黄喉拟水龟性别调控相关lncRNA和mRNA的筛选及初步分析

性别异形在动物界广泛存在,长期以来一直是生物学中的热门话题。黄喉拟水龟性别分化属温度依赖型,其温度响应分子机制仍不清楚。为了进一步解析龟鳖动物性别分化的分子机制,本研究初步比较分析了黄喉拟水龟转录本中性别差异表达(different expressed, DE)的长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)及其调控的靶基因。首先,运用Illumina深度测序平台,通过转录组测序(RNA-Seqs)对黄喉拟水龟的精巢和卵巢进行了比较转录组学分析并筛选鉴定出雌雄差异转录本,共筛选获得8 237个DE mRNA和9 573个DE lncRNA。通过GO功能注释及KEGG通路富集分析发现,上述差异转录本主要参与龟鳖动物性别分化和性腺发育等相关信号通路。此外,通过顺式和反式作用分析,筛选获得了一系列与生殖发育相关的(性腺发育和性别分化)受DE lncRNAs调控的靶基因。本研究为进一步阐明黄喉拟水龟温度依赖型性别的分子机制提供了线索,特别是为进一步挖掘利用龟鳖动物性别决定因子,进行龟鳖动物性控育种技术研究奠定了基础。     

三种CRISPR/Cas9基因敲除变异检测方法的比较分析

比较三种常用的CRISPR/Cas9基因敲除检测变异方法,从准确性、耗时、成本和应用限制等方面进行评估。采用T7核酸内切酶I、限制性内切酶和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分别对利用CRISPR/Cas9方法敲除的fibinb和ngs基因的50尾斑马鱼(Danio rerio)突变纯合个体和突变杂合个体进行检测,用野生型个体作对照;同时用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对CRISPR/Cas9方法敲除的ogn和ddb1基因的突变杂合个体进行了检测。结果表明:三种方法均能够区分突变杂合个体,其中T7核酸内切酶I检测法耗时最短,但该方法不能用于鉴定突变纯合个体;限制性内切酶检测法能够用于鉴定纯合个体,但需要有特异性的识别位点;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法能够区分纯合和杂合个体,对序列无依赖性,能够检测出序列中存在的所有变异。成本上,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法最经济;限制性内切酶的价格存在较大的差异,因此检测成本依赖于酶的价格。三种检测方法各有优缺点,在应用实践中可根据试验需要选择合适的方法。     

拟穴青蟹Spfox-1基因及调控其表达的lncRNA的鉴定与分析

为探究Spfox-1基因及存在靶向关系的lncRNA在拟穴青蟹性腺发育和幼体发育过程中的作用,从其成熟雌雄性腺转录组中得到开放阅读框全长为1410 bp的Spfox-1序列,该序列编码的蛋白包含1个RRM结构域,进一步预测获得1个可能与Spfox-1基因存在靶向关系的lncRNA HX26820。多重比较和进化树分析表明,Spfox-1的RRM结构域高度保守且与其他节肢动物的fox-1亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果显示：Spfox-1基因在成熟青蟹各组织器官中均有不同程度的表达,其中在卵巢和雄性脑神经节中表达量最高。在性腺不同发育阶段,Spfox-1基因在卵黄发生期的表达量显著高于卵巢其他发育阶段,而在精巢发育过程中,则表达量持续下降。在幼体不同发育过程中,Spfox-1基因的表达量从溞状幼体Ⅴ期到仔蟹Ⅰ期表达量呈逐渐上升趋势。lncRNA HX26820在卵巢发育过程中表达量持续下降,在幼体发育过程中只在溞状幼体Ⅴ期有较高的表达量。研究表明Spfox-1和lncRNA HX26820可能参与卵巢发育和幼体发育。过表达试验显示,lncRNA HX26820能够抑制Spfox-1基...     

鲑降钙素对虹鳟鳞组织lncRNA表达的影响

为探明鲑降钙素(salmon calcitonin, sCT)对鱼类骨组织钙代谢过程的调节机制, 对虹鳟(Oncorhynchus mykiss) 幼鱼进行 sCT 腹腔注射, 并在注射后 24 h 采集鳞组织进行转录组测序, 分析其中长链非编码 RNA (long non-coding RNA, lncRNA)表达水平的变化。结果显示, 注射 sCT 后的虹鳟鳞组织中共鉴定出 847 个差异表达的 lncRNA, 其中 247 个表达上调, 600 个表达下调。GO 注释结果显示, 差异表达 lncRNA 靶基因主要被注释到转录调控、运输、信号转导、膜、细胞质、金属离子结合和核苷酸结合等功能中。KEGG 通路富集结果显示, 差异表达 lncRNA 靶基因在硫胺素代谢通路、炎症介质对 TRP 通道调节、血小板活化、谷氨酸能突触、神经营养因子通路、ARVC 通路和 NF-kappa B 信号通路等通路中显著富集。利用实时荧光定量 PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)对随机选取的 6 个差异表达 lncRNA 的表达量进行验证, 结果显示, qRT-PCR 与 RNA-Seq 结果一致。基于上述结果, 本研究筛选到 MSTRG.68909.2、MSTRG.39805.1、MSTRG.121429.1、MSTRG.9137.1 和 MSTRG.43721.1 共 5 个可能参与虹鳟钙代谢的关键 lncRNA, 这些关键基因的筛选鉴别可为探明硬骨鱼类骨代谢的调控机理提供新的切入点, 为虹鳟养殖生产实践提供参考。     

长牡蛎性腺中调控型非编码RNA的生物信息学

本研究以日照海域同一家系的2龄长牡蛎性腺为研究对象,通过small RNA-seq和RNA-seq技术筛选和鉴定出大量的非编码微小RNA(mi RNA)、长链非编码RNA(lnc RNA)和环状RNA(circRNA),并对其进行了生物学特征分析。结果显示,以斑马鱼为参考序列,获得25～30个已知miRNA成熟体和51～63个已知miRNA前体,预测到53～71个新miRNA成熟体和53～77个新miRNA前体;长牡蛎miRNA长度分布为18～26个核苷酸(nt),其中分布在20～22 nt长度的miRNA数量最多,且miRNA首位碱基多为U。测序分析获得2 302～2 349个注释lncRNA转录本,预测到20 083～24 114个新lncRNA转录本,其中基因间型lncRNA(lincRNA)、内含子lncRNA(intronic lncRNA)、反义lncRNA(anti-sense lncRNA)分别占29.0%、62.1%和8.9%;长牡蛎lncRNA的基因组特征与其他真核生物的lncRNA基因组特征相似,与mRNA相比,外显子(exon)个数少,转录本长度较短,表达水平低...     

牙鲆趋化因子基因CXCL9的克隆、鉴定与表达分析

趋化因子是一类具有化学趋化功能的小分子分泌性蛋白,能够引导白细胞到损伤或者感染的部位,参与免疫调节和病理反应。为丰富鲆鲽鱼类趋化因子的相关基础研究,本研究克隆了牙鲆(Paralichthys olivaceus)趋化因子基因CXCL9,其全长为910 bp,开放阅读框为408 bp,编码135个氨基酸。该基因具有趋化因子超家族的典型特征,在35、37、60和77个氨基酸位置具有4个保守的半胱氨酸残基,形成两个二硫键。氨基酸序列分析表明,该基因与大菱鲆(Scophthalmus maximus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的CXCL9基因具有较高的同源性,分别为78.5%和71.0%。实时荧光定量PCR结果显示, CXCL9在正常牙鲆肝脏和脾脏中的表达量非常高,在皮肤和鳃等组织中表达量次之,说明CXCL9特异性地在免疫相关组织中表达。经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA表达量在感染后6 h即出现高峰值,而头肾和脾脏中的高峰值出现较晚。经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后6 h,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA的表达量升高近8倍,头肾中的表达高峰值出现在感染后24 h,而脾脏中CXCL9 mRNA的表达量在感染后6 h迅速升高10倍,逐渐降低后48 h又出现高峰,为正常水平的20倍。上述研究结果说明CXCL9基因在病原菌感染过程中有快速响应,可能参与了免疫防御过程,将有可能发展为一种牙鲆细菌性疾病的生物标记。本研究为牙鲆趋化因子超家族免疫机制的深入研究奠定了基础。     

半滑舌鳎Shh基因的克隆与表达及甲基化分析

通过RACE方法获得半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Hh基因家族的Shh基因,该基因全长1 922 bp,其中5′UTR 266 bp,3′UTR 360 bp,ORF1 296 bp,编码431个氨基酸,经预测该多肽的相对分子质量为47.28 k D,理论等电点6.95,具有Hh基因家族特有的保守结构域。氨基酸序列分析表明,半滑舌鳎Shh与牙鲆的同源性最高,为82%,与其他鱼类同源性为74%~81%,与非洲爪蟾的同源性为61%,与人和鼠的同源性为63%~64%。甲基化结果显示,Shh基因在1龄卵巢中的甲基化程度普遍低于雄鱼与伪雄鱼精巢。基因表达分析显示,Shh基因在胚胎期的囊胚期表达显著高于其它时期(P0.05),在雌雄成鱼8个组织器官均表达,在雌性性腺分化的关键期孵化后50 d,雌性性腺中表达量较前期升高,且显著高于同时期雄性性腺中的表达(P0.05),在雄性性腺分化的关键期80~95 d,Shh基因在雄性中的表达水平显著升高(P0.05),在8月龄、1龄及2龄雌鱼性腺中表达显著高于雄鱼与伪雄鱼。本研究表明,半滑舌鳎Shh基因在进化中高度保守,与胚胎分化、组织器官形成、雌雄性腺分化及性腺发育密切相关。     

近缘新对虾PCNA基因的克隆及表达分析

增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)作为DNA聚合酶δ的辅助蛋白,在DNA复制过程中发挥重要作用。近缘新对虾(Metapenaeus affinis)卵巢发育过程中存在细胞增殖活动旺盛的阶段,但目前关于其卵巢发育的分子机制研究较少。利用RACE (Rapid amplification of cDNA ends)技术获得近缘新对虾PCNA (MaPCNA)基因的cDNA序列全长,并通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)对其进行卵巢发育相关的表达分析。MaPCNA全长为1 144 bp,包含140 bp的5’非编码区,221 bp的3’非编码区,开放阅读框(ORF)为783 bp,编码260个氨基酸。MaPCNA蛋白的相对分子质量为28.82 kD,理论等电点为4.5。多重比对分析表明,PCNA氨基酸序列在甲壳动物中较为保守。组织表达结果显示,MaPCNA基因在检测的组织中均有表达,其中在卵巢中的表达量最为显著(P<0.05)。在不同发育阶段的卵巢中,MaPCNA基因的表达出现变化(P<0.05),从Ⅰ期开始逐...     

中华鳖StAR基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

为了研究类固醇激素合成急性调节蛋白 (steroidogenic acute regulatory protein, StAR)在日本沼虾应答低氧胁迫过程中所发挥的作用,实验应用cDNA末端快速扩增 (RACE) PCR技术克隆了日本沼虾StAR全长cDNA序列,并利用在线软件对其序列特征进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR方法分析StAR在日本沼虾不同组织的分布情况,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)与免疫印迹(Western blot)技术对其在不同低氧胁迫阶段中的表达规律进行检测,观察低氧胁迫下精巢组织中StAR蛋白免疫组化定位。结果显示,日本沼虾StAR其cDNA全长3 361 bp (NCBI登录号：MW263908),包括5′-UTR 323 bp,3′-UTR 2 129 bp,开放阅读框909 bp,编码302个氨基酸。氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,日本沼虾StAR基因与三疣梭子蟹等甲壳动物StAR聚类一支,具有最近的亲缘关系。半定量RT-PCR检测结果显示,StAR在日本沼虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺和心脏组织中最低,在精巢组织中表达处于较高水平。使用qRT-PCR技术检测日本沼虾精巢中StAR在低氧胁迫下时空表达情况,结果表明,与对照组相比,低氧处理组精巢中StAR基因表达量在1~48 h均显著上调,而在低氧处理组96 h显著降低。此外,本实验对StAR进行了原核表达及抗血清制备,采用Western blot检测StAR蛋白表达丰度基本与基因表达模式相似,免疫组化结果显示,StAR 蛋白在精细胞与间质细胞中均有表达。综上所述,长期低氧胁迫显著降低了StAR基因的转录表达水平,并且该基因可能在类固醇合成路径及精子发生过程中均发挥重要作用。本研究结果为进一步解析日本沼虾类固醇激素合成分子机制奠定基础。

     

大菱鲆趋化因子受体CCR3和CCR9基因的克隆及组织表达

本实验克隆了大菱鲆趋化因子受体基因CCR3和CCR9的全长cDNA, 并进行了鉴定。其中, 全长cDNA的克隆采用了5′和 3′-RACE。CCR3 cDNA全长1 451 bp, 包括92 bp的5′非编码区, 276 bp的3′非编码区以及编码360个氨基酸的1 083 bp的开放阅读框。CCR9 cDNA全长1 441 bp, 包括59 bp 的5′非编码区, 278 bp 的3′非编码区, 以及编码367个氨基酸的1 104 bp的开放阅读框。两种受体均具有7次跨膜结构, 符合G蛋白偶联受体的序列特征。系统进化分析表明, 大菱鲆CCR3与其他鱼类CCR3聚为一支, 大菱鲆CCR9也与其他鱼类的CCR9聚为一支; 系统进化树显示的亲缘关系符合各物种的进化地位。实时定量 PCR (qRT-PCR)表明这两个基因在大菱鲆正常组织中均有一定量的表达, 尤其是它们在头肾、脾及心脏中均有高水平的表达。在脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)诱导之后, CCR3在脾和肝中的表达水平与对照组有显著性差异(P<0.05), 而CCR9的表达水平仅在肝中与对照组有显著性差异(P<0.05)。两个基因在免疫相关组织中表达水平较高, 并且能够对LPS产生免疫应答, 说明它们在大菱鲆免疫系统中发挥了重要功能。

     

白斑狗鱼雌性化诱导和雌雄同体现象

为研究和开发白斑狗鱼雌性化诱导方法,实验将750尾白斑狗鱼仔鱼随机分为5组,其中4组为实验组,分别从不同的发育时间(孵出后第10、20、30和40天)开始投喂用20 mg/L雌二醇浸泡过的水蚯蚓,另外1组为空白对照组,投喂正常水蚯蚓。各实验组喂饲17β-雌二醇30 d,然后将实验组和对照组的所有鱼进行正常饲养。至206 d将实验组和对照组的鱼进行成活情况统计,然后分别进行解剖,取出性腺进行组织学观察。结果显示,投喂用20 mg/L雌二醇浸泡过的水蚯蚓对白斑狗鱼仔鱼具有非常明显的致死效应,成活率由对照组的43.5%下降到14.3%±8.3%;30 d喂药组和40 d喂药组获得较高的雌雄比例,特别是30 d喂药组最高,达到了15∶7,由此推断白斑狗鱼性腺分化的关键时间点可能在孵出后的30~40 d;各实验组和对照组都出现很高比例的雌雄同体现象,即在同一性腺中同时出现了大量的初级卵母细胞(第Ⅱ时相)和精母细胞,而且这些卵母细胞有明显的退化现象,推测其性别分化过程中存在雌性先熟的幼体雌雄同体现象。本研究将为采用激素诱导手段生产白斑狗鱼全雌化苗种以及探讨白斑狗鱼性别决定和分化机制提供依据。     

Microsatellite polymorphism in Italian populations of northern pike (Esox lucius L.)

Northern pike (Esox lucius) is not considered an endangered species in Italy, but since recent studies indicate the decline of this population, conservation and management strategies based on the genetic differentiation of natural northern pike populations are needed. In this paper, genetic diversity was analysed in 10 Italian and 2 East European northern pike populations by means of seven microsatellite loci. Data indicated an appreciable genetic differentiation, in spite of a low genetic variation, and agreed with the low level of genetic polymorphism already observed for this species in North America and North Europe. Results of statistical tests revealed genetic peculiarities of the Italian populations, even though signals of recent contact between populations were found and discussed in relation to anthropic impacts, particularly to the stocking practice. This investigation represents the first approach to the knowledge of the genetic variability of Italian pike populations using microsatellite markers, and reported results could be of interest for future management and conservation programmes of this species in Italy.     

温度对白斑狗鱼早期发育和生长的影响

为了能给白斑狗鱼耐高温性状的改良提供有效的分子标记,本研究基于白斑狗鱼热敏感组 (109尾)和耐高温组 (103尾)进行简化基因组测序,对25个染色体中的InDel标记,以前两个PCA为协变量,利用MLM模型(Masked Language Mode)与白斑狗鱼的耐热性状进行了关联分析。结果显示,大部分InDel分布在内含子 (63.69%),外显子分布的InDel位点较少 (1.30%)。通过GWAS分析,发现5个位点与白斑狗鱼耐热性状显著关联,分别位于safb基因、未知基因LOC117593903和CLSTN2基因内含子中。其中9N del、4N del-1和4N del-2三个InDel位点均位于CLSTN2基因第3内含子,这3个位点在212尾个体中基因型分布高度连锁。本研究中发现的5个InDel突变可能会对白斑狗鱼的耐热性状产生显著的影响,可作为白斑狗鱼耐热性状改良的候选分子标记。进一步在验证群体中利用KASP技术对部分位点进行了验证。发现9N del位点DD基因型个体在热敏感组中占优势,DI基因型个体在耐高温组中占优势,与简化基因组测序结果基本一致。位于CLSTN2基因第2内含子的3个InDel位点可能影响CLSTN2基因的转录,该基因可能是白斑狗鱼耐高温性状相关的重要候选基因。研究结果为白斑狗鱼分子标记辅助育种提供了理论依据,为白斑狗鱼耐热性状的改良提供了候选分子标记。

     

白斑狗鱼早期发育阶段的耐热性及耐热性状关联SNP筛选

为了解白斑狗鱼(Esox lucius)早期不同发育阶段的热耐受性, 为其耐热性状的改良提供合适的分子标记, 本研究首先采用耐热性(upper thermal tolerance, UTT)作为评定指标, 对 UTT 进行方差分析, 比较分析了白斑狗鱼不同发育阶段的热耐受性。使用 GBS (genotyping-by-sequencing)技术获得两个极端组的耐热性状相关简化基因组测序数据集, 进而对耐热性状进行全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS), 发掘白斑狗鱼耐热性状关联的 SNP 标记。结果发现, 白斑狗鱼早期不同发育阶段的耐热性有极显著的差异(P＜0.01), 幼鱼期的耐热性最高, 其次为稚鱼期, 仔鱼期耐热性最低。联合 FarmCPU 和 Blink 模型进行了 GWAS 分析, 发现 5 个 SNPs 与白斑狗鱼耐热性状的关联性均达到了极显著水平(FDR P-value＜0.01), 分别位于 clstn2、MAPK14、VAPA 等基因的内含子和 ANKS1B 基因 5ʹ端非翻译区。这些基因直接或间接与刺激和应激反应相关。本研究初步筛选出与白斑狗鱼耐高温性状关联的候选 SNPs 和相关基因, 为今后研究白斑狗鱼在应对高温胁迫时的生理机制和分子机制提供参考, 为白斑狗鱼耐高温性状的改良提供了科学依据。     

Stimulation of spermiation and induction of ovulation in pike (Esox lucius)

Mature northern pike were given various hormonal treatments in March or April in order to stimulate spermiation or to induce ovulation. In males the total amount of sperm collected after treatment increased, in comparison with saline-injected males, by 3–11 times with partially purified salmon gonadotropin (PPSG-activity: half of the highly purified s-GTH; injected at doses of between 5 and 100 μg/kg body weight); 3–6 times with crude carp pituitary extract (0.5–3 mg/kg body weight); and 3–7 times with fresh pike pituitaries (14 and 1.2 mg wet weight/kg body weight). The sperm obtained after hormonal treatment was of good quality. Intracardiac injection of superactive LRH analogue had no effect. In females, PPSG induced 90 and 100% ovulation at the doses of 50 and 25 μg/kg body weight. Dried salmon pituitaries (2.5 mg/kg, equivalent to 50 μg of PPSG) gave 25% ovulation; at 10 mg/kg, 25% complete ovulation was again recorded, but in addition 70% of the females showed oocyte maturation and partial ovulation. Similarly, dried carp pituitary (3 mg/kg) induced only oocyte maturation but no ovulation. The oocytes obtained after hormonal treatment were in general fertile. Intraperitoneal injection of LRH in an emulsified form induced neither oocyte maturation nor ovulation. The lack of effect of LRH analogue is discussed and shows that the use of this compound as a substitute for pituitary preparation is not very promising.     

坛紫菜过氧化氢酶基因的克隆及表达特征

过氧化氢酶(CAT)是植物细胞抗氧化酶的主要成员,在逆境胁迫下的活性氧(ROS)清除中发挥着重要的作用。本研究采用RACE扩增技术克隆获得了坛紫菜CAT基因的全长,被命名为PhCAT(Genbank收录号:KM655303)。该基因全长1983 bp,可编码包含542个氨基酸的多肽,与条斑紫菜CAT基因的序列相似性为83.08%。多序列比对和系统进化树分析结果确认PhCAT属于CAT基因家族。PhCAT基因定量分析结果显示,失水胁迫条件下,PhCAT的基因表达水平只在失水率≥60%时才显著上调;不同时间水平的高温胁迫条件均可诱发PhCAT基因的上调表达。而CAT酶活测定结果却显示,各种水平的失水胁迫条件下,坛紫菜细胞内的CAT酶活水平均显著低于正常条件下的酶活水平;高温胁迫24 h时,CAT酶活水平显著增强,而其余时间点的酶活水平则显著降低。研究表明CAT酶在坛紫菜高温胁迫应答中发挥着重要作用,但在失水胁迫应答中却没有发挥明显作用。     

三角帆蚌hcSRCR1基因的克隆及在不同壳色选育系中的表达模式

清道夫受体(SR)是一类对化学修饰的脂蛋白具有很强结合活性的糖蛋白家族。本研究通过RACE方法克隆得到三角帆蚌hcSRCR1基因cDNA序列,该序列全长1 000 bp,其中开放阅读框819 bp,编码272个氨基酸,预测分子量为28.16 ku,理论等电点为5.55;预测含有2个SRCR结构域和6个保守的半胱氨酸残基。qRT-PCR和Western blot结果显示,hcSRCR1 mRNA和蛋白表达模式基本相同,均在三角帆蚌外套膜中表达量最高,在其他组织中的表达量普遍较低,且在紫色选育系外套膜组织中的表达量显著高于白色选育系。外套膜原位杂交结果显示,hcSRCR1基因主要在外套膜外褶的内、外上皮细胞层以及腹膜处的上皮细胞层中表达。研究表明,三角帆蚌hcSRCR1基因与贝壳珍珠质颜色形成具有一定相关性,可为进一步研究该基因在珍珠颜色形成过程中的调控机理提供基础资料。     

牙鲆肌肉生长抑素(MSTN)基因克隆

采用同源克隆及基因组步移的方法,分离克隆了牙鲆肌肉生长抑素（MSTN）基因。经过序列分析及cDNA验证,牙鲆MSTN基因具有3个外显子和2个内含子,编码377个氨基酸。5`侧翼区含有8个TATA框,一个CAAT框,6个E框;3`侧翼区含有加尾信号。通过同源分析,牙鲆MSTN C末端含有9个保守半胱氨酸残基和一个RVRR蛋白酶酶切位点;通过进化树分析,牙鲆MSTN与鱼类MSTN基因聚为一支。RT-PCR分析表明,牙鲆MSTN在胚胎发育中不表达或表达量较低,说明MSTN在牙鲆胚胎发育中并不起重要作用;其在各组织中的表达,随个体和环境的不同而有差异,暗示MSTN的表达受外界因素调控。     

中华鳖dnd基因克隆及在生殖细胞中的表达

为了研究龟鳖类生殖细胞发育分化机制,实验通过RACE技术克隆获得了中华鳖dead end (dnd)基因全长c DNA,RT-PCR分析了其在不同组织的转录表达情况,并通过原位杂交技术检测了dnd mRNA在中华鳖雌雄性腺配子发生过程中的表达变化。结果显示,中华鳖dnd cDNA全长1 251 bp (GenBank登录号为OL757532),包括234 bp的3’端非翻译区和1 017 bp开放读码框,开放读码框编码338个氨基酸。氨基酸序列比对和系统进化树分析结果表明,中华鳖Dnd蛋白与其他物种同源蛋白一样,均具有6个保守的结构域,其中高度保守的RNA识别结构域是主要的功能结构域。中华鳖Dnd与绿海龟Dnd氨基酸序列一致性最高,亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,Psdnd特异性地在中华鳖性腺组织中表达,且在卵巢中的表达明显高于精巢。原位杂交分析结果显示,Psdnd mRNA在生殖细胞中特异表达。在卵巢中,Psdnd mRNA主要在Ⅱ期初级卵母细胞的细胞质中表达,随着卵母细胞的增大,在Ⅳ期及以后的卵母细胞中检测不到其表达。在精巢中,Psdnd mRNA信号在初级精母细胞中表达最强,...     

条斑紫菜HSP90基因的克隆与表达分析

为了研究HSP90在条斑紫菜胁迫耐受中的作用,克隆了条斑紫菜HSP90基因(命名为PyHSP90),采用定量RT-PCR研究了其表达规律。PyHSP90基因包含一个长2274nt的完整开放阅读框,编码757个氨基酸。PyHSP90蛋白定位于细胞质中,具有HSP90蛋白家族的特征序列和保守结构域,与多种生物的HSP90具有较高的序列一致性。在进化树上条斑紫菜等红藻的HSP90与隐藻的亲缘关系最近,与绿藻和陆生植物亲缘关系较远。低温和高温胁迫都能显著性地诱导条斑紫菜叶状体PyHSP90基因的表达,而且表达量与胁迫程度成正相关;低盐胁迫下PyHSP90基因表达上调;而失水胁迫下PyHSP90基因表达下调。