无花果树苗中截获的无花果孢囊线虫形态和分子鉴定

上海口岸从旅客携带进境的树苗中分离到1种孢囊线虫属的2龄幼虫,通过形态特征和分子特征分析,鉴定为无花果孢囊线虫(Heterodera fici Kirjanova,1954)。该2龄幼虫的主要形态特征为:体长409.9~454.4μm;唇环3个;口针发达,长22.6~24.0μm,基部球圆形略向前倾斜;侧线4条;尾长圆锥形,末端细圆,尾部透明区长24.7~30.5μm,约占尾长的1/2。序列分析显示其ITS区序列与GenBank中无花果孢囊线虫的序列相似性为99.48%~99.90%,序列差异为1~5 bp。系统发育分析显示该线虫与无花果孢囊线虫处于一个聚类组内。这是我国口岸首次报道截获无花果孢囊线虫。     

格木寄生线虫中国新记录种——卡勒萨隐皮孢囊线虫Cryphodera kalesari

在对广东省主要珍贵树种上的线虫进行调查时从格木Erythrophleum fordii上分离到一种隐皮孢囊线虫,经形态特征观察和测量数据分析,将其鉴定为卡勒萨隐皮孢囊线虫Cryphodera kalesari。其诊断特征为:雌虫椭圆形至近球形,头部具有1个唇盘和2～3个唇环,口针长33.6～37.8μm,阴门唇突出,阴门与肛门之间区域凹陷,肛阴距为42～72μm;2龄幼虫头部具1个明显的唇盘和3个唇后环纹,口针长24.8～29.5μm,口针基部球前缘凹陷,侧区3条侧线,尾长圆锥形,长38～53.5μm,尾末端细圆,透明尾长17.1～25.1μm,侧尾腺孔位于肛门后2～5环;雄虫未发现。本研究首次获得了卡勒萨隐皮孢囊线虫的rDNA(LSU D2D3和ITS)序列,为此线虫的鉴定提供了可靠的分子数据。本研究还分析了卡勒萨隐皮孢囊线虫与本属其他种类的系统进化关系。卡勒萨隐皮孢囊线虫为中国的地理新记录种。格木为隐皮孢囊线虫的新寄主。     

美国画眉草种子中维氏粒线虫的鉴定

2013年,上海口岸从来自美国的画眉草种子中检测到一种疑似粒属线虫的幼虫,并从草籽中收集大量虫瘿。序列分析显示截获的维氏粒线虫ITS序列与Gen Bank中维氏粒线虫(登录号为AF396317和AM888393)的序列相似性为99.85%,序列差异为1 bp。系统进化树中截获线虫样品与维氏粒线虫处于一个聚类组内。经形态学特征观察,并结合ITS序列分析,将截获的虫瘿及线虫鉴定为维氏粒线虫(Anguina wevelli)。这是我国口岸首次报道截获该种线虫。     

美国苜蓿草中鳞球茎茎线虫的鉴定

2015年,宁波口岸从美国苜蓿草中分离到一种茎属线虫,通过形态学和分子生物学方法,鉴定为鳞球茎茎线虫,这是我国口岸首次从牧草中截获该线虫。部分茎属线虫的核糖体28S和ITS基因DNA序列分析表明,28S基因是茎属线虫合适的DNA条形码基因。     

从日本进境罗汉松中截获移去剑线虫

2016年11月,深圳口岸从日本进境罗汉松中截获一种剑线虫。采用贝曼漏斗法分离线虫,结合形态学、28S rRNA基因序列测定以及构建系统发育树,对分离的线虫进行鉴定。该线虫的28SrRNA基因序列和GenBank数据库中的移去剑线虫Xiphinema elongatum(登录号分别为EF140790、KF430803、KF430802和KF430801)的序列同源性高达99%;其形态特征和测计值与X.elongatum最为吻合;系统发育树表明该线虫和X.elongatum聚为一组。通过以上结果判定截获的线虫为移去剑线虫。剑线虫是一种重要的植物外寄生线虫,我国口岸曾经多次截获剑线虫,剑线虫入侵我国的风险较高。本文首次对日本罗汉松中的移去剑线虫进行了详细的描述,提供了该线虫新的地理分布信息。     

进境美国苜蓿草中截获的菊花滑刃线虫检疫鉴定

2016年,天津口岸检疫人员从美国进境饲用苜蓿草中发现一种滑刃属线虫,通过形态学特征、形态测计值以及核糖体28S r RNA-D2/D3区与ITS区核酸序列比对和系统进化分析,最终确定为我国检疫性有害生物菊花滑刃线虫(Aphelenchoides ritzemabosi)。从进境饲用苜蓿草中截获该线虫为全国口岸首次。     

全国口岸进境邮寄物中截获线虫的疫情分析

本文对全国口岸2003~2016年4月从邮寄物中截获的线虫进行了汇总与分析,归纳了邮寄物中截获寄生线虫的种类、来源等,结果表明,全国口岸从邮寄物中共计截获线虫42属、4 448批次,其中包括检疫性线虫11种、49批次,随着邮寄物品数量和种类的增加,邮检中线虫的截获率逐年增加。目前进境邮寄物中线虫的疫情十分复杂,应对进境苗木、植物产品、蔬菜水果等加强检疫监管,以防止线虫疫情进一步扩展。     

禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)纤维素结合 蛋白基因(Ha-cbp-1)的克隆和序列分析

 禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是中国小麦上的重要病原线虫。纤维素结合蛋白基因是一种重要的植物线虫寄生和致病相关基因。用同源克隆的方法从禾谷孢囊线虫寄生前二龄幼虫中克隆出一种纤维素结合蛋白新基因Ha-cbp-1（GenBank 注册号GQ178086）cDNA序列。Ha-cbp-1基因cDNA包含1个开放阅读框,编码131个氨基酸残基的蛋白质,预测蛋白由1个长度为18氨基酸残基的信号肽和1个纤维素结合区域（CBD）组成。Ha-cbp-1的基因组DNA序列含有2个内含子。预测的禾谷孢囊线虫纤维素结合蛋白（HA-CBP-1）序列与大豆孢囊线虫纤维素结合蛋白（HG-CBP-1）序列有60%的同一性和76%的相似性,与甜菜孢囊线虫纤维素结合蛋白（HS-CBP-1）序列有60%的同一性和75%的相似性。本研究首次从禾谷孢囊线虫中成功克隆出CBP蛋白基因。     

贵州省大豆孢囊线虫的发生与分布

大豆孢囊线虫病是威胁大豆生产的重大病害之一。2015-2016年,采用随机取样的方法对贵州省大豆孢囊线虫的发生和分布情况进行了调查。调查范围包括贵阳、六盘水、安顺、毕节、黔西南和遵义等6个地区下辖的14个县(区),共采集土样287份。调查结果表明,贵州省大豆孢囊线虫的总检出率为28.2%,其中毕节地区的大方县和赫章县孢囊检出率最高,分别达到46.7%和45.0%,而在遵义市、贵阳市和黔西南州孢囊检出率为0。六盘水地区的水城县孢囊发生量最大,平均孢囊数为3.4个/200g土,最大孢囊数达到17个/200g土;安顺地区的镇宁和关岭县大豆孢囊线虫发生程度最轻,每200g土样平均孢囊数分别为0.3和0.2个,最大孢囊数仅为2个/200g土。分离的孢囊主要形态特征与大豆孢囊线虫一致,并且ITS序列与甘肃大豆孢囊线虫种群序列一致性达100%。根据形态学观察和ITS序列分析比对,将贵州省采集到的孢囊线虫鉴定为大豆孢囊线虫。本研究结果可为有效防控贵州省大豆孢囊线虫病提供依据。     

日本盆景中截获的短体线虫与根结线虫的鉴定

2014年,天津口岸从日本进境盆景中截获3种短体线虫和1种根结线虫。通过形态学和DNA条形码方法将截获的短体线虫鉴定为朱顶红短体线虫(Pratylenchus hippeastri)、伤残短体线虫(P.vulnus)和穿刺短体线虫(P.penetrans)。根据形态学并结合特异PCR和DNA条形码方法,将截获的根结线虫2龄幼虫鉴定为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)。朱顶红短体线虫是短体线虫属非中国种,为我国进境植物检疫性有害生物,在挪威槭和榉树盆景中截获该线虫为国内外首次报道。     

甘肃省黄芩根结线虫病病原种类鉴定

通过形态学与分子生物学相结合的方法对引起甘肃省陇西县黄芩根结线虫病的病原种类进行了鉴定,并采用室内人工接种的方法测定其对黄芩的致病性。结果表明,从黄芩根系分离的根结线虫其形态特征及测量值与北方根结线虫Meloidogyne hapla基本一致。该线虫种群rDNA-ITS和28S rDNA D2/D3序列与NCBI数据库中的北方根结线虫序列相似性分别为99.60%和99.74% (rDNA-ITS: JX024147; 28S rDNA D2/D3: MW288147)。贝叶斯系统发育树显示,该线虫群体与其他北方根结线虫群体聚为一支,置信度在95%以上。利用北方根结线虫特异性引物Mh-F/Mh-R扩增并测序得到457 bp的特异性片段。因此,基于形态学结合rDNA-ITS、28S rDNA D2/D3序列和特异性片段长度,将黄芩根结线虫病病原鉴定为北方根结线虫M.hapla。接种该线虫后的黄芩生长缓慢,叶片黄化,40 d后须根上有明显的根结。经分离鉴定,致病群体为北方根结线虫。综上所述,甘肃省陇西县黄芩根结线虫病病原为北方根结线虫M.hapla,该线虫对黄芩具有较强的致病性,其繁殖系数为1.997。     

河南省温县铁棍山药根腐线虫种类鉴定

为明确河南省温县铁棍山药病原线虫种类,在温县铁棍山药种植区采集有明显症状的块茎进行线虫分离,观察线虫的雌、雄成虫的形态特征,并扩增rDNA的28S D2-D3序列对其进行分子生物学鉴定。结果表明,从山药块茎中分离出的根腐线虫形态学特征及测量指标与咖啡短体线虫Pratylenchus coffeae基本一致,其28S D2-D3序列与P.coffeae相似性达99.87%～100%。本研究明确了河南省温县地区铁棍山药根腐线虫为咖啡短体线虫,为山药线虫病的鉴别及防控提供了科学依据。     

甘肃小麦禾谷孢囊线虫rDNA-ITS和28S rDNA-D2/D3区序列特征及ITS-RFLP分析

禾谷孢囊线虫是危害禾谷类作物的重要病原,严重威胁我国小麦主产区的小麦产量和品质。利用通用引物对甘肃、河南、安徽禾谷孢囊线虫群体28SrDNA-D2/D3区和rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列测定,利用UPG-MA方法分析了甘肃省7个种群、河南1个种群、安徽1个种群的禾谷孢囊线虫群体D2/D3区和ITS区的系统发育关系;用9种限制性内切酶对7个甘肃禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区进行了RFLP分析。结果表明:中国甘肃的禾谷孢囊线虫rDNA-D2/D3区片段长度约为780bp,rDNA-ITS片段长度约为1040bp。7个甘肃禾谷孢囊线虫群体、1个河南安阳群体、1个安徽蚌埠群体的D2/D3区和新西兰的H.aucklandica群体亲缘关系很近;其ITS区同澳大利亚的H.australis、北京通州的H.avenae(AY148382)的亲缘关系很接近。RFLP分析表明,9种限制性内切酶酶切禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS共产生了22个酶切片段,不同酶切的RFLP分布型在7个种群间没有差异。甘肃省禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区具有高度的保守性,与中国的C型群体相近,但不同于欧洲的A型群体和印度的B型群体。这是首次报道甘肃CCN种群分子特征。     

甘肃省党参根结线虫病发生、分布及病原种类鉴定

为明确甘肃省党参根结线虫病的发生、分布及病原种类,在甘肃省党参主产区调查、统计田间根结线虫病发生情况,并通过形态学和分子生物学方法进行种类鉴定。结果表明,甘肃省6个党参主产区均有根结线虫病发生,病田率、病株率分别为40.7%、13.2%,病情指数为10.4。依据根结线虫各虫态的形态测量值和雌虫会阴花纹等特征,将危害党参的根结线虫初步鉴定为北方根结线虫Meloidogyne hapla Chitwood, 1949。rDNA-ITS区段和28S rDNA D2D3区段序列比对和系统发育树显示,6个根结线虫群体无核苷酸差异,与多个北方根结线虫聚为一支且有较高的置信度。利用特异性引物Mh-F/Mh-R扩增得到北方根结线虫的特异性片段,大小为462 bp。故综合形态学和分子生物学特征,将危害甘肃省党参的根结线虫鉴定为北方根结线虫。     

四种短体线虫的形态和分子生物学鉴定

 采用形态学和分子生物学方法对来自荷兰的藏橐吾和铃兰、泰国的高山榕、缅甸的香蕉等种苗(球)分别鉴定出玻利维亚短体线虫Pratylenchus bolivianus、铃兰短体线虫P. convallariae、咖啡短体线虫P. coffeae和斯佩奇短体线虫 P. speijeri。对这4种线虫的形态特征进行较为详细的描述后,认为头环、口针、侧区、生殖系统和尾形等形态特征是种类鉴定的重要依据;进一步利用引物28S-D2A/28S-D3Br扩增测序得到上述4种线虫的28S rRNA基因D2/D3区序列,序列分析发现玻利维亚短体线虫从欧洲到美洲的不同种群之间的遗传距离变异较小,仅为0~0.007;铃兰短体线虫同一种群不同个体之间的遗传变异较大,为0.006~0.029;咖啡短体线虫不同种群之间的平均遗传距离为0.013;斯佩奇短体线虫不同种群之间的平均遗传距离为0.010;咖啡短体线虫P. coffeae和斯佩奇短体线虫P. speijeri亲缘关系很近,二者种间平均遗传距离仅为0.026。本研究再次证明线虫28S rRNA基因D2/D3区基因序列可作为短体线虫种间鉴定的依据。     

四种短体线虫的形态和分子生物学鉴定

 采用形态学和分子生物学方法对来自荷兰的藏橐吾和铃兰、泰国的高山榕、缅甸的香蕉等种苗(球)分别鉴定出玻利维亚短体线虫Pratylenchus bolivianus、铃兰短体线虫P. convallariae、咖啡短体线虫P. coffeae和斯佩奇短体线虫 P. speijeri。对这4种线虫的形态特征进行较为详细的描述后,认为头环、口针、侧区、生殖系统和尾形等形态特征是种类鉴定的重要依据;进一步利用引物28S-D2A/28S-D3Br扩增测序得到上述4种线虫的28S rRNA基因D2/D3区序列,序列分析发现玻利维亚短体线虫从欧洲到美洲的不同种群之间的遗传距离变异较小,仅为0~0.007;铃兰短体线虫同一种群不同个体之间的遗传变异较大,为0.006~0.029;咖啡短体线虫不同种群之间的平均遗传距离为0.013;斯佩奇短体线虫不同种群之间的平均遗传距离为0.010;咖啡短体线虫P. coffeae和斯佩奇短体线虫P. speijeri亲缘关系很近,二者种间平均遗传距离仅为0.026。本研究再次证明线虫28S rRNA基因D2/D3区基因序列可作为短体线虫种间鉴定的依据。     

福建省金柑黄化衰退病的病原种类鉴定

金柑Citrus japonica 是福建省尤溪县的重要特色果树,多年来金柑黄化衰退问题在其产区较为严重。本研究意在明确金柑黄化衰退的病因,为有效防控提供依据。调查发现金柑黄化衰退病株根部生长不良,根上有线虫雌虫寄生,其体后部突出根表面,根际土壤中有大量的2龄线虫;相邻健树根部生长健壮,根部无或只有少量该线虫。为明确其病原线虫种类,对其雌虫、雄虫、2龄幼虫进行形态学观测,对线虫的rDNA-ITS、28S rDNA D2-D3区进行测序比对,采用最大似然法和贝叶斯法构建系统进化树分析。结果表明,线虫形态学特征与柑橘半穿刺线虫Tylenchulus semipenetrans一致,系统发育树分析进一步明确为柑橘半穿刺线虫。这是国内首次报道柑橘半穿刺线虫寄生金柑,是导致金柑黄化慢衰的病因。研究结果为制订有效防控策略提供了重要理论依据。