新疆地区一株马流感病毒的分离及鉴定

2007年10月,我国新疆维吾尔自治区阿勒泰地区富蕴县发现马匹出现呼吸道疾病,发病马表现出典型的流行性感冒症状。经过临床诊断、病原分离、电镜观察以及病毒基因序列分析,确定病原为马流行性感冒病毒,属于H3N8亚型,该株病毒与近年来马流行性感冒病毒北美洲流行株的同源性较高,命名为A／equine／xinjiangFuyun／3／2007（H3N8）。     

马流感病毒(A/Equine/Qinghai/1/94)神经氨酸酶基因的克隆与同源性分析

本试验根据已发表的马流感病毒神经氨酸酶(NA)基因序列，设计并合成一对特异性引物，经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功扩增出了我国马流感病毒青海株(A／Equine／Qinghai／1／94)NA基因，将片段连接到PGEM—T-easy载体并转化DH5a，提取阳性菌落的质粒经EcRol酶切和PCR鉴定其大小均为1．4Kb左右，对其测序并构建NA基因进化树。经过比较分析发现，我国马流感病毒青海株与A／Equine／Alaska/1／91、A／Equim／Tennessee/5／86和A／Equine／Algiers/72等关系较近，核苷酸同源率为98．2％—97．4％；与我国马流感吉林株(A／Equine／Jilin／1／89)关系较远，核苷酸同源率仅为72．0％；而与H7N7亚型马流感病毒A／Equine／Prague／1／56核苷酸同源率仅为38．0％。     

一株野鸟源H3N8亚型流感病毒分离株的全基因组序列分析

本研究对2014年从新疆额敏县分离到的一株野鸟源H3N8亚型流感病毒A/wild bird/Xinjiang/S3525/2014(H3N8)进行了全基因序列和进化分析。序列分析显示,HA裂解位点序列为~(339)PEKQTR-GLFG~(348),为典型的低致病性禽流感病毒特征,NA基因具有6个潜在的糖基化位点,与病毒株A/mallard/Czech Republic/14333-1K/2011(H3N8)核苷酸高度同源(97.7%)。该毒株的内部基因来源较复杂,其PB1、NP基因分别与A/ruddy shell duck/Mongolia/921C2/2009(H7N1)和A/wild duck/Korea/MHC39-26/2011(H7N9)的同源性最高,其余内部基因与H2、H3、H6、H7等亚型禽流感病毒分离株同源性最高,呈现明显的异源性。除PB2基因外,其余基因片段均来源于野鸟源禽流感病毒。     

高通量测序分析1株H7N9流感病毒的全基因

为探索利用高通量测序开展H7N9亚型流感的监测、全基因分析和溯源研究的方法,使用Ion Torrent PGM测序仪对1株H7N9流感病毒进行了全基因测序,分析了此毒株的基因组特性和进化特征。结果显示,该毒株与2013年引起我国华东地区疫情的H7N9流感毒株的亲缘关系较近;纵观在不同年代和地点分离的H7N9流感病毒的6个内部基因,2013年疫情之前和之后的H7N9流感病毒存在明显差异。     

通用引物扩增甲型流感病毒基因组及其高通量测序

为探索使用高通量测序方法测定甲型流感病毒的基因组,设计了一对通用引物进行甲型流感病毒全基因组的RT-PCR扩增,并分析了该方法的敏感性。结果显示,该方法能够扩增的甲型流感病毒多种亚型的全部8个节段的基因,其扩增敏感性为100 pg RNA。     

马流感病毒(A/equine/Qinghai/1/94)核蛋白基因的序列测定及同源性分析

根据已发表的马流感病毒核蛋白基因序列，设计并合成一对特异性引物，经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）成功扩增出了我国马流感病毒（A/equine/Qinghai/1/94核蛋白基因。将该片段连接到PGEM-T-EASY载体并转化DH5α，提取阳性菌落的质粒径EcRo1酶切的PCR鉴定其大小为1.5kb左右，对其测序并进行分析发现，与A/Equine/Kentucky/2/86,A/Equine/Miami/1/63等关系较近，同源率为93.3%--93.4%，而与我国马流感吉林A/Equine/Jilin/1/89株关系较远，同源率仅为84.6%。     

马流感病毒A/马/青海1/94株亚型鉴定及其HA基因序列特征

本试验用AI标准阳性分型血清对我国马流感病毒A／马/青海/1／94进行了血凝素(H)和神经氨酸酶(N)的鉴定，并与马流感病毒吉林株、黑龙江株、北京株及国际标准株A／切ukx／Mgxd／2／63进行了对比，结果显示，1944年在我国青海省暴发的马流感病毒的亚型为H3N8；以反转录。聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增该株的血凝素基因，并克隆到pGEM-Teasy载体上，采用双脱氧末端终止法测定该cDNA片段共1738个核苷酸序列，并推导出其编码的565个氨基酸的序列。利用Genbank blast和基因进化树分析软件分析各毒株之间的亲缘关系，发现A／马/青海/1/94与1992年香港马流感分离株存在较近的亲缘关系。     

一株金黄色葡萄球菌小菌落突变株全基因组测序分析

对金黄色葡萄球菌小菌落突变株(small colony mutant strains Staphylococcus aureus,SASCVs)和CP000253.1基因组差异进行了研究,为后续研究金葡菌分泌抗药物相关物质能力提供数据支持。对一株金葡菌小菌落突变株进行全基因组测序,并与CP000253.1参考序列进行序列比较。结果显示,金葡菌SCVs的文库插入片段为350bp,测序读长为150bp,SCVs的原始数据量为551 Mb,SCVs的碱基含量分布在处理前后有所不同,通过重测序,存在单核苷酸多态性(SNP)的数量较大。金葡菌SCVs与CP000253.1参考序列之间存在明显的序列差异,该数据为研究金葡菌感染奶牛乳房炎提供了一定的序列依据。     

马流产沙门菌fimY基因同源性分析及蛋白表达

为对马群中沙门菌进行快速、准确检测,根据GenBank公布的沙门菌菌毛蛋白fimY基因为模板设计一对特异性引物,用PCR方法扩增fimY部分基因。将fimY目的基因亚克隆至PGEX-4T-2原核表达载体,转入BL21(DE3)感受态细胞后用IPTG进行诱导表达,并对目的蛋白进行反应性检测。结果表明,克隆fimY基因大小为490bp;成功构建fimY原核表达载体PGEX-fimY,经SDS-PAGE显示带有GST标签的目的蛋白大小为47ku,与预期相符;Western blot证明,目的蛋白fimY能够结合沙门菌标准阳性血清,为建立马流产沙门菌间接ELISA检测方法奠定了基础。     

犬副流感病毒CC-14株全基因组测序及分析

为研究犬副流感病毒(CPIV)CC-14株全基因组序列特征,本研究参照猴病毒5型全基因组序列设计了覆盖CPIV CC-14株基因组全长的14对引物,对CPIV CC-14株进行RT-PCR分段扩增,扩增产物分别克隆于p MD18-T载体中,以通用引物进行序列测定、拼接并分析。结果显示,CPIV CC-14株全基因组序列大小为15246 nt(KP893891)。以高度保守的1 530 bp NP基因序列对现有的CPIV进行系统发生分析,同源比对结果显示,CPIV CC-14株与其他17株参考序列的核苷酸同源性为97.25%~99.80%,推导氨基酸同源性为98.62%~99.80%;系统发生分析显示,CC-14株与长春牛源PV5-BC14株同属一个分支。     

牦牛病毒性腹泻病毒全基因测序及生物信息学分析

从牦牛(Yak)体内分离出牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV/MDV),参考GenBank中已收录的BVDV-Ⅰ型的全基因组序列,设计了19对引物,通过RT-PCR方法,对牛病毒性腹泻病毒牦牛株进行克隆及测序,得到其全基因组序列(GenBank登录号:JQ799141),序列全长12214 nt,其中5'-UTR长288 nt,3'-UTR长232 nt。将牦牛株BVDV全基因序列与GenBank中登录的其他8株BVDV病毒全基因序列进行同源性比对及系统进化分析,结果表明,牦牛株BVDV与BVDV-Ⅰ型毒株出于同一分支,但与其他8株BVDV毒株全基因序列同源性均不高,有可能属于新的独立基因型或基因亚型,仍需进一步研究证实。     

塞内卡病毒CH/ZZ/2016株全基因组测序与分析

为了解塞内卡病毒分离株SVA/CH/ZZ/2016全基因组序列,设计4对相互重叠的特异性引物扩增基因片段,将扩增产物分别克隆至pCE2TA/Blunt-Zero载体并进行测序,拼接校正后获得SVA/CH/ZZ/2016株全基因组。结果显示,该毒株基因组全长7 292 bp,包括5''UTR（670 bp）、ORF（6 546 bp）以及3''UTR（76 bp）。选择国内外其他9株参考毒株序列,对编码区12个基因的核苷酸及编码氨基酸进行比对。结果显示,核苷酸同源性最高的是3B基因,最低的是VP1基因,其余基因的核苷酸序列同源性均在85.2%~100%之间。VP1基因遗传进化分析显示,SVA/CH/ZZ/2016株与美国分离株USAIL_Purdue_43_2016和USAIN_Purdue_3698_2016株亲缘关系最近,属同一进化分支,与原始毒株SVV-001株亲缘关系最远。对SVA/CH/ZZ/2016株和原始毒株SVV-001 VP1蛋白的氨基酸序列进行比对,发现共有10处氨基酸差异。本研究通过对SVA/CH/ZZ/2016株全基因组测序及分析,为进一步开展SVA分子生物学研究及流行病学调查提供了基础数据。     

多重耐药胸膜肺炎放线杆菌GD2107株全基因组测序及生物信息学分析

【目的】通过对多重耐药胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)GD2107株进行全基因组测序及生物信息学分析,丰富APP基因组数据库信息;构建基于ApxⅣ基因的系统进化树,分析该菌株的进化关系,为探索APP致病机制和临床防控猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumia, PCP)提供参考。【方法】通过药敏试验测定分离菌株的耐药谱;采用全基因组测序技术(whole genome sequencing, WGS)对细菌DNA进行全基因组测序,分别利用Illumina NovaSeq、PacBio SequeI测序平台对全基因组测序结果进行基因功能注释及生物信息学分析(包括基因组基本信息、功能元件分析及亚系统分析等);基于ApxⅣ基因构建系统进化树。【结果】药敏试验结果显示,GD2107菌株对青霉素、头孢拉定(先锋Ⅵ)、卡那霉素等14种抗菌药均耐药。对GD2107株全基因组测序得到1条大小为2 271 987 bp的环状染色体(GC含量为41.21%)和2个大小分别为5 027和3 497 bp的环状质粒...     

1株库蠓源版纳病毒的分离与全基因组序列分析

为分析云南省虫媒病毒的种类与遗传特征,在云南省师宗县采集库蠓进行病毒的分离与鉴定;通过全长cDNA扩增与高通量测序技术获取病毒全基因组序列,进行序列比对与系统发生树构建。结果显示,从采集的库蠓样本中分离出1株可在C6/36细胞上引起细胞病变的毒株（YNSZ043）,病毒基因组为分节段双链RNA,琼脂糖凝胶电泳呈"2-4-3"的带型特征;电镜观察可见直径为70~80 nm,呈"指环状",表面具有纤维突起的病毒粒子。全基因组测序结果显示,YNSZ043毒株为版纳病毒（Banna virus,BAV）,基因组大小为20 683 bp,由Seg-1（3 762 bp）至Seg-12（861 bp）12个基因节段组成,与中国BAV毒株各基因节段的核苷酸序列相似性在64.8%~99.6%之间,氨基酸序列相似性在58.8%~100%之间,在系统发生树上YNSZ043毒株与中国分离的BAV聚为一簇,形成独立的中国进化支系。对决定BAV基因型的Seg-12分析结果显示,YNSZ043毒株属于A2基因型,该毒株的Seg-5/VP5与越南分离BAV毒株的核苷酸和氨基酸序列相似性高达97.1%和97.6%,表明该毒株的Seg-5基因节段很可能与越南毒株之间发生了基因重配。研究结果丰富了中国BAV的基因组序列,为开展云南省BAV的流行病学研究提供了参考。     

云南省蓝舌病病毒血清7型毒株的分离与基因组序列分析

2014年,我国广东省的哨兵牛上分离出蓝舌病病毒血清7型(B T V-7)毒株,但该血清型病毒在我国的流行情况尚不清楚,本研究旨在分离我国流行的BT V-7型毒株并掌握其遗传特征.作者在云南省景洪市勐罕镇设立哨兵牛,每周定时采血,并接种C6/36、B H K-21细胞分离虫媒病毒,通过病毒蚀斑试验与增殖曲线分析病毒在细...     

猪流感病毒H3N2亚型的分离鉴定与全基因组序列测定

通过鸡胚接种、MDCK细胞培养、血凝及血凝抑制试验、RT-PCR等方法,笔者在四川首次分离并鉴定了1株既能在鸡胚上稳定传代又能在MDCK细胞上稳定产生CPE的H3N2亚型猪流感病毒,命名为A／swine／Sichuan／01／2006（H3N2）;NS基因的测序结果表明：该病毒分离株与A／swine／HongKong／4361／99（H3N2）、A／NewYork／429／2003（H3N2）、A／Queensland／6／2000（H3N2）、A／New South Wales／4／1999（H3N2）等具有代表性的标准毒株的同源性都达到99％;从MDCK细胞中抽提流感病毒基因组进行全基因克隆,构建了11个包含全基因8个基因片段的文库。全基因测序结果表明,A／swine／Siehuan／01／2006（H3N2）共8个节段,全基因序列共计13577bp;基于HA、NA推导蛋白的无根进化树结果显示,四川分离株与人流感标准株A／Queensland／6／2000（H3N2）、A／South Australia／81／2000（H3N2）有较近的亲缘关系,而与猪流感标准株A／swine／Spain／42386／2002（H3N2）的亲缘关系较远。