胞内劳森菌PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种用于检测胞内劳森菌的检测方法,本试验根据GenBank中公布的胞内劳森菌16SrRNA设计引物建立PCR诊断方法。结果显示:获得了大小为481bp的PCR产物,核苷酸序列同源性分析结果均为99%以上;特异性试验表明该方法对大肠杆菌、沙门菌、志贺菌、猪流行性腹泻病毒和金黄色葡萄球菌均为扩增阴性;敏感性试验表明该方法的最低检出量为32.8μg/L;对20份临床样品阳性检出率为15%。结果表明:该方法具有较好的特异性和敏感性,适用于临床检测胞内劳森菌。     

胞内劳森菌LsaA蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立胞内劳森菌特异性抗体检测方法,将密码子优化合成的胞内劳森菌表面蛋白LsaA的编码基因克隆于pET32a(+)载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。用纯化的重组LsaA蛋白作为包被抗原,通过一系列条件优化,建立了检测胞内劳森菌抗体的间接ELISA方法。结果显示:该方法可以特异地检测抗胞内劳森菌抗体,与大肠杆菌、猪霍乱沙门菌、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒等常见猪腹泻病原的抗血清均无交叉反应。来自PCR检测粪便呈胞内劳森菌阳性猪的血清,用所建立ELISA检测均为胞内劳森菌抗体阳性。该方法具有较好的敏感性和重复性,阳性血清经过1∶800稀释检测结果仍为阳性,批内和批间重复试验的变异系数分别为0.352%~2.752%和0.877%~3.000%。应用建立的ELISA方法对河南省部分地区猪场胞内劳森菌的感染情况进行了血清流行病学调查,结果显示被检地区猪场均存在不同程度的胞内劳森菌抗体阳性,阳性率在13.3%~57.1%,平均阳性率为30.6%。结果表明,本研究所建立的ELISA方法可以用于胞内劳森菌抗体的检测,为胞内劳森菌感染的监测和流行病学调查提供了方法。     

胞内劳森菌巢式PCR检测方法的建立及初步临床应用

为了掌握胞内劳森菌在湖北省5个疑似猪增生性肠炎暴发规模化猪场中的流行情况,我们建立了一种从粪便中检测胞内劳森菌的巢式PCR方法,并利用该方法对采集于这5个规模化猪场不同生产阶段不同临床表现猪群的1 003份粪便样品进行监测。结果显示:5个猪场的胞内劳森菌检出率在11.5%~19.4%之间,平均阳性率为15.5%;就临床表现而言,腹泻猪粪便样品中胞内劳森菌的检出率高于非腹泻猪;就生产阶段而言,保育及育肥猪中胞内劳森菌的检出率高于断奶仔猪、母猪和公猪。我们还利用粪便检测胞内劳森菌呈阳性、疑似临床症状明显的猪的肠道制备的感染溶液进行了病例复制,试验猪在灌服感染溶液后出现了与胞内劳森菌感染相似的临床症状及病理变化,并且从感染猪的肠道组织和粪便中检测到了胞内劳森菌的存在。本试验对于进一步了解胞内劳森菌在我国猪群中的流行情况及致病性具有一定的意义。     

猪增生性肠炎套式PCR检测方法的建立及初步应用

本试验旨在建立检测猪增生性肠炎(porcine proliferative enteropathy,PPE)的套式PCR方法,为临床快速鉴别诊断和防控该病提供病原学依据。根据GenBank上已发表的的劳森氏胞内菌(Lawsonia intracellularis,LI)的基因组序列（登录号：AM180252）设计2对特异性引物,以疑似PPE病猪粪便中纯化的DNA为模板,建立了套式PCR方法,并对PCR产物进行序列测定,所扩增的序列与GenBank上登录的劳森氏胞内菌相应序列的同源性在99%以上。应用本试验建立的套式PCR方法对疑似PPE病猪的粪便进行检测,结果表明,本方法具有快速、方便和敏感度高等优点,可用于PPE的临床检测。     

猪增生性肠炎的诊断及其在猪群中感染的调查

针对江西某猪场肥猪出现血便症状,取病变肠组织提取DNA,采用猪胞内劳森菌荧光定量PCR试剂盒检测,并对PCR扩增产物进行序列测定和分析,结果表明,其与胞内劳森菌参考序列(AM180252.1和CP004029.1)同源性为100％.同时采集7个猪场的正常猪群粪便通过猪胞内劳森菌的荧光定量PCR检测方法进行检测,结果显示...     

胞内劳森氏菌鞭毛蛋白Flic的可溶性表达与免疫原性分析

采用PCR扩增出猪回肠炎胞内劳森氏菌的鞭毛蛋白基因Flic(LI0710),再将目的基因和Msyb标签插入原核表达载体pET-28a,构建表达质粒pET28a-Msyb-Flic。然后将测序正确的质粒转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)中,0.5 mmol IPTG诱导阳性菌株进行蛋白表达,采用超声破碎仪破碎菌体收集蛋白。最后使用NI柱摸索纯化条件获得目的蛋白,采用Western blot检测蛋白特异性,免疫小鼠检测抗体水平。结果表明,获得了可溶性表达的胞内劳森氏菌鞭毛蛋白Flic(LI0710),用Flic(LI0710)蛋白免疫小鼠后能产生较高水平的特异性抗体,表达蛋白与小鼠胞内劳森氏菌抗血清可发生特异性反应。结果为胞内劳森氏菌亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

饲料禁抗背景下规模化猪场胞内劳森菌的流行病学调查

为掌握在饲料禁抗和养殖端限抗背景下规模化猪场胞内劳森菌的流行情况，为猪增生性肠炎的精准防控提供依据。该研究运用巢式PCR和间接ELISA方法对饲料禁抗后不同来源的粪便样品和血清样品进行检测。饲料禁抗背景下，对采自不同猪场695份粪样的巢式PCR检测显示，猪群胞内劳森菌的总体感染率为23.88%，保育猪、肥育猪和种猪感染率分别为16.56%、29.58%和24.63%。对饲料禁抗和饲养期间限抗猪群的跟踪调查结果为，保育猪在30、44、58、72日龄的感染率分别是16.67%、20.00%、50.00%和70.00%；后备母猪的感染率44.44%—66.67%。对338份不同猪场送检血清样品的ELISA检测显示，胞内劳森菌的抗体阳性率为42.6%，不同猪场的阳性率10%—75.90%。上述结果表明，现阶段我国规模化猪场胞内劳森菌PCR检测阳性率和ELISA检测的阳性率均处于较高水平。饲料禁抗以及饲养期间限抗的保育猪和后备母猪群跟踪调查的最高感染率分别达70%和66.67%，保育猪随着饲养日龄的增加感染率呈明显地升高趋势。因此，在饲料禁抗背景下，规模化猪场应更加重视猪增生性肠炎的防控。     

胞内劳森菌检测方法研究进展

胞内劳森菌感染给畜牧业造成了巨大损失,其早期的检测与诊断显得尤为重要。本文对胞内劳森菌现有的检测方法组织病理学、血清免疫学和分子生物学等方法进行阐述,分析了各种方法的优势与不足,为临床胞内劳森菌感染的有效鉴定提供指导。     

海南部分地区猪场胞内劳森氏菌流行情况调查

为了解胞内劳森氏菌在海南省各猪场中的流行情况,应用普通PCR技术检测了来自该省不同地区14家猪场的348份猪粪便样品中的胞内劳森氏菌。结果表明,送检的猪场全部存在胞内劳森氏菌流行情况,场阳性率达到100%;348份猪粪便样品中有133份检测为阳性,阳性率达38.22%,其中母猪粪便的阳性率为40.74%,4～9周龄猪的粪便阳性率为35.42%,11～20周龄猪的粪便阳性率为37.5%,20周龄之后的猪粪便阳性率为52%。可见海南省部分地区猪场都存在胞内劳森氏菌的感染情况。     

2022—2023年全国主要养猪地区猪回肠炎感染情况调查

为了解全国主要养猪地区猪回肠炎感染情况,本调查使用荧光定量PCR技术对来自全国主要养猪地区169家猪场的1667份粪便样本进行胞内劳森菌的检测。结果显示,在所有参试的猪场和送检的粪便样本中,胞内劳森菌的阳性率分别达到了96.4%和86.0%;不同季节、不同区域、不同规模的猪场,胞内劳森菌检出率都超过80%;在各个生产阶段,母猪的总体阳性率也普遍偏高;在13周龄和19周龄前后,保育-育肥猪的回肠炎感染压稍高;不同粪便类型对应的CT值也存在差异,血便中胞内劳森菌的CT值最低。由此可见,胞内劳森菌引起的回肠炎广泛存在我国主要养猪地区。     

猪劳森氏胞内菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速有效的检测猪劳森氏胞内菌(LI)的方法,本研究根据该菌的天冬氨酸氨裂解酶基因保守序列设计合成一对特异性引物和一条TaqMan探针,建立了定量检测LI的荧光定量PCR方法,并对其进行敏感性、特异性、稳定性试验以及与套氏PCR方法的比较试验.结果表明,标准曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系,相关系数为0.998507;该方法对其他病原体的检测无特异性荧光信号;而且该方法灵敏度高于套式PCR方法.本研究为猪LI的检测提供了一种特异、敏感、快速的定量检测方法.     

胞内劳森氏菌PCR检测方法的建立与应用

为建立一种适用于临床检测胞内劳森氏茵(Lawsonia intracellularis,LI)的检测方法,本研究通过比较提取粪便样品基因组DNA的不同方法,结合PCR方法特异性扩增aspA基因检测临床样品中的LI.敏感性试验表明,阳性样本最低检出量为1.7×102 copie/μL;特异性试验表明,该方法对大肠杆菌、沙...     

胞内劳森菌的纳米PCR检测方法的建立

为建立一种猪增生性肠炎(PPE)的快速诊断方法,本研究根据Gen Bank中已登录的胞内劳森菌(LI)基因组16S rDNA基因序列,设计1对引物,以疑似PPE的病料样品,通过PK-15细胞培养,分离到一株LI,建立了LI的纳米金PCR检测方法。结果表明该方法能够扩增得到与实验设计相符的202 bp(LI)的特异性片段;与大肠杆菌、沙门氏菌、流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒无交叉反应,特异性良好。与普通PCR法进行比较,该方法检测灵敏度比普通PCR高100倍。经临床检测,从50份病料样品中检出5份阳性样品,并且发现回肠粘膜和粪便中LI的检出率明显高于组织中LI的检出率。该方法可以用于LI的临床快速检测与流行病学调查。本研究为进一步研究LI的人工培养和实验室诊断PPE奠定了基础。     

基于胞内劳森菌16S rDNA基因的TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

参考GenBank发表的胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,L.intracellularis)基因组16SrDNA序列,设计1对特异性引物和1条TaqMan探针,以L.intracellularis疫苗核酸为模板,建立L.intracellularis TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。对该检测法制作了标准曲线,并进行了特异性、敏感性和重复性试验,并将其应用于猪增生性肠炎诊断。结果表明,所建立的TaqMan实时荧光定量方法特异性强,仅对含有L.intracellularis扩增出S型荧光曲线,而对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌等均无扩增;该方法在1.2×102¹.2×108 copies/μL有良好的线性关系,相关系数为0.972;最低检测浓度为10copies/μL,重复性良好。对79份临床样品检测表明,该方法灵敏度高于普通PCR方法,可用于猪增生性肠炎的临床诊断。     

闽西地区猪增生性肠炎的调查

为调查闽西地区猪增生性肠炎发病情况,应用PCR技术对2008年龙岩学院动物医学研究所接诊的6周龄~20周龄腹泻病例进行了胞内劳森氏菌检测。结果表明,被检测的8个猪场均存在胞内劳森菌感染,61份粪便样品中21份(44.2%)呈阳性,其中6周龄~8周龄猪阳性率为46.7%,9周龄~13周龄生长猪阳性率为47.8%,14周龄~20周龄阳性率为42.9%。由此说明闽西地区猪场普遍存在猪增生性肠炎的感染。     

17个疑似PEP猪群中劳森氏胞内菌的检测结果

自从1993年从发生增生性肠炎(PPE)的病猪中成功地分离到劳森氏胞内菌,并复制出PPE以来,许多国家和地区都已证实存在PPE病例。但由于劳森氏胞内菌在体外培养较困难,需要特殊的细胞系,所以我国对该病的研究尚在起步阶段,目前仅有少数猪病诊断实验室能应用PCR方法来检测劳森氏胞内菌。现将我们在2004年1-10月间对17个疑似PPE猪群中劳森氏胞内菌的检测结果报告如下,供大家参考。一、材料与方法1.疑似PPE猪群的选择,应符合下列条件之一:(1)2￣4月龄猪散发性腹泻;(2)后备种猪或育肥猪急性死亡,皮肤苍白。2.检测样品的采集:腹泻粪便或回肠…     

过氧乙酸戊二醛复方消毒剂治疗猪急性回肠炎效果研究

胞内劳森菌可引起猪的回肠炎,给猪场带来一定经济损失。为了解过氧乙酸戊二醛复方消毒剂以饮水消毒方式,治疗3月龄生长猪急性回肠炎的效果。本文通过PCR检测不同饮水方法(80%泰妙菌素60 g/T、10 g/T漂白粉、1:1 000×2(0～2)过氧乙酸戊二醛复方消毒剂)治疗发病猪7 d内的粪便胞内劳森菌带菌情况,并结合临床变化评价治疗效果。检测结果显示,泰妙菌素和过氧乙酸戊二醛复方消毒剂(1:1 000)用药后第3 d的猪粪检测不到胞内劳森菌的核酸,漂白粉和过氧乙酸戊二醛复方消毒剂(1:4 000)用药后第6 d的猪粪检测不到胞内劳森菌的核酸。过氧乙酸戊二醛复方消毒剂(1:1 000)与泰妙菌素饮水治疗猪急性回肠炎时具有相同效果,优于常用饮水消毒剂漂白粉;且1:4 000时仍具有良好效果。     

猪胞内劳森氏菌lscN基因的克隆及序列分析

胞内劳森氏菌是猪增生性肠炎的病原,试验设计4条引物,采用半巢式PCR从目的 DNA中扩增出1317bp的胞内劳森氏菌lscN基因,并进行序列分析。结果表明,lscN与Gen Bank中PHE/MN1-00、N343同源性为99%,是劳森氏菌三型分泌系统组件的编码基因。     

香鱼假单胞菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立香鱼假单胞菌的快速定量检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的rpo D基因序列设计了一对特异性引物,以该菌基因组DNA为模板通过PCR扩增其180 bp的rop D基因片段,并克隆于p MD18-T载体中,以纯化的重组质粒为标准品建立了香鱼假单胞菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示在1.9×103拷贝/μL~1.9×108拷贝/μL范围内呈现良好的线性关系,相关系数为0.999,灵敏度可达1.9×103拷贝/μL;该方法对恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、创伤弧菌等病原菌DNA扩增结果均为阴性,特异性良好;组内和组间变异系数均小于2%,具有较高的重复性和稳定性。本研究建立的方法不仅能够快速检测香鱼假单胞菌,还能够对该病原菌感染的动态变化进行定量研究,为大黄鱼香鱼假单胞菌感染导致的内脏白点病的早期诊断及防控提供一个新的检测技术。     

猪增生性肠炎的血清学调查

猪增生性肠炎是由胞内劳森氏菌引起的一种肥育猪肠道传染病,急性感染猪在出现血便后1～2天内死亡,慢性感染猪以顽固性腹泻为特征,严重影响肥育猪的生长发育。该病在欧美国家报道较多,并已研究成功用弱毒疫苗预防和药物治疗的方法。但由于胞内劳森氏菌的培养要求较高,需要特殊的细胞培养技术,我国目前对该病的研究尚在起步阶段,仅在少数实验室开展胞内劳森氏菌的PCR检测,