敏试验结果表明,分离的鸭疫里默氏杆菌只对多西环素、头孢他啶以及环丙沙星、诺氟沙星等喹诺酮类药物敏感。[结论]该药敏试验结果可为临床预防和治疗鸭疫里默氏杆菌感染的用药选择提供一定的参考依据。     

H9亚型禽流感病毒间接免疫荧光检测方法的建立与比较

将禽流感病毒(AIV)接种犬肾上皮细胞(MDCK),24h后以鸡抗禽流感抗体和兔抗鸡荧光抗体进行间接免疫荧光试验(IFA),结果于细胞核、细胞质内观察到特异性的荧光。利用96孔细胞板培养MDCK细胞,以间接免疫荧光作为判定指标对禽流感病毒进行毒力测定,并与禽流感病毒通用荧光反转录-聚合酶链反应(荧光RT-PCR)检测方法进行比较。结果表明间接IFA、荧光RT-PCR对同一样品检测的最高稀释度分别为10-5.25TCID50和10-6,Ct<30,两种方法对禽流感病毒的检测敏感性均很高。但由于荧光RT-PCR仅对抽提的RNA进行检测,而间接IFA是对禽流感活病毒进行检测,因此在临床样品检测和动物产品检疫中间接IFA更具准确性和实用性。     

肉鸽H9亚型禽流感的诊断与病毒分离及鉴定

通过分子PCR检测,初步证明在湖北一发病肉鸽群感染H9亚型禽流感病毒。病原分离后,盲传3代,其血凝效价达到109~1011,经生物学特性进行测定,其鸡胚半数致死量为107.5,9日龄鸡胚平均致死时间为54.3 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数为1.8,6周龄小鸡静脉接种致病指数为2.0,证明该H9亚型禽流感为毒力较强。将该病毒回归非免疫肉鸽,能产生典型的H9亚型禽流感症状,采集其肺、喉头、泄殖腔等病变组织进行病毒分离,均可分离到H9亚型AIV。     

基于荧光熔解曲线模式RT-PCR快速检测H5N1亚型禽流感病毒

针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因保守序列设计2对引物,建立了SYBR Green Ⅰ双重荧光RT-PCR(RRT-PCR)方法,实现了同一反应管内同时检测AIV的H5和N1亚型基因.熔解曲线分析显示,H5和N1扩增片段的熔解温度分别为(795±03)℃和(833±03)℃,无引物二聚体形成,扩增产物片段大小分别为150bp和474bp,与预期大小相符,测序结果证实为H5和N1亚型基因的靶序列.该方法能从H5N1样本中检出阳性扩增信号,熔解曲线可见H5和N1双特异峰;而H5N2样本有阳性扩增,熔解曲线仅见H5单特异峰.AIV的其他HA亚型和其他病毒的RNA、DNA 无扩增信号.本法最低可检测210拷贝·μL-1和195拷贝·μL-1 H5和N1重组质粒,敏感度分别是RT-PCR的100、1 000倍.本研究建立的基于荧光熔解曲线模式RT-PCR可用于H5N1亚型AIV的检测.     

H5和H9亚型禽流感病毒反向斑点杂交同步检测法的建立

【目的】建立H5和H9亚型禽流感病毒的反向斑点杂交鉴别诊断方法。【方法】在H5和H9亚型禽流感病毒血凝素基因的保守区段内,选择设计2对引物,RT-PCR扩增后将目的片段克隆到pGEM-T载体中,得到重组质粒pGEM-T-H5与pGEM-T-H9。以重组质粒为模版,选择合成寡核苷酸探针与生物素标记引物。将探针通过紫外交联方法固定在带正电荷的尼龙膜上,用生物素标记引物扩增特异性片段,扩增产物经热变性后与探针进行杂交,杂交后显色,出现明显蓝紫色斑点的判定为阳性,无斑点判定为阴性。【结果】利用建立的反向斑点杂交方法检测,H5、H9亚型禽流感病毒的血凝效价分别可达到2-9.6和2-11.9,杂交特异性好,且2亚型间无交叉反应。【结论】建立了H5和H9亚型禽流感病毒的反向斑点杂交检测方法,该方法灵敏度高、特异性好,可以实现H5与H9亚型禽流感病毒的鉴别诊断。     

H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体制备及鉴定

[目的]制备H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)单克隆抗体,为检测诊断AIV提供技术支持.[方法]以灭活H9亚型AIV广西分离株为免疫原,免疫6~8周BALB/c雌性小鼠,然后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经血凝抑制试验(HI)及间接免疫荧光试验(IFA)筛选H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞.[结果]经过4次亚克隆,获得3株稳定的H9单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为8A4、1B11和7F1细胞株,其细胞株培养上清液HI效价为27~210,腹水HI效价为216~219;单克隆抗体亚类鉴定结果表明,3株H9单克隆抗体均属于IgG1亚类,其轻链均为K链.3株H9单克隆抗体只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而与其他HA亚型AIV及新城疫病毒(NDV)、减蛋综合症病毒(EDS)、传染性支气管炎病毒(IBV)无交叉反应.3株H9单克隆抗体细胞株的抗体分泌能力稳定性良好.[结论]用灭活H9亚型AIV为免疫原能成功制备针对H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体,且具有良好的亚型广谱性和特异性.     

广西猪源H9N2亚型流感病毒全基因组序列分析

[目的]了解广西猪源H9N2亚型流感病毒的来源及变异情况,为有效防控广西猪源H9N2亚型流感病毒奠定基础.[方法]运用RT-PCR对广西分离株A/SW/GX/S11/05( H9N2)进行全基因组扩增,并克隆测序及对比分析.[结果]扩增获得的HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因片段长度分别为1683、1401、1497、1027、890、2233、2280和2151 bp,其推导氨基酸分别为561、467、499、349、338、744、760和717 aa.经过序列分析,发现各基因片段的核苷酸及其推导氨基酸与A/Bird/GX/62/05株的同源性最高,分别为96.2%~ 100.0%和98.5%~99.6%;系统进化分析也表明A/SW/GX/S11/05株与A/Bird/GX/62/05株的亲缘关系最近.[结论]广西猪源H9N2亚型流感病毒属于欧亚谱系的北京亚系,且在一定时间内不同宿主间均有感染,在今后的流感病毒防治工作中,跨种属传播是一个不可忽视的问题.     

H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其表位鉴定

[目的]制备H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体和鉴定表位。[方法]选取H9N2亚型禽流感病毒(AIV)WD-1株的纯化抗原免疫BALB/c小鼠,对获得2株抗H9N2亚型禽流感病毒的特异性单抗4C10和6E3表位进行鉴定。[结果]单抗4C10和6E3分别属于IgG1和IgG2b亚型,ELISA检测效价分别为1∶10~3和1∶10~5;HI效价分别为2~(15)和2~(14);2株单抗均具有鸡胚中和活性。利用噬菌体展示表位技术对2株单抗的抗原表位进行鉴定,结果显示均为针对HA蛋白的1个线性表位。[结论]该研究为禽流感病毒快速诊断方法的建立提供了依据。     

不同培养基对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上的增殖效果研究

[目的]比较3种培养基对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上的增殖效果。[方法]采用DMEM+10%血清、低血清培养基(MEM-MD-611)、无血清培养基(SFE4Mega)3种培养基制备MDCK细胞单层,分别接种不同稀释度的H9亚型禽流感病毒。然后,分别加入含10μg/ml胰蛋白酶的3种培养基作为维持液,培养病毒,每隔24 h观察其细胞病变,并测定上清HA滴度。[结果]在培养72～96 h时,无血清培养基病毒液的HA滴度高于低血清培养基,而低血清培养基则高于含血清培养基。[结论]3种培养基均可用于制备禽流感病毒抗原,其中无血清培养基、低血清培养基更适用于流感病毒抗原的制备。     

禽流感病毒H5,H7,H9亚型多重RT-PCR检测方法的建立

依据GenBank中亚洲流行株禽流感病毒(AIV)H5,H7,H9亚型血凝素基因及M基因序列保守区域设计特异性引物,利用多重反转录聚合酶链式反应技术建立了AIV及H5,H7,H9亚型的检测方法.该方法能一次性检测出AIV保守区域M基因的同时,直接区分H5,H7,H9亚型.对新城疲病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒等特异性检测均为阴性.样品经100倍稀释后仍能检出.