双齿围沙蚕CYP4基因的克隆及序列分析

根据已知的绿沙蚕Nereis virens细胞色素氧化酶CYP342A1保守区设计引物,采用RACE技术首次从双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis体壁肌肉中克隆出细胞色素氧化酶CYP4基因全长序列。分析结果表明,该序列全长为1 857 bp,5'端非翻译区为186 bp,3'端非翻译区为225 bp,阅读框为1 446 bp,编码为481个氨基酸。第422～431氨基酸序列符合P450所具有的结构保守共有序列FxxGxxxCxG,第319～322氨基酸序列为K螺旋特征基序ExxR区,第282～294氨基酸序列含有CYP4家族特征序列EVDTFMFEGHDTT。经Blast与GenBank中已知物种的氨基酸序列进行同源性比对,CYP4与多毛类绿沙蚕Nereis virens CYP4BB1、CYP342A1(AY453408)氨基酸同源性为73%、36%,与多毛类小头虫Capitella capitata CYP4AT1(AY574044)同源性为39%。据此推断,双齿围沙蚕CYP4基因属于CYP4B亚家族。     

双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD cDNA基因的克隆及序列分析

根据已知多毛类Alitta succinea铜锌超氧化物歧化酶（ Cu/Zn-SOD）基因序列设计引物,利用同源克隆及RACE方法首次从双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis中克隆得到Cu/Zn-SOD基因全长cDNA序列。结果表明：双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD基因cDNA全长870 bp,其中包括156 bp的5′端非编码区,261 bp 3′端非翻译区和453 bp 开放阅读框,编码150个氨基酸;该蛋白序列具有典型的Cu2＋和Zn2＋结合位点,并具有两处Cu/Zn-SOD 蛋白家族标签序列。通过生物信息学分析表明,该蛋白属于胞内Cu/Zn-SOD,理论相对分子质量为15249900,等电点为5.66,无信号肽和跨膜区,推测为亲水性蛋白。同源性分析表明,双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD氨基酸序列与部分软体动物、鱼类和昆虫的Cu/Zn-SOD蛋白序列具有很高的相似性。该研究结果为后续研究Cu/Zn-SOD与环境污染物之间的剂量效应关系奠定了基础,为研究双齿围沙蚕机体的防御机制提供了基础资料。     

双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD cDNA基因的克隆及序列分析

根据已知多毛类Alitta succinea铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因序列设计引物,利用同源克隆及RACE方法首次从双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis中克隆得到Cu/Zn-SOD基因全长cDNA序列。结果表明:双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD基因cDNA全长870 bp,其中包括156 bp的5'端非编码区,261 bp 3'端非翻译区和453 bp开放阅读框,编码150个氨基酸;该蛋白序列具有典型的Cu2+和Zn2+结合位点,并具有两处Cu/Zn-SOD蛋白家族标签序列。通过生物信息学分析表明,该蛋白属于胞内Cu/Zn-SOD,理论相对分子质量为15 249 900,等电点为5.66,无信号肽和跨膜区,推测为亲水性蛋白。同源性分析表明,双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD氨基酸序列与部分软体动物、鱼类和昆虫的Cu/Zn-SOD蛋白序列具有很高的相似性。该研究结果为后续研究Cu/Zn-SOD与环境污染物之间的剂量效应关系奠定了基础,为研究双齿围沙蚕机体的防御机制提供了基础资料。     

双齿围沙蚕Hsp70 cDNA基因的克隆及序列分析

根据已知巨型管状虫Riftia pachyptila热休克蛋白70(Hsp70)基因序列设计引物,应用同源克隆策略和RACE技术首次从双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis体壁肌肉中克隆获得Hsp70 cDNA序列。结果表明:双齿围沙蚕Hsp70 cDNA序列全长为2 336 bp,包括5'端非翻译区88 bp、3'端非翻译区286 bp和开放阅读框1 962 bp;整个开放阅读框编码653个氨基酸,包含Hsp70家族3个特征区域;通过生物信息学分析表明,该蛋白是一种无信号肽跨膜蛋白,理论等电点为5.14,相对分子质量为71 396,半胱氨酸(Cys)含量为0.8%;同源性分析表明,双齿围沙蚕Hsp70氨基酸序列与其他真核生物的Hsp70序列具有很高的相似性。该研究结果可为进一步开发沙蚕Hsp70作为监测海洋污染的一种生物标记物提供重要的参考依据。     

双齿围沙蚕的生活史

为系统了解双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis的生活史,通过人工培育方法观察了其胚胎和幼虫发育全过程,并通过解剖观察了卵的发生及正常个体变态为生殖态异沙蚕体的过程。结果表明:双齿围沙蚕的受精卵采取螺旋型卵裂,形成实心囊胚,经原肠胚后发育为担轮幼虫、疣足幼虫、稚沙蚕和成体沙蚕;卵的发育在体腔内经历卵原细胞期、小生长初级卵母细胞期、大生长初级卵母细胞期和成熟初级卵母细胞期后排出体外,并在受精后进一步形成次级卵母细胞和卵细胞;当正常个体变态为异沙蚕体时,会发生体长明显缩短、腹部变白、眼睛变大和疣足变薄等变化,异沙蚕体繁殖后死亡;研究过程中还观察到幼虫循环系统的发生和红斑等现象。本研究结果可为全面掌握双齿围沙蚕的生活史及开展人工养殖业提供基础数据。     

双齿围沙蚕pH耐受性试验

在静水密封条件下,采用急性试验法研究双齿围沙蚕在不同pH水环境中存活情况。研究结果表明,沙蚕具有较广的pH耐受范围。     

双齿围沙蚕配子发生的组织学观察

采用组织学方法观察了双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis配子的发生过程,研究了配子发生各时期的形态结构。结果显示：双齿围沙蚕原生殖细胞起源于体壁上皮细胞,生殖细胞形成后进入体腔当中,在体腔液中生长、增殖;双齿围沙蚕的卵子发生过程经历了卵原细胞期、初级卵母细胞期、次级卵母细胞期和成熟卵母细胞期;精子发生经历了精原细胞期、初级精母细胞期、次级精母细胞期、精细胞期和精子期。     

双齿围沙蚕配子发生的组织学观察

采用组织学方法观察了双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis配子的发生过程,研究了配子发生各时期的形态结构。结果显示:双齿围沙蚕原生殖细胞起源于体壁上皮细胞,生殖细胞形成后进入体腔当中,在体腔液中生长、增殖;双齿围沙蚕的卵子发生过程经历了卵原细胞期、初级卵母细胞期、次级卵母细胞期和成熟卵母细胞期;精子发生经历了精原细胞期、初级精母细胞期、次级精母细胞期、精细胞期和精子期。     

双齿围沙蚕精子的超显微结构研究

[目的]对双齿围沙蚕精子的外观形态以及内部的超显微结构进行观察。[方法]采用扫描电镜和透射电镜技术对双齿围沙蚕精子的超显微结构进行观察。[结果]双齿围沙蚕的精子结构为鞭毛型,精子由头部、中部和尾部3部分组成,其精子全长为22～23μm,头部长度为2.8～2.9μm,宽度为1.6～1.7μm,顶体长度为0.9～1.0μm。双齿围沙蚕精子的头部外形呈倒状且尖锐的"漏斗"形,可见顶体膜,且膜内有一根柱状的亚顶体腔,腔内分布着大小不一的丝状体及一些细小颗粒。在顶体下方的细胞核内部充满染色质,是整个精子中密度最高的部分。双齿围沙蚕精子中部的线粒体为卵圆形,数量为5～6个。尾部呈现鞭毛型,而轴丝为典型的"9+2"结构。[结论]该研究可为双齿围沙蚕的人工繁育提供理论依据。     

养殖盐度对双齿围沙蚕生长及品质的影响

本实验设置15,20,25,30,35和40共6个养殖盐度处理组,对平均湿重2.32±0.2 g的双齿围沙蚕进行为期30d的养殖实验,实验结束后测定存活率、增重率、肢体完整率和基本营养成分（粗灰分,粗脂肪和粗蛋白）等指标。结果表明：各盐度处理组成活率均在80%以上,且差异不显著（P>0.05）;各处理组沙蚕体重均为负增长,盐度20和25的2个处理组的增重率差异不显著（P>0.05）,但均显著高于盐度15的处理组（P<0.05）,同时显著低于盐度30及以上的处理组（P<0.05）,盐度30及以上的各处理组增重率差异不显著（P>0.05）。肢体完整率在盐度15时显著最低（P>0.05）,其他盐度组肢体完整性上下波动但差异不显著（P>0.05）;随盐度增加,粗灰分含量下降,粗蛋白含量和粗脂肪含量均先降低后升高;相对高盐度（35、40）条件,低度盐（15、20）条件对生长和基本营养成分的影响程度更大,养殖时可结合对品质需求选择不同盐度。     

双齿围沙蚕消化道共栖微生物菌群多样性的PCR-DGGE分析

将采自青岛市沿海潮间带的双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis(体质量为4～5 g)置于无菌海水中暂养24 h后,分别从5条双齿围沙蚕消化道中提取微生物基因组总DNA,应用细菌16S rDNA通用引物341f/534r进行细菌16S rDNA基因V3高变异区的PCR扩增,再将PCR产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),从而获得样品消化道共栖微生物群落特征的DNA指纹图谱。通过对指纹图谱半定量分析发现,采集的双齿围沙蚕消化道共栖微生物菌群多样性丰富,优势条带明显,不同个体间既存在共同的微生物种属,也有各自特异的种属。其中存在一条共同的优势条带,但优势条带含量存在个体间差异。分别对DGGE指纹图谱中公共条带序列进行测序比对,结果表明,产丙酸菌属Propionigenium分别为5个样品中的优势菌群,假交替单胞菌属Pseudoalteromonas广泛分布于双齿围沙蚕消化道中。研究表明,基于16S rDNA的PCRDGGE图谱技术是分析双齿围沙蚕及其他海洋沉积食性无脊椎动物消化道微生物菌群结构较为有效的手段。     

马拉硫磷对双齿围沙蚕乙酰胆碱酯酶和过氧化氢酶的影响

采用浓度梯度污染暴露室内模拟方法,研究了沙蚕暴露于不同浓度有机磷农药马拉硫磷的急性毒性效应,以及低浓度马拉硫磷对双齿围沙蚕乙酰胆碱酯酶(AChE)和过氧化氢酶(CAT)的影响。结果表明,马拉硫磷对沙蚕48、72、96h的LC50分别为71.68、49.21、33.16mg·L-1,安全浓度为3.32mg·L-1。在低浓度(0.0018～9mg·L-1)马拉硫磷中暴露3和6d,沙蚕体内乙酰胆碱酯酶活性受到显著抑制,暴露6d时9mg·L-1浓度组最高抑制率达88.92%,且乙酰胆碱酯酶抑制率与马拉硫磷浓度对数具有显著的剂量效应。沙蚕CAT活性随马拉硫磷浓度增加表现出先降后升再降的趋势,暴露3d时0.018mg·L-1浓度组CAT活性最高,6d时0.18mg·L-1浓度组CAT活性最高,分别比对照组高52.02%和53.42%(P<0.05),而浓度达1.8mg·L-1时CAT活力均显著下降(P<0.05)。结果显示,沙蚕乙酰胆碱酯酶是较好的滩涂有机磷农药污染生物标记物。     

温度和体重对双齿围沙蚕呼吸和排泄的影响

研究了不同温度和体重对双齿围沙蚕PerinereisaibuhitensisGrube呼吸和排泄的影响。试验设置7个温度梯度(10、12、16、20、24、27、29℃),沙蚕按体重分成S、M、L3组,平均体重分别为(0 40±0 19)、(1 00±0 22)、(2 00±0 50)g。结果表明:1)在10～27℃下,不同体重的沙蚕耗氧率均随温度的升高而增加,但当温度达到29℃时,各体重组的沙蚕耗氧率均明显下降;耗氧率(R)与体重(W)呈负幂函数关系R=aWb-1,其中a值为0 1182～0 3894,b值为-0 3672～-0 5971;2)体重和温度对耗氧率交互作用的方程式为R=0 01993+0 04323T-0 07663WT(F=5 85,P=0 01);3)方差分析表明,温度对排氨率的影响显著(F=3 651,P<0 05),体重对排氨率的影响未见显著。     

不同盐度条件下氨氮对双齿围沙蚕的毒性研究

[目的]研究双齿围沙蚕在不同盐度条件下对氨氮的耐受能力。[方法]在水温（27.0±0.5）℃、pH值为8.10的条件下,研究3种盐度（15‰2、5‰和35‰）下氨氮海水对双齿围沙蚕的急性毒性。[结果]在相同盐度下,氨氮浓度越高,作用时间越长,双齿围沙蚕的死亡率越高;在相同氨氮浓度下,盐度越低,双齿围沙蚕的死亡率越高,在15‰、25‰和35‰3种盐度下,总氨和非离子氨对双齿围沙蚕的安全浓度分别为3.31和0.23、3.84和0.254、.31和0.27 mg/L。氨氮对双齿围沙蚕的毒性表现出剂量效应和时间效应,并受盐度影响,盐度升高,毒性下降,双齿围沙蚕对氨氮的耐受能力增强。[结论]该研究为双齿围沙蚕的健康养殖提供了科学指导。     

温度和光照对双齿围沙蚕卵细胞生长的影响

通过研究不同温度和光照时间条件下双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis卵细胞的生长状况,分析了沙蚕卵细胞发育与环境因子的关系.结果表明:对于卵黄合成期的双齿围沙蚕,升温和延长光照时间可以加速卵细胞生长.在直接升温且光照周期为L: D=16: 8和L: D=8: 16的条件下,沙蚕卵细胞的生长速度分别为(2.46±0.06)×10~(-2)、(2.26±0.1)×10~(-2)μm~3/d;在经历低温后再升温且光照周期为L: D=16: 8和L: D=8: 16的条件下,沙蚕卵细胞的生长速度分别为(3.21±0.09)×10~(-2)、(2.56±0.05)×10~(-2)μm~3/d.双因素方差分析结果显示:恒定低温对卵黄合成期的沙蚕卵细胞快速生长有促进作用,其与未经历低温的沙蚕卵细胞生长速度比较差异极显著(P<0.01);光照对卵细胞生长速度的影响差异极显著(P<0.01);低温和光照的交互作用对沙蚕卵细胞的生长速度影响差异极显著(P<0.01).另外,低温对沙蚕卵径变异系数影响极显著(P<0.01),光照对沙蚕卵细胞变异系数影响不显著(P>0.05),低温和光照对卵细胞变异系数的交互影响不显著(P>0.05).     

应用ISSR和线粒体COI序列对不同地理种群双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis）遗传多样性的分析

采用COI基因序列和ISSR分子标记对分布于我国大连（DL）、乳山（RS）、盘锦（PJ）、青岛（QD）、盐城（YC）、晋江（JJ）和朝鲜西海岸（CX） 7个地理种群双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis）的遗传多样性和遗传结构进行了研究。10个ISSR引物在7个种群中共扩增出116条条带,其中多态性条带109条,总多态位点比率为93.97%,Neis基因多样性指数为0.365 2,Shannons信息指数为0.518 6,群体间遗传分化系数Gst值为0246 0。数据表明24.60%的遗传分化发生在不同地理种群间,76.40%的遗传分化发生在整个种群内,群体内分化大于群体间分化。对7个群体70个个体COI基因序列进行分析,对比长度包括469 个位点,其中变异位点68个,简约信息位点47个。在68个变异位点中,62个位点发生转换,6个位点发生颠换,简约信息位点率达9.611%,系统树分析表明供试群体内具有较高的遗传多样性,与ISSR分析结果相一致。该结果为科学有效的利用和保护沙蚕种质资源提供了理论依据。     

双齿围沙蚕对饲料中氮元素的利用及其与体质量和温度的关系

对不同体质量双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis在不同温度条件下对牙鲆配合饲料中氮元素的利用和氮收支进行了研究。试验按沙蚕体湿重设置（0.40±0.19）、（1.00±0.22）、（2.00±0.50）g 3个组,分别记为S、M和L组,每组分别设16、20、24℃3个温度梯度。结果表明：1）20℃时各组双齿围沙蚕对氮的摄食率均达到最大值,平均为17.0 mg/（d.g）,变幅为14.3～22.0 mg/（d.g）;2）双齿围沙蚕于不同温度下对氮的摄食率均随体质量的增加而降低,其中,S组为10.5～22.0 mg/（d.g）,M组和L组则分别为8.0～14.7、6.6～14.3 mg/（d.g）,氮摄食率与体质量的关系可用幂函数式CN=aWb表示,其中a值在20℃时最高,为10.618,b值为-0.2076～-0.1911;3）双因素方差分析表明,温度和体质量对沙蚕的氮摄食率均有极显著影响（F=79.125,P〈0.001;F=34.308,P〈0.001）;4）在本试验条件下,双齿围沙蚕对饲料中氮的累积率平均为11.8 mg/（d.g）,以摄食氮为100%计,累积氮所占的比例最大,平均为88.99%,排粪氮次之,为9.43%,而排泄氮所占的比例最低,仅为1.58%。