两株鸡新城疫病毒强毒株的分离与分子鉴定

从上海市发病鸡群中分离到两株新城疫病毒(NDV),其MDT分别为51.2 h和50.4 h,ICPl分别为1.850和1.875,均为强毒株.用RT-PCR扩增F基因cDNA片段,并将其分别克隆到pGEM-T easy载体中.序列分析结果表明,两分离株的F基因片段均为1 654 bp,编码551个氨基酸,其F蛋白的氨基酸序列同源性达100%,但与常见疫苗株的氨基酸同源性仅为78.3%～83.7%.F蛋白裂解位点序列均为112R-R-O-K-R-F117,属于基因Ⅶ型NDV.     

IBRV内蒙古分离株gD基因的分子克隆与序列分析

根据已发表的牛传染性鼻气管炎病毒( GenBank NC_001847) gD基因序列设计1对特异性引物,采用PCR方法扩增出内蒙古分离株gD基因的cDNA,重组到PMD19 -T载体中,并进行克隆及序列测定.经限制性内切酶谱分析和序列分析,证明所克隆的cDNA为gD基因.该基因片段长1 559bp,包含1个由1 251bp组成的完整开放阅读框(ORF),共编码417个氨基酸.序列比较和系统进化树分析结果显示:内蒙古分离株gD基因与GenBank上已发表的其它分离株相比,核苷酸同源性在99.1％～99.9％之间,其推导的氨基酸同源性在90..6％～99.8％之间,在系统进化树中内蒙分离株与AJ004801株亲缘关系较近,属于同1个分支.生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白具有亲水性,有很强的抗原性,有3个潜在糖基化位点,可能存在2个蛋白激酶C磷酸化位点,存在4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点.     

牛粘膜病病毒E1基因的克隆及原核表达

参考BVDVVEDEVAC株的基因组序列及E2基因的测序结果设计一对引物,扩增出预期585 bp的目的片段。扩增产物克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列VEDE-VAC株比较,二者的核苷酸同源性为100%,推导氨基酸同源性为100%。测序结果经同源性比较,克隆得到的基因与VEDEVAC株同源性最高。系统发生树分析推测E1基因与VEDEVAC株在进化上比较接近。将E1基因定向亚克隆到表达载体pGEX-6p-1中,对阳性重组质粒转化的大肠杆菌BL21进行诱导,E1基因获得了成功表达。     

鸡新城疫病毒洛阳分离株HN基因的克隆和序列分析

应用RT PCR技术从新城疫病毒洛阳分离株中扩增HN的cDNA片段,并将其克隆至pMD18 T载体进行核苷酸序列测定。结果表明:新城疫分离株HN基因片段长度为1716bp,编码571个氨基酸;推测出的氨基酸序列中有5个糖基化位点,12个半胱氨酸残基;与国内外的14株新城疫毒株HN基因相比,核苷酸和氨基酸同源性分别为66.4%~98.5%和87.8%~98.3%;与标准毒株Lasota和Clone30的亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸差异性较大,而与天津分离株和云南分离株的亲缘关系较近,基本属于同一基因群。     

蜡梅花香基因SAMT的cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

[目的]研究蜡梅花香基因SAMT cDNA的克隆及表达。[方法]以蜡梅花瓣总RNA为模板进行RT-PCR,扩增得到与预期大小相同的PCR产物带,回收RT-PCR产物,将其与PMD18-T载体进行T-A克隆连接并导入大肠杆菌DH5α,经菌落PCR和双酶切鉴定,筛选带有目的基因的重组质粒并进行测序。[结果]测序证实成功克隆得到蜡梅花香基因SAMT cDNA的ORF片段,其长度为1 196 bp,编码380个氨基酸残基,与已报导的蜡梅SAMT(ABU88887)的同源性为99.2%。将SAMT基因亚克隆到原核表达载体PGEX4T-1中获得重组菌种命名为PGSAMT,用0.01 mol/L的IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,SAMT的融合表达蛋白分子量约为66 kDa,与预期的26 kDa的GST带和42.3 kDa的蜡梅SAMT基因编码蛋白构成的融合蛋白大小接近。[结论]该研究成功克隆并表达蜡梅花香基因SAMT。     

伪狂犬病毒粤A毒株TK基因的扩增、克隆与序列测定

以华南农业大学兽医学院传染病教研室分离的伪狂犬病毒粤A毒株（PRV YA）的基因组为模板，利用聚合酶链反应（PCR）扩增TK基因，获得预定大小的片段，将这一自然克隆到PMD18－T载体中。对重组质粒PMD18－TK进行PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。     

鸡传染性支气管炎病毒N基因片段的RT-PCR扩增及限制性内切酶分析

根据鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)的已报道基因序列设计了 1对可扩增 N基因片段的引物 ,并得到了预期的 438bp扩增产物 ;将目的条带纯化并回收后 ,克隆到 PMD18- T质粒载体中 ,对插入片段进行序列测定 ,并与已发表的 IBV N基因序列进行了比较 ,证实扩增和克隆的产物是正确的 ;根据扩增的 N基因的序列 ,选择了 Bst X 酶对 IBV进行分析 ,发现 M41和澳大利亚 T株 Bst X 酶切图谱存在明显的差异 ,从而建立了一种新的鉴定 IBV病毒的方法。     

猪圆环病毒1型和2型四川分离株全基因克隆分析

参照Genbank收录猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)1、2型序列,设计两对特异性引物,分别扩增猪圆环病毒1型和2型四川分离株(PCV1-YA1株和PCV2-SC株)全基因组,获得了预期目标大小一致扩增产物,分别将其克隆于PMD18-T载体,分别命名为PMD18-T-PCV1-YA与PMD18-T-PCV2-SC。经酶切鉴定和序列测定证实,成功克隆了PCV1-YA1株1759bp和PCV2-SC株1767 bp的全基因组序列。所得序列与GenBank中的国内外其它PCV1和PCV2毒株进行比较分析,其同源性分别达到98.8%~99.9%与93.6%~98.6%;而PCV1-YA1株和PCV2-SC株之间的同源性则仅为69.2%,进一步分析两个毒株的主要阅读框架,毒株间ORF1核苷酸序列及推导的氨基酸同源性均为85.3%,而ORF2的核苷酸序列及推导的氨基酸同源性分别为66%和65.2%。推导显示两毒株之间ORF1编码产物疏水性区域分布有相似之处,而ORF2编码产物的跨膜区存在差异。     

传染性胃肠炎病毒陕西分离株S基因主要抗原位点基因的克隆与序列分析

根据GenBank公布的猪传染性胃肠炎病毒S基因的序列,设计合成1对特异性引物,通过RT-PCR从用细胞增殖的TGEV病毒液中扩增编码S基因B、C抗原位点的基因片段,然后将获得的片段克隆至pMD18-T载体上,构建重组质粒。通过PCR、酶切和测序鉴定重组质粒,将测序结果与GenBank公布的21个相关序列进行多序列比较并绘制进化树。所克隆的TGEV陕西分离株S基因B、C抗原位点基因片段长度为765 bp,与参考毒株的核苷酸同源性为96.1%~99.9%。进化树分析表明,分离株与中国的H株、HN2002株、TS株,美国的Miller M60株、Miller M6株及英国的FS772株亲缘关系较近,与H株的亲缘关系最近。     

保卫细胞中特异表达启动子片段缺失后表达载体的构建

iMyAP基因启动子的核心启动子370 bp片段能启动基因在保卫细胞中特异性表达。将其进行缺失,克隆得到370 bp、308bp和150 bp的启动子片段,与pMD18-T载体连接并进行序列分析后用BLAST软件作同源分析的结果显示,它们的核苷酸序列与GenBank中登陆的iMyAP启动子片段的核苷酸序列一致。将这3个启动子片段分别与pCAMBIA-1303质粒相连,构建得到表达载体。     

猪传染性胃肠炎病毒SC-H株M基因的克隆与序列分析

参照Genbank已发表的TGEV的核酸序列设计一对扩增M基因的引物,经RT-PCR扩增了SC-H株的M基因cDNA片段,插入pMD18-T构建重组质粒pMD-M,对pMD-M进行了酶切鉴定及核苷酸测序,将M基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列与参考毒株进行了比较分析。结果表明SC-H株M基因扩增片段长度为852bp,包含789bp的M基因编码区,编码262个氨基酸;SC-H株与TS、96-1933、FS772/70、HN2002、TFI、Purdue及TO14株的M基因核苷酸序列同源性为97.8%、94.2%、97.2%、97.8%、99.7%、96.8%及98.2%,氨基酸同源性为96.6%、92.0%、95.4%、96.6%、99.2%、95.8%及97.7%,表明不同毒株的M基因高度保守,系统进化分析显示SC-H株与Prudue株有较近的亲缘关系。     

鸡传染性喉气管炎病毒gC基因克隆测序

参考GenBank收录的传染性喉气管炎病毒gC基因序列设计并合成一对引物,以ILTV河南长葛株DNA为模板,PCR扩增出一条1270bp的特异性条带,并克隆至pGEM—T载体上。经PCR扩增、酶切鉴定,得到含gC基因重组质粒,并对重组阳性质粒进行序列测定,测序结果为1550bp。     

海岛棉DREB基因的克隆及植物表达载体的构建

根据GenBank上公布的棉花GhDREB1基因序列设计特异性引物,从海岛棉中克隆了一个与DREB类基因同源的cDNA序列,命名为XHDREB。序列分析表明,该cDNA序列长度为651 bp,推测含有216个氨基酸,分子量为24.6 kDa,等电点为9.46。同源性分析表明,它与GhDREB1的氨基酸序列同源性为85.19%。所编码蛋白具备DREB1转录因子的特征:含有58个氨基酸组成的AP2 DNA结合域以及两个DREB1/CBF特征氨基酸序列PKKRAGRKKFRETR和DSAWR。然后将XHDREB基因连接到pCAMBIA2300-35SOCS质粒上,构建了植物表达载体。     

磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达

[目的]检测磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因在大肠杆菌中能否高效表达.[方法]根据GenBank所公布的serC基因序列设计一对特异性引物,以E.coliJM109基因组为模板PCR扩增目的基因片段,将得到的目的基因定向克隆至大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7中,构建重组表达载体并转化宿主菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析.[结果]通过PCR扩增得到约1 100 bp的DNA片段,经测序后分析该基因与已发表的serC基因具有99.27;的同源性;对重组表达载体进行酶切和PCR方法鉴定正确的命名为pEC7- C;重组表达载体转化宿主菌,SDS-PAGE分析可见约41 kD与理论大小一致的目标蛋白条带.[结论]重组表达载体转化后E.coli BL21中蛋白表达量比原始菌株的蛋白表达量高,证明 serC基因在E.coli BL21(DE3)中成功表达,为进一步构建L-丝氨酸高产基因工程菌奠定了基础.     

梁平柚葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达

基于GenBank公布的葡萄糖基转移酶(LGT)基因的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以梁平柚成年树幼叶总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增葡萄糖基转移酶基因,将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了该基因的融合表达载体pET28a-CmLGT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中.经1.0mmol/LIPTG诱导表达获得大小约为62Kd的目的融合蛋白.     

弓形虫GJS株表面抗原1基因的克隆及真核表达质粒的构建

根据GenBank数据库中的RH株弓形虫表面抗原1(SAG1)基因序列设计1对引物,应用PCR技术从弓形虫GJS株速殖子基因组DNA中扩增编码SAG1的基因片段.PCR产物经纯化、酶切后定向插入pcDNA3.1(+)真核表达载体,转化至大肠杆菌DH5α,经酶切及PCR鉴定后测序,并进行序列分析.结果表明:从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增出1 008 bp的特异SAG1片段,大小与预测值相符,与已知的SAG1基因核苷酸序列(GenBank登录号:S76248)的ORF和氨基酸序列的同源性均为99%.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒兰州分离株ORF3基因的克隆及杆状病毒载体的构建

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF3序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃Lanzhou株的ORF3基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBacHTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBacHTA-ORF3,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pFastBacHTA-ORF3转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组转座子rBacmid-ORF3.成功构建了PRRSV Lanzhou株ORF3基因的杆状病毒载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础.     

鸭瘟病毒河南株gI基因的克隆与测序

参考GenBank中鸭瘟病毒gI基因序列设计并合成引物,以鸭瘟病毒河南分离株DNA为模板进行PCR扩增,将扩增片段克隆至PGEM-T载体上,得到含gI基因重组质粒。经酶切鉴定,并对重组阳性质粒进行序列测定。结果表明,获得的片段含鸭瘟病毒gI基因,全长1 089 bp,与已报道的其他疱疹病毒gI基因具有较高的同源性,编码432个氨基酸,蛋白分子质量为39.7ku、等电点(PI)为6.06。     

7种植物花瓣ACO基因的克隆与分析

为获得通用的适用于植物花瓣ACO基因克隆与检测的引物,根据Genbank中收录的双子叶木本植物的ACO基因序列,设计1对简并引物,并用其对随机选择的7种植物(紫罗兰、多头菊、冬樱、迎春、云南杜鹃、垂丝海棠、山茶)的花瓣的RNA进行PCR扩增。结果发现：从7种植物花瓣中都能扩增出约800 bp的特异片段,登录Genbank发现均未被注册,将序列提交Genbank数据库,获得7种植物花瓣ACO基因的登录号(JX503067、JX503068、JX503069、JX503070、KC112390、KC112392、KC112393);在NCBI上进行blast比对,发现所克隆的7个ACO基因均与其他植物的ACO基因有一定的序列相似性,其中冬樱ACO基因与千叶桃花ACO基因同源性最高,为98%,迎春ACO基因与中华猕猴桃ACO6基因的同源性最低,为88%,将7个ACO基因的片段进行多序列比较分析,发现两两之间序列平均相似性为77%。