不同菌核病抗性甘蓝型油菜中BnVRN2基因的克隆与表达

为了探索甘蓝型油菜开花期与菌核病抗性的关系,以甘蓝型油菜M083(抗病、晚花)和888-5(感病、早花)品系为材料对开花相关基因Bn VRN2进行克隆;对2个品系中Bn VRN2序列差异及核盘菌诱导前后的表达水平差异进行分析。结果显示,在甘蓝型油菜中Bn VRN2基因存在2个拷贝,分别命名为Bn VRN2a(位于A8染色体)和Bn VRN2b(位于C8染色体),Bn VRN2a在抗/感品系中存在序列差异,而Bn VRN2b则不存在。Bn VRN2a在M083和888-5中的CDS全长分别为1 278bp、1 284bp,分别编码425、427个氨基酸残基;2个品系中Bn VRN2a基因的CDS序列存在着12个SNP变异位点以及一个6bp的插入/缺失片段;核苷酸序列的差异导致了蛋白质序列7个氨基酸的改变,且第100位氨基酸变异存在于两者的锌指结构域中。Bn VRN2a基因在菌核病诱导前后,在M083和888-5中的表达水平都存在差异,初步推测该基因在甘蓝型油菜开花相关途径和菌核病防御反应中都起到一定的作用。     

过表达BnFUL基因对拟南芥花和角果发育的影响

为适应油菜机械化生产,提高油菜生产效益,挖掘甘蓝型油菜的抗裂角基因资源,基于候选基因途径,根据拟南芥FUL基因的序列设计引物,在甘蓝型油菜抗裂角品系R1-1中扩增Bn FUL基因。序列分析结果表明,Bn FUL基因的ORF长度为726 bp,编码241个氨基酸,具有典型的MADS转录因子结构域。氨基酸序列的比对结果显示十字花科植物FUL蛋白的功能域MADS-box和K-box的氨基酸序列变异较小,多数变异集中在3'末端的非domain区。在拟南芥中过表达Bn FUL基因后发现Bn FUL基因具有一因多效作用,其不仅能增强拟南芥角果的裂角抗性,还能促进拟南芥提前开花,并产生复果现象,在一些转基因拟南芥植株中三个角果同时着生在一个果柄上。这些结果表明Bn FUL可能与甘蓝型油菜花和角果的发育相关。     

甘蓝型油菜KCS13基因克隆与组织表达特异性分析

通过巢式PCR和基因组步移方法,从油菜的基因组中获得一段长度为3 356bp的序列。分析显示,该序列包含了KCS13基因的编码序列和启动子,命名为甘蓝型油菜KCS13基因,其转录区全长为1 587bp,编码区长1 389bp,无内含子,编码一条长462个氨基酸的多肽链。在甘蓝型油菜A、C基因组中都有KCS13基因存在。该基因主要在花蕾中表达,茎、叶和种子中表达稍弱,根中未检测到该基因表达。     

甘蓝型油菜尿卟啉原Ⅲ合成酶基因BnHemd的克隆和功能分析

为探讨油菜尿卟啉原Ⅲ合成酶基因Bn Hemd的功能及其与叶绿素合成的关系,促进光合效率和产量的提升,利用基因编辑技术对甘蓝型油菜中双11号中该基因在A9和C8染色体上的两个拷贝进行编辑。从中双11号中克隆到基因Bn A09.Hemd和Bn C08.Hemd,CDS序列分别为885 bp和876 bp,均由9个外显子构成,各编码294和291个氨基酸残基。Bn Hemd蛋白性质与结构分析结果表明,甘蓝型油菜中基因Bn Hemd的两个拷贝的蛋白理化性质十分相似,均为不稳定蛋白,相对分子质量分别为31.97 k D和31.40 k D。系统进化树分析表明,Bn A09.Hemd和Bn C08.Hemd分别与白菜和甘蓝中的同源基因亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明,Bn Hemd在中双11号的根、茎、叶、花蕾、种子和角果皮中均有表达,在角果皮和花蕾中的表达量远高于根、茎、叶。初步的功能分析结果表明,中双11号中该基因两个拷贝同时编辑的植株表现为:叶绿素含量显著减少、光合速率降低、生长迟缓,表明甘蓝型油菜BnHemd对叶绿素合成起重要作用,同时影响光合效率和生长发育。     

甘蓝型油菜抗苯磺隆突变体ALS基因分析与SNP标记

为筛选新型甘蓝型油菜抗苯磺隆除草剂的等位基因特异分子标记,以EMS诱变的甘蓝型油菜中双9号M2群体(约30 000单株)为材料,通过苯磺隆喷药处理筛选到3株抗除草剂突变体(分别记为K1、K4、K5)。利用PCR技术克隆到抗性突变体相应的Bn ALS1、Bn ALS2、Bn ALS3基因,序列分析结果表明,K1和K4的Bn ALS3基因序列发生碱基突变,其中第+535位C碱基突变为T,导致其编码的Bn ALS3蛋白第197位氨基酸由Pro突变为Ser;而K5的Bn ALS1基因序列第+544位C突变为T,导致其编码的Bn ALS1蛋白发生了Pro197Ser的改变(均以拟南芥ALS氨基酸序列为准)。其中K5抗性位点Bn ALS1∶Pro197Ser的改变属于首次报道。基于突变的基因序列设计了8对等位基因特异性PCR引物组合,有6对能用于区分抗性突变体和野生型材料,其中可检测K5的Bn ALS1基因SNP位点的引物有2对,可检测K1、K4突变体Bn ALS3基因SNP位点的引物有4对。     

甘蓝型油菜异分支酸合酶基因的克隆及信号通路相关基因的诱导表达

为了解异分支酸合酶1(ICS1,水杨酸合成的限速酶)在甘蓝型油菜抗病过程中的功能,以甘蓝型油菜耐菌核病品种宁RS-1为材料,在核盘菌侵染时,研究甘蓝型油菜ICS1基因和水杨酸信号通路相关基因的诱导表达。首先利用同源序列法克隆得到宁RS-1中ICS1基因的c DNA序列,命名为Bn ICS1。Bn ICS1序列全长1 719bp,编码572个氨基酸残基,含有1个分支酸结合域。表明油菜中也存在异分支酸途径。接种核盘菌前、后及不同时期荧光实时定量PCR结果发现Bn ICS1在核盘菌接种后6hpi(接种后6h)表达量升高,但是24hpi后降低;而MPK4基因的表达量在6hpi降低,24hpi后升高,说明SA合成先是被核盘菌诱导,但随后又被抑制。EDS5基因和PR1基因表达量从接种后6hpi持续升高,而PDF1.2基因的表达量不断降低,说明SA信号通路最终受核盘菌诱导形成病斑,而茉莉酸途径及其诱导的植物防御反应受到抑制。     

甘蓝型油菜PPR家族生物信息学分析与新疆野生油菜候选育性基因克隆

通过隐马尔可夫模型从甘蓝型油菜基因组中获取1079条PPR家族蛋白序列,使用拟南芥PPR家族特征模型对其进行分类,同时进行聚类、染色体分布、亚细胞定位预测、功能注释等分析。结合不育系与恢复系分子标记筛选了定位于C09染色体的PPR基因GSBRNA2T00094406001(命名为Bn PPR_C09)为新疆野生油菜潜在育性调节基因。通过分子克隆的方法从新疆野生油菜不育系1193A和恢复系1193R中分别克隆获得了长度为2514bp的c DNA序列,序列分析显示来源于1193A的Bn PPR_C09基因(Bn PPR_C09b)相对源于1193R的Bn PPR_C09a在+1725 bp位置存在单碱基缺失,造成移码突变,二者预测蛋白的生物信息学分析显示Bn PPR_C09b蛋白的N端因为移码突变导致翻译过程在+1800位置终止,后续大量功能元件缺失,该位点的突变可能决定新疆野生油菜育性。     

油菜新种质12WH318咪唑啉酮抗性遗传及基因克隆和表达

研究油菜新种质12WH318咪唑啉酮抗性,为其利用提供理论基础。对亲本、F1、F2和BC1世代研究结果显示,油菜种质12WH318的咪唑啉酮抗性由1对核基因控制,无细胞质效应,呈完全显性遗传。已有研究显示,咪唑啉酮类除草剂的作用靶标是乙酰乳酸合成酶(ALS)。应用同源序列法,从抗性种质12WH318和3个非抗性种质中获得油菜Bn ALS基因家族中的Bn ALS1﹑Bn ALS2和Bn ALS3。比对Bn ALS1和Bn ALS3的核苷酸和氨基酸序列后发现,12WH318的Bn ALS1基因发生点突变致使蛋白序列的第638位丝氨酸(AGT)残基被天冬酰胺酸(AAT)所替代。对Bn ALS1和Bn ALS3基因进行相对表达量分析发现,除草剂处理1d后叶片中的Bn ALS1和Bn ALS3基因表达量急剧升高,在除草剂处理7d后Bn ALS1基因表达量显著低于清水对照,而Bn ALS3基因表达量与清水对照无显著差异。研究认为,12WH318的咪唑啉酮抗性可能主要由Bn ALS1基因控制。     

甘蓝型油菜BnDMC1.A01基因的分离及序列分析

人工合成甘蓝型油菜是进行基因组学研究和种质资源创新的重要材料，但其减数分裂过程中经常出现异常，导致基因组遗传的不稳定和花粉育性的下降。DNA meiotic recombinase 1 （DMC1）是植物中控制减数分裂的重要基因，为了解油菜DMC1同源基因的序列及表达变异，本研究利用拟南芥和芸薹属作物DMC1同源基因的外显子保守序列设计引物，分离了常规和合成甘蓝型油菜（Brassica napus L.）A01染色体上的DMC1全长序列。氨基酸序列比对发现，BnDMC1.A01编码的蛋白具有植物中已报道的DMC1典型的保守结构域。分离了19个不同品系中BnDMC1.A01的基因序列，共划分为六种单倍型，发现第二外显子内存在两个导致氨基酸残基变异的SNP位点，该SNP位点在3种类型的油菜中均有分布。基因表达量分析发现，BnDMC1.A01在合成甘蓝型油菜中的表达量较常规油菜高，这些变异是否同人工合成甘蓝型油菜减数分裂异常有关还需进一步的研究验证。     

甘蓝型黄籽油菜种子发育过程中若干特性的研究

比较甘蓝型油菜同一遗传背景组合分离出的黄黑两个品系在种子发育过程中若干特性。结果表明：黄籽比黑籽胚体转绿色快，退化胚珠数少，结籽率高。黄籽油菜种皮转色时期为开花后３０天。黄籽种子体积增加比黑籽快５—１０天，干物质积累速度在花后３５天内显著快于黑籽。黄籽含油率比黑籽高７．９７％。     

甘蓝型油菜半胱氨酸蛋白酶基因BnCP51及其启动子的克隆与表达

为通过转基因技术建立新型授粉控制体系,克隆与雄性不育相关的基因及启动子,根据甘蓝型油菜全基因组信息设计特异引物,获得半胱氨酸蛋白酶家族基因Bn CP51的完整开放阅读框和上游启动子序列。Bn CP51基因全长1 032bp,在Gen Bank登录号KC898325,启动子长1 951bp。生物信息学分析表明,Bn CP51具有木瓜蛋白酶基因家族典型的保守结构域ERFNIN和GCNGG功能域。实时荧光定量PCR结果表明Bn CP51在花蕾中高量表达。在线启动子序列元件预测分析发现Bn CP51启动子序列中有多个花药特异表达元件。构建重组载体p Bn CP51::GUS,转化拟南芥,GUS染色结果表明在Bn CP51启动子的驱动下,报告基因GUS仅在中期花蕾和花药中特异表达,在其他组织中不表达。     

甘蓝型油菜Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD)基因的克隆与表达分析

为改良甘蓝型油菜菜籽油脂肪酸的组分,根据拟南芥Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD)核酸序列特征,检索白菜全基因组SAD基因和cDNA的可能序列,通过同源序列法克隆获得6个甘蓝型油菜SAD基因。比对结果显示,这6个基因编码的氨基酸序列同源性达53.2%~96.3%。系统进化分析显示,甘蓝型油菜SAD基因与蓖麻、大豆、芝麻、葵花等6个油料作物SAD基因的序列相似性很高,甘蓝型油菜与这些高等植物的SAD基因在进化上具有较高的保守性。本文还对4个甘蓝型油菜SAD基因BnSAD1:1、BnSAD2:1、BnSAD2:2和BnSAD2:3进行了表达模式分析,发现它们在种子发育过程中表达,并且都在40d的种子中表达量达到最高值,推测这4个基因均参与了硬脂酰ACP (C18:0-ACP)脱氢生成油酰基ACP(Δ9C18:1-ACP)的过程,尤其是BnSAD2:3可能为种子特异表达基因。     

油菜BnSGS3基因克隆及转基因拟南芥病毒抗性

为阐明甘蓝型油菜Bn SGS3抗病毒功能,用5'-RACE和巢氏PCR方法从油菜中克隆了Bn SGS3。该基因全长2 638bp,包含4个内含子和1个1 824bp的完整开放阅读框。序列对比发现,Bn SGS3与其他SGS3基因同源性在58.9%~97.5%之间。构建Bn SGS3过表达载体(Bn SGS3-Ov)和干扰表达载体(Bn SGS3-Si),通过浸花(Floral-dip)法转化拟南芥,经除草剂筛选及PCR检测,获得2种转基因拟南芥各30株。拟南芥接种黄瓜花叶病毒(CMV)的抗性鉴定显示,转Bn SGS3-Ov植株发病轻,株型基本正常,后期能正常开花结籽,对CMV表现中抗;而转Bn SGS3-Si植株发病重,不能正常开花结籽。接种油菜花叶病毒(Yo MV)后,2种转基因和非转基因拟南芥均对Yo MV表现感病,说明Bn SGS3对CMV有一定抗性,但对Yo MV无明显抗性。     

甘蓝型油菜BnPex16p基因cDNA的克隆与表达

利用模式植物拟南芥AtPex16p/sse1基因序列与油菜数据库BBSRC BrassicaDB比对,得到甘蓝型油菜(Brassica napus)同源EST序列,拼接出油菜Pex16p基因全长cDNA电子克隆,然后设计全长引物,以甘蓝型油菜种子cDNA为模板,克隆Pex16p基因,得到全长为1 101bp的cDNA,编码366个氨基酸的蛋白,命名为BnPex16p。BnPex16p基因序列与拟南芥AtPex16p/sse1同源,其蛋白与拟南芥同源蛋白具有完全相同的PTS2型过氧化物酶体定位肽,进化关系相近。半定量PCR(RT-PCR)发现BnPex16p基因在油菜幼嫩的根、茎、叶和种子中均有高丰度表达,在种子发育过程的中期和后期表达水平增加,暗示该基因在油脂的积累中有重要作用。     

甘蓝型油菜籽色及春化遗传

甘蓝型油菜籽色及春化遗传利用甘蓝型油菜双倍体及杂交Ｆ２研究种子颜色和春地遗传。结果表明，籽色主要由母本基因型决定，但父本的作用也能在正反交Ｆ２代中显现。种子颜色由三对基因控制，黑籽显性比黄籽强。用黑籽植株作母本，杂交Ｆ２及四个双倍体群体的分离比率显示...     

甘蓝型油菜BAN同源基因片段克隆与序列分析

参照拟南芥（Arabidopsis thaliana)BAN基因和cDNA的保守序列设计引物，对甘蓝型、白菜型、芥菜型油菜和拟南芥及其它十字花科栽培品种的基因组总DNA进行PCR扩增，均获得与拟南芥BAN基因扩增片段大小极其相似的PCR扩增产物，表明BAN基因可能广泛存在于十字花科植物中。甘蓝型油菜和拟南芥BAN扩增片段测序比较分析显示，拟南芥BAN片段（779bp)与已往的报道完全相同，甘蓝型油菜的BAN片段（780bp)与拟南芥BAN外显子的同源性为90％，但与内含子的同源性仅为74％。甘蓝型油菜BAN氨基酸序列与80多种植物的NADPH还原酶类有不同程度的同源性。     

甘蓝型油菜转录因子FUS3的克隆、表达分析及其与脂肪酸组分的关系

 为了探讨油菜转录因子FUS3的功能及其与脂肪酸组分的关系，从甘蓝型油菜湘油15中克隆到BnaFUS3基因的两个拷贝BnaA2.FUS3和BnaA6.FUS3。它们的CDS区序列分别长927bp和948bp，编码309和315个氨基酸，氨基酸序列变异多发生在C端。转录因子BnaA2.FUS3和BnaA6.FUS3属于含B3结构域的蛋白家族，是亲水性蛋白，无跨膜区，均是膜外蛋白。系统进化树分析表明，BnaA2.FUS3、BnaA6.FUS3两者都是BraFUS3和AtFUS3的同源基因。荧光定量PCR分析表明，BnaA2.FUS3在根、茎、叶、角果皮中均有表达，在种子中相对稳定表达，但在角果皮25d达到峰值；BnaA6.FUS3为种子特异表达，在种子35d达到峰值；两者在角果皮中表达量均呈“M”形趋势。分析脂肪酸积累规律与BnaFUS3表达关系发现，授粉30d后，BnaA2.FUS3和BnaA6.FUS3表达迅速升高，此时各脂肪酸也进入快速增长期；授粉后45d~50d时，两拷贝表达量变化较小，脂肪酸积累亦进入缓慢增长期，并趋于平稳。表明BnaFUS3在甘蓝型油菜的胚胎形成和发育中具有重要影响，对脂肪酸的合成和油脂积累起到重要作用。     

油菜黄籽形成的分子机制研究

利用自然突变的遗传稳定黄籽材料,并且培育遗传背景相同的近等基因系,将种子的种皮和胚分离,从种皮颜色的决定物质研究入手,运用组织化学、遗传学、群体基因组学的方法,对油菜黄籽形成的分子机制和起源驯化进行了深入、系统研究,发现原花色素在油菜种皮中积累决定种皮颜色,油菜黄籽源于调控原花色素合成的转录因子基因TT8突变,致使DFR等基因不能被激活转录,从而不能催化原花色素生物合成底物的形成,原花色素合成需要的乙酰辅酶A被用于油的合成,减少种皮厚度,提高种子含油量。芥菜型油菜黄籽是在芥菜型油菜成种后在中国人工选择驯化的产物。创建了基于苗期黄籽基因型选择+种子发育早期香草醛染色观察的甘蓝型油菜黄籽高油分芥甘种间杂交育种体系,并成功用于育种实践。     

甘蓝型油菜黄籽突变体的遗传研究

甘蓝型油菜显性黄籽突变体９３３０４４产生于甘蓝型黑籽油菜复合杂交第８代。通过９３３０４４与甘蓝型油菜黑籽双低品系９３４３１和７２１—１杂交,研究种籽粒色性状遗传。在９３３０４４×９３４３１杂交组合中,Ｆ１表现黄籽,Ｆ２黄籽株与黑籽株呈３∶１分离。在９３３０４４×７２１—１杂交组合中,Ｆ１表现黑籽,Ｆ２黄籽株与黑籽株比例３∶１３。以上结果表明突变体的黄籽性状受１对显性黄籽基因和１对上位显性黑籽基因互作控制。用Ｙｃ—ｙｃ和Ｂｃ－ｂｃ表示２个基因座的２对等位基因,Ｙｃ为显性黄籽基因,Ｂｃ为上位显性黑籽基因。黄籽性状的广义遗传力ｈ２Ｂ＝６９．８８％～８６．１８％,表明突变体９３３０４４黄色种皮性状有较高的遗传能力。     

甘蓝型油菜裂角相关基因BnRPL的克隆与分析

为鉴定甘蓝型油菜裂角相关基因，基于候选基因途径，利用同源克隆结合RACE方法，在甘蓝型油菜易裂角品系R2中扩增出了两个RPL基因的全长cDNA序列，其中一条序列长度为2 068bp，开放阅读框序列位置为154-1 911位，总长为1 758bp，命名为BnRPL.a。另一条序列全长为2 041bp，开放阅读框序列位置为154-1 887位，总长为1 734bp，命名为BnRPL.c。分析表明利用PCR方法得到的BnRPL基因由3个内含子和4个外显子组成，与拟南芥RPL基因结构相似。氨基酸序列同源性分析表明，BnRPL与拟南芥AtRPL和荒野独行菜（Lepidium campestre）的RPL具有较高的同源性。系统发育进化树显示RPL蛋白在双子叶植物和单子叶植物的分化过程中发生了序列变异。BnRPL基因存在时空表达的组织特异性，在发育的角果表达量最大；成熟后期在角果皮和假隔膜中表达，在种子中不表达。