对牛卵母细胞孤雌激活条件优化的研究

本文探讨了HYA（透明质酸酶）的浓度和作用时间对牛体外成熟卵母细胞脱卵丘的影响,不同强度电脉冲＋乙醇＋6-DMAP对牛体外成熟卵母细胞的孤雌激活作用以及和乙醇＋6-DMAP激活的比较。对电融合脉冲强度和脉冲次数进行了优化。结果表明：卵母细胞成熟培养22h,用0．20％HYA作用10min或0．50％HYA作用5min效果较好。在激活电压1．6kV/cm、20μs／次、间隔1s,脉冲次数为1次的条件下的激活效果较好,在此条件下与乙醇＋6-DMAP激活相比较,孤雌激活胚胎的囊胚率分别为19．6％和26．9％,差异不显著。     

氯化锶对小鼠不同减数分裂阶段卵母细胞孤雌激活的研究

为了研究氯化锶(Sr Cl2)对小鼠不同减数分裂阶段卵母细胞孤雌激活,试验选取8周龄昆明小鼠进行同期发情和超数排卵,分别获取处于第2次减数分裂中期的成熟卵母细胞和利用细胞松弛素D抑制极体排出的处于第1次减数分裂中期的卵母细胞,利用含有10μmol/L氯化锶的16 mmol/L培养液进行孤雌激活。结果表明:利用细胞松弛素D抑制第一极体排出的卵母细胞经氯化锶激活后的卵裂率为47.69%,但显著低于成熟卵母细胞的卵裂率(59.72%)(P0.05)。卵裂后,来自第1次减数分裂中期的孤雌胚胎囊胚率为16.92%,低于来自第2次减数分裂中期的孤雌胚胎的囊胚率(18.06%),但两者差异不显著(P0.05)。说明氯化锶可以对处于不同减数分裂阶段的小鼠卵母细胞进行孤雌激活,但激活效果差异较大,经激活的孤雌胚胎均可正常向后发育。     

氯化锶对体外成熟小鼠卵母细胞的最佳激活条件

为寻求小鼠体外成熟卵母细胞孤雌激活的最佳作用条件,本文对氯化锶作用浓度和时间进行了摸索。结果表明:去卵丘卵母细胞用10 mmol/L氯化锶分别处理1 h、2.5 h、3.5 h、5 h,激活率分别为89.3%、93.7%、94.6%、91.4%,差异不显著(P>0.05),囊胚发育率分别为3.2%、18.4%、7.9%、5.6%,2.5 h组的囊胚发育率显著高于其他组。用5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L的氯化锶激活卵母细胞2.5 h,激活率分别为86.2%、93.8%、92.5%、97.7%、78.1%,囊胚发育率分别为6.7%、16.8%、16.0%、25.9%、0%,30 mmol/L氯化锶的激活率和囊胚发育率都显著低于10、15、20 mmol/L氯化锶,与5 mmol/L氯化锶差异不显著,10、15、20 mmol/L氯化锶的激活率和囊胚发育率都没有显著差异。试验结果表明,10、15、20 mmol/L氯化锶为卵母细胞孤雌激活的最佳作用浓度,2.5 h的激活时间为最佳作用时间;氯化锶的浓度和作用时间对体外成熟的小鼠卵母细胞孤雌激活有显著的影响。     

曲古抑菌素(Trichostatin)A对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育能力的影响

曲古抑菌素A（Trichostatin A,TSA）是一种组蛋白去乙酰化抑制剂,用TSA处理鼠核移植胚胎可显著提高胚胎的囊胚率。检验TSA对猪卵母细胞体外成熟以及孤雌胚胎发育的影响。在猪卵母细胞体外成熟液及胚胎培养液中添加TSA,比较不同浓度TSA对卵母细胞成熟的影响,不同浓度TSA对孤雌胚胎发育能力的影响以及TSA处理不同时间对孤雌胚胎发育能力的影响。结果发现：（1）5nmol／LTSA处理对卵母细胞体外核成熟无显著影响,却显著提高了卵母细胞孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率（P〈0．05）;（2）50nmol／LTSA处理显著提高了孤雌胚胎的卵裂率及囊胚率（P〈0．05）;（3）50nmol／LTSA处理24h能显著提高胚胎的卵裂率及囊胚率（P〈0．05,82．1％±2．6％和37．4％±3．1％）。结果表明TSA对猪卵母细胞的体外成熟及孤雌胚胎发育具有显著的促进作用。5nmol／L的添加量对卵母细胞的体外胞质成熟具有促进作用;胚胎培养基中添加50nmol／LTSA处理24h能提高孤雌胚胎的发育能力。     

水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育比较

对MII期水牛卵母细胞进行人工诱导激活可以帮助人们间接判断体外成熟卵母细胞质量的优劣。并且，卵母细胞的充分激活也是提高核移植效率的关键因素之一。试验比较了水牛卵母细胞体外成熟时间对孤雌激活胚发育能力的影响以及不同化学激活方法对水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响，并在相同条件下，对孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力进行了比较。结果表明，水牛卵母细胞体外成熟27小时或30小时的囊胚发育率（19．0％或17．7％）明显高于体外成熟21小时或24小时的囊胚发育率（12．3％或13．8％）；Ion联合6-DMAP激活水牛卵母细胞的效果优于其他几组激活方法；在相同条件下，孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力存在着差异，其中卵裂率差异不显著，但孤雌激活胚的囊胚发育率显著高于体外受精胚（13．0％vs21．7％）。     

不同激活方法对小鼠卵母细胞孤雌发育及二倍体形成的影响

卵母细胞的孤雌激活是研究哺乳动物受精机制和发育机理的有效方法,也是细胞核移植、显微注射受精技术、孤雌胚胎干细胞等研究内容中的重要环节。本试验分别用乙醇、SrCl2、钙离子载体A23187对小鼠卵母细胞进行单独孤雌激活,并分别与6-DMAP联合运用,对小鼠卵母细胞进行联合孤雌激活。结果显示：（1）不同激活剂单独或联合激活,对卵母细胞的激活率有显著影响（P〈0.05）,SrCl2组的激活率最高（92%～94%）;（2）相同激活剂对卵母细胞孤雌囊胚的发育率在单独激活组（SrCl2组,18%）和联合激活组（SrCl2＋6-DMA组,53%）中存在显著差异（P〈0.05）;（3）相同激活剂对卵母细胞二倍体率在单独激活组（钙离子载体A23187组,21%）和联合激活组（钙离子载体A23187＋6-DMA组,77%）中均存在显著差异（P〈0.05）。结果表明：（1）SrCl2可以对小鼠卵母细胞进行有效的孤雌激活;（2）联合激活法可以显著提高孤雌卵母细胞的囊胚发育率;3、6-DMAP可以抑制第二极体排出,显著提高孤雌激活卵母细胞的二倍体率。     

猪卵丘包裹层数与猪卵母细胞质量的相关性研究

为探讨如何从大量的未成熟卵母细胞中挑选出合适的卵母细胞用于体外成熟培养,本研究根据猪卵丘-卵母细胞复合体(COCs)的颗粒细胞层数和胞质情况,把挑选的COCs分成A、B、C3个等级;体外成熟培养42 ～44 h后,所获得的成熟卵母细胞做孤雌激活,比较孤雌胚的发育能力.结果表明:A、B、C3级卵母细胞的成熟率之间没有差异(P＞0.05),但是A级卵母细胞与B级卵母细胞的孤雌胚胎的囊胚率显著高于C级卵母细胞(P＜0.05).说明卵丘细胞包裹层数不会影响卵母细胞的成熟率,但会影响其潜在的发育能力.     

不同浓度雌二醇对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎的影响

为了探讨雌二醇（17β-estrodiol,E2）对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活后胚胎早期发育的影响,在卵母细胞体外成熟培养基中添加不同浓度雌二醇,研究卵裂率和囊胚率的变化。以未添加雌二醇的基础液为对照组,比较分析各组卵母细胞核成熟效率、孤雌激活后胚胎的卵裂率、囊胚发育率。结果表明,成熟液中添加1μg／mL雌二醇（E2）对猪卵母细胞的体外成熟具有明显的促进作用,而添加100μg／mL雌二醇（E2）对猪卵母细胞体外成熟具有明显的抑制作用。     

亚胺环己酮对猪卵母细胞人工孤雌激活作用的研究

本文以体外成熟的猪卵母细胞为材料，以乙醇、电脉冲和氯化锶为人工刺激条件，研究了蛋白质合成抑制剂－亚胺环己酮（CHX）对猪卵母细胞的孤雌激活效果的影响。结果表明，乙醇、电脉冲和SrCl2均可使猪母细胞激活，而电脉冲的活效果最好。当分别与CHX联合使用时，激活率显著高于单独的乙醇、电脉冲或SrCl2刺激。说明，CHX与乙醇、电脉冲及SrCl2联合使用对猪IVM卵母细胞激活具有显著的协同促进作用。     

人颗粒细胞共培养对牛卵母细胞体外成熟及孤雌激活的影响

为了探讨人颗粒细胞共培养对牛卵母细胞体外成熟及孤雌激活的影响,将穿刺获得的牛卵母细胞随机分为试验组和对照组,试验组以人颗粒细胞作为滋养层与牛卵母细胞在体外成熟液中共培养,对照组仅使用与试验组相同的体外成熟液培养,观察并比较两组的极体排出率、孤雌激活囊胚形成率。结果发现,试验组的极体排出率（72.35％）显著高于对照组的极体排出率（52.86％）（P＜0.01）;经过孤雌激活后,试验组的囊胚形成率为12.82％,对照组为4.76％,两组之间无显著性差异（P＞0.05）。说明人颗粒细胞可以作为牛卵母细胞体外成熟时的滋养层,两者共培养可以提高牛卵母细胞体外培养的核成熟率。     

山羊卵母细胞体外培养体系及冻存后体外培养的研究

随着哺乳动物胚胎工程技术的深入研究和商业化胚胎移植技术的快速发展,对卵母细胞的需求量急剧增加。而冷冻的卵母细胞可为胚胎工程技术研究提供方便、丰富的材料来源。试验以屠宰场云岭黑山羊卵巢卵母细胞为实验材料,研究冷冻后的山羊卵母细胞体外培养体系。结果表明,采用传统成熟培养液（OM＋10%FBS）与在其中添加1%ITS（OM＋10%FBS＋1%ITS）对卵母细胞培养成熟率无显著差异（71.6%vs 76.2%）,而孤雌激活的卵裂率差异显著（60.5%vs 71.5%）。用优化的卵母细胞成熟体系培养解冻后的GV期COCs,成熟率31.5%;用添加有ITS和EGF的胚胎培养液培养解冻后GV和MII期孤雌激活的卵母细胞,其卵裂率分别为35.6%、58.4%,差异极显著（P〈0.01）。     

生长激素对体外培养猪COCs影响的研究

研究了生长激素对猪COCs体外成熟过程中卵丘细胞扩展、卵丘细胞凋亡、卵母成熟及孤雌激活后卵裂的影响。结果表明:生长激素(STH)能够促进卵丘细胞扩展,抑制卵丘细胞凋亡,对卵母细胞的成熟和激活后卵裂呈现双重效应。在猪COCs培养液中添加0.15μg/mL STH成熟率(73.83%±1.80%)和卵裂率(64.76%±2.84%)显著高于对照组(mNCSU-23+PMSG(10IU/mL)+hCG(10 IU/mL))及添加0.01、0.05、0.1、2μg/mL STH组(P<0.05),在本实验中为猪卵母细胞体外成熟的最佳条件。     

谷氨酰胺和IGF-I对晋岚绒山羊卵母细胞体外成熟的影响

为了探讨在成熟培养液中添加谷氨酰胺和IGF-I对晋岚绒山羊母羔卵母细胞体外成熟的影响。随机选择12只6-8周龄晋岚绒山羊母羔为试验动物,用FSH进行超数排卵,活体采集卵母细胞,并对未成熟的卵母细胞进行体外成熟培养。在培养液中添加0、50、100和150μg/mL的谷氨酰胺及0、25、50和100 ng/mL的IGF-I。结果表明：培养液中谷氨酰胺添加量为100μg/mL时,能显著提高卵母细胞成熟率（P〈0.05）;在培养液中添加100μg/mL谷氨酰胺的基础上,再添加50 ng/mL的IGF-I可以进一步显著提高卵母细胞的成熟率（P〈0.01）。     

胰岛素和白血病抑制因子对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎的影响

为探讨胰岛素(Insulin)和白血病抑制因子(Leukemia inhibit factor,LIF)对猪卵母细胞体外成熟(IVM)和猪孤雌激活胚胎(PAEs)的影响,在卵母细胞体外成熟或者胚胎培养基中添加Insulin和LIF,研究卵裂率和囊胚率的变化。结果:添加了5μg/mL Insulin后猪卵母细胞体外成熟效果显著提高,但成熟后孤雌激活发育能力与非添加组相近;而胚胎培养基中添加Insulin对孤雌胚的卵裂和囊胚的形成也没有明显促进作用;添加1 000 U/mL的LIF后,卵母细胞核成熟率没有明显提高,反而孤雌激活后囊胚率急剧下降,但对卵裂率以及囊胚总细胞数影响不大;在胚胎培养基中添加LIF后,孤雌胚的卵裂和囊胚形成并没有明显的提高。表明:Insulin对卵母细胞体外成熟有益,但是对孤雌胚胎的最佳处理程序还需要摸索;本文所采用的LIF处理对猪卵体外成熟以及孤雌胚胎体外发育没有帮助,还需要进一步研究其他浓度和处理程序对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎发育能力的影响。     

Inhibition of mitogen activated protein kinase activity induces parthenogenetic activation and increases cyclin B accumulation during porcine oocyte maturation

The inhibition of mitogen activated protein kinase (MAPK) activation during porcine oocyte maturation leads to decreased maturation promoting factor (MPF) activity and to the induction of parthenogenetic activation. In the present study, in order to analyze the mechanism underlying the suppression of MPF activity in MAPK-inhibited porcine oocytes, we injected mRNA of SASA-MEK, a dominant negative MAPK kinase, or antisense RNA of c-mos, a MAPK kinase kinase, into immature porcine oocyte cytoplasm. The injection of SASA-MEK mRNA or c-mos antisense RNA inhibited the MAPK activity partially or completely, respectively, decreased the MPF activity slightly or significantly, respectively, and induced parthenogenetic activation in 17.1% or 96.6% of mature oocytes, respectively, although no parthenogenetic activation was observed in the control oocytes. Immunoblotting experiments revealed that cyclin B accumulation in these MAPK-suppressed porcine oocytes was increased significantly after 50 h of culture and that a considerable amount of MPF was converted into inactive pre-MPF by hyperphosphorylation. These results indicate that the inhibition of MAPK activity in porcine oocytes did not promote cyclin B degradation but rather suppressed it; also the decrease in MPF activity in MAPK-suppressed porcine oocytes correlated with the conversion of active MPF into inactive pre-MPF.     

Effect of Human Menopausal Gonadotropin,17β-estradiol and Epidermal Growth Factor on the Quality of in vitro Maturation Bovine Oocytes

For optimizing in vitro maturation system of bovine oocytes,we firstly examined the influence of four different hormonal regimes(FSH+LH,HMG,FSH+LH+E₂ and HMG+E₂) on oocyte maturation rates.Then we studied the effects of epidermal growth factor (EGF) in the above defined medium on bovine oocyte maturation,in vitro development and quality of parthenogenetic embryos.The cell apoptotic index of parthenogenetic blastocysts was detected by TUNEL.No significant difference was observed in maturation rates in four groups supplemented with different hormones.However,human menopausal gonadotropin (HMG) provided steady maturation results in replicates.Maturation of oocytes was promoted by supplementation with 17β-estradiol (E₂).Combination of HMG and E₂ gave rise to steady and efficient mature results.The presence of EGF at 30 ng/mL concentration significantly increased maturation rate and blastocyst rate and reduced apoptotic cells in parthenogenetic blastocysts.Therefore,the optimal oocyte maturation solution could be supplemented with 0.075 IU/mL HMG,1 μg/mL E₂ and 30 ng/mL EGF.     

人尿促性腺激素、雌二醇及表皮生长因子对牛卵母细胞体外成熟质量的影响

试验旨在研究不同激素配比及表皮生长因子(EGF)浓度对牛卵母细胞体外成熟及卵母细胞质量的影响。将随机分组的卵丘-卵母细胞复合体于添加FSH+LH、HMG、FSH+LH+E₂、HMG+E₂ 4种不同激素组合配比的成熟基础液中培养,对比其体外成熟率,比较了EGF对牛卵母细胞体外成熟率和孤雌胚胎体外发育的影响,并采用TUNEL法检测添加不同浓度EGF的牛孤雌激活囊胚细胞凋亡情况。结果表明,添加HMG的成熟试验结果稳定,E₂对牛卵母细胞成熟有一定的促进作用,HMG+E₂联合使用可以得到高效稳定的成熟结果;在此基础上,在成熟液中添加30 ng/mL EGF对牛卵母细胞的成熟质量、胚胎发育及降低胚胎细胞凋亡都有明显的促进作用。因此,在体外成熟培养液中添加0.075 IU/mL HMG、1 μg/mL E₂和30 ng/mL EGF对牛卵母细胞的成熟和质量较为有益。     

显微注射Ca^2＋激活小鼠M Ⅱ期卵母细胞

胞质内显微注入Ｃａ＾２＋可以激活小鼠Ｍ Ⅱ期卵母细胞，且随着卵龄的增加，激活率明显升高。卵龄小于１６ｈ（ｈＣＧ注射后）注射Ｃａ＾２＋引起的激活率很低，卵龄超过１８ｈ，激活率达到５０％以上。卵龄小于１６ｈ的卵母细胞，卵内注入超纯水未能激活卵母细胞，而在１８￣１９ｈ卵龄组，注射水的对照组激活率为３５％，但显著或极显著地低于注射Ｃａ＾２＋的试验组。激活前注射ＥＤＴＡ卵母细胞的激活率约为３０％，激活后注射     

Recruit of porcine oocytes excluded from nuclear transfer program for the production of embryos following parthenogenetic activation

To evaluate whether oocytes excluded from somatic cell nuclear transfer (SCNT) could be utilized for embryo production by parthenogenetic activation (PA), porcine oocytes with poor morphology after maturation culture were excluded from SCNT and subsequently used for PA with different stimuli. In the first set of experiment, either electric pulse of different strengths (1.75, 2.0 or 2.25 kV/cm for 30 microsec each) or chemicals with different treatment durations [7% ethanol for 5 min followed by exposure to 6-dimethylaminopurine (6-DMAP) for 0, 2, 3 or 4 hr] was employed. Development to the 8-cell and morula stages was significantly (P<0.05) improved by electric stimulation of 2.0 kV/cm, while blastocyst formation was enhanced by chemical treatment of ethanol and 6-DMAP for 4 hr. Subsequently, oocytes were parthenogenetically activated by one of four stimuli; 1) optimal electric (2.0 kV/cm for 30 microsec), 2) optimal chemical (ethanol followed by 6-DMAP for 4 hr), 3) electric then chemical and 4) vice versa. On the other hand, oocytes with normal morphology were subjected to the same experimental treatments for the control. Regardless of oocyte type, a combination of electric and chemical stimulations did not further stimulate preimplantation development, compared with electric activation only. However, combinational treatment greatly increased the cell number of blastocysts in SCNT-excluded oocytes (21.9 to 22.9 vs. 16.9 cells/blastocyst), while such effect was not found in normal oocytes (22.2 to 23.3 cells/blastocyst). In conclusion, porcine oocytes excluded from SCNT still have a potential to develop blastocysts after PA and this might contribute to increasing the efficiency of SCNT for various purposes. A combined activation by electricity and chemical yielded the best rate of preimplantation development with increasing the quality of blastocyst.