PRRSV浙江分离株Nsp2基因序列分析

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)临床上主要表现为流产、早产、死胎、仔猪成活率下降和育成猪呼吸系统病变等.本研究用RT-PCR对2008年-2009年采集于浙江省部分发病猪场的41株疑似猪繁殖与呼吸综合征病猪的脾、肺、淋巴结混合组织样本进行PRRSV病毒检测和Nsp2基因序列分析.结果显示,41株PRRSV流行毒株中20份...     

PRRSV分离株Nsp2基因和ORF5基因的遗传变异分析

为了解山东省PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学背景,对2007～2009年分离到的14株山东省内的PRRSV流行毒株进行了Nsp2和ORF5基因序列的测定和分析.结果显示,与参考毒株JXA1相比,14株PRRSV Nsp2与ORF5基因的核苷酸同源性分别达到96.1%～99.8%和98.0%～99.8%,氨...     

PRRSV分离株Nsp2基因和ORF5基因的遗传变异分析

为了解山东省PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学背景,对2007~2009年分离到的14株山东省内的PRRSV流行毒株进行了Nsp2和ORF5基因序列的测定和分析。结果显示,与参考毒株JXA1相比,14株PRRSV Nsp2与ORF5基因的核苷酸同源性分别达到96.1%~99.8%和98.0%~99.8%,氨基酸序列同源性分别达到92.9%~100%和97.5%~99.5%。序列分析结果表明,14株毒株在Nsp2蛋白内部均存在编码30个氨基酸的碱基对的不连续缺失;ORF5基因编码的GP5蛋白不存在缺失,但存在点突变。遗传进化分析表明,07年分离毒株JQ与参考毒株JXA1亲缘关系很近;09年分离的12株PRRSV,2株仍与国内2006~2007年间的分离株在同一分支,9株已经处在不同分支,1株单独处在一个分支。2007~2009年山东地区流行的PRRSV分离株具有年度特征,无明显的地域特征。     

PRRSV山西株ORF5和Nsp2基因序列分析

采用RT-PCR方法对2009-2011年山西省分离的5株猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的ORF5和Nsp2(2 503³ 269nt)基因进行克隆和测序,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性分析。序列分析结果显示,5株分离株Nsp2基因与国内分离的PRRSV变异株(JXA1、HuN、HUN4、HUB1)的序列同源性最高,为96.8%3 269nt)基因进行克隆和测序,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性分析。序列分析结果显示,5株分离株Nsp2基因与国内分离的PRRSV变异株(JXA1、HuN、HUN4、HUB1)的序列同源性最高,为96.8%⁹8.2%,且缺失位置一致,均存在2个位点30个氨基酸缺失;ORF5基因大小为603bp,编码200个氨基酸,第13、151位均为具有强毒特性的精氨酸(R),137位为丝氨酸(S),表明这5株均为野毒株,与国内分离的PRRSV变异株(JXA1、HuN、HUN4、HUB1)毒株的序列同源性最高,为96.5%98.2%,且缺失位置一致,均存在2个位点30个氨基酸缺失;ORF5基因大小为603bp,编码200个氨基酸,第13、151位均为具有强毒特性的精氨酸(R),137位为丝氨酸(S),表明这5株均为野毒株,与国内分离的PRRSV变异株(JXA1、HuN、HUN4、HUB1)毒株的序列同源性最高,为96.5%⁹8.0%。结果表明,山西省内目前流行的PRRSV为Nsp2缺失30个氨基酸的变异毒株。     

PRRSV山西株ORF5和Nsp2基因序列分析

采用RT-PCR方法对2009—2011年山西省分离的5株猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的ORF5和Nsp2（2503～3269nt）基因进行克隆和测序,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性分析。序列分析结果显示,5株分离株Nsp2基因与国内分离的PRRSV变异株（JXA1、HuN、HUN4、HUB1）的序列同源性最高,为96．8％～98．2％,且缺失位置一致,均存在2个位点30个氨基酸缺失;ORF5基因大小为603bp,编码200个氨基酸,第13、151位均为具有强毒特性的精氨酸（R）,137位为丝氨酸（S）,表明这5株均为野毒株,与国内分离的PRRSV变异株（JXA1、HuN、HUN4、HUB1）毒株的序列同源性最高,为96．5％～98．0％。结果表明,山西省内目前流行的PRRSV为Nsp2缺失30个氨基酸的变异毒株。     

两株高致病性PRRSV湖北分离株ORF5与Nsp2基因序列分析

2013年从湖北两个发病猪场采集疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,接种Marc-145细胞,可致明显细胞病变,各分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HBHS株和HBXN株)。采用RTPCR方法,对ORF5基因序列和Nsp2基因部分序列进行扩增并测序,并用DNA MAN软件将测序结果与国内外发表的13株参考毒株进行比对分析。结果显示,2株分离株Nsp2基因与国内高致病性JXA1、GD2007、GD2008毒株的氨基酸同源性很高,介于98.5%~99.5%;且该基因与国内其他变异株有完全一致的缺失特征;ORF5基因与国内高致病性毒株的氨基酸同源性为98.1%~99.5%,且系统进化树遗传距离很近,同处一个基因群中,而与CH-1a等经典毒株较远。这两株分离株均属于PRRSV美洲型变异株,此结论为该病的防治及疫苗的设计奠定了基础。     

PRRSV上海浦东南汇分离株Nsp2与ORF5基因遗传演化分析

对上海浦东南汇地区某规模猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)疑似病料进行处理,提取病毒总RNA,采用RT-PCR方法扩增Nsp2/ORF5基因,并进行基因测序。序列分析结果表明,浦东南汇分离株Nsp2蛋白均缺失481位和第533~561位30个不连续的氨基酸,同时在Nsp2编码区出现与高致病性PRRSV(HP-PRRSV)代表株JXA1相同的遗传变异现象。同源性分析表明,6株Nsp2、ORF5氨基酸序列与VR-2332、CH-1a、HB-2以及JXA1株的同源性分别为:40.3%~55.3%,73.5%~89.5%;54.7%~75.1%,75.5%~92.5%;50.9%~67.3%,73.5%~90.5%;72.8%~91.5%,81.5%~98.5%;而与欧洲型代表株LV株的同源性分别仅为26.2%~35.9%和44.8%~56.4%。遗传演化分析表明,浦东南汇分离株与国内株(CH-1a、HB-2)和VR-2332美洲代表株各自处于相对独立的分支,遗传关系较远且不存在交叉现象,而与JXA1变异株处于同一进化分支。研究表明,浦东南汇分离株为美洲型HP-PRRSV毒株,具有一定的地理衍变特性,已从PRRSV遗传进化树中分离,出现一个新的遗传独立群体。     

广西高致病性 PRRSV Nsp2基因的克隆、序列分析和抗原表位预测

根据猪繁殖与吸吸综合征病毒(PRRSV)VR2332 Nsp2基因序列合成特异性引物,对广西分离的高致病性PRRSV进行RT-PCR扩增,将扩增出的796 bp片段插入pMD18-T载体中进行序列测定和分析,并用DNA Star软件对Nsp2基因推导的氨基酸序列进行了表位分析。结果显示,广西3个县、市的PRRSV分离株Nsp2基因第483位和第532位~第560位氨基酸发生缺失,核苷酸序列之间的同源性为97.0%~97.4%,推导编码的氨基酸序列之间的同源性为93.6%~94.7%;与PRRSV VR2332株、MLV株和CH-1a株核苷酸之间的同源性分别为79.0%~79.2%、78.8%~78.9%和88.2%~89.3%;氨基酸之间的同源性分别为59.4%~60.2%、59.4%~60.2%和70.9%~81.6%,表明广西3个县、市的PRRSV分离株Nsp2基因与VR2332株、MLV株和CH-1a株比较变异较大。表位分析表明,由于博白株的Nsp2基因的第532位~560位氨基酸的缺失,与VR2332株比较,其亲水性、抗原指数均发生了大的变化。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株Nsp2基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR方法,从吉林省部分地区猪场的病料中扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的Nsp2基因并测序.应用DNAStar 7.0、ClustaⅨ 1.83、MEGA 4.0软件对测序结果进行分析,并与NCBI上已登录的PRRSV代表毒株的Nsp2基因进行序列比对,结果显示,得到的Nsp2基因与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为62.0%～87.5%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为97.8%～98.9%;氨基酸序列比对结果显示与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为34.4%～59.0%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为95.1%～98.4%.因此,引起吉林省部分地区猪场发生猪繁殖与呼吸综合征的PRRSV与国内流行的高致病性PRRSV毒株亲缘关系较近.     

高致病性PRRSV河北地方株的分离鉴定及部分Nsp2基因变异分析

从唐山某猪场患高热病病料中分离到1株病毒,该病毒能在Marc-145细胞上增殖,产生细胞病变。经RT-PCR鉴定证明,该病毒为美洲型PRRSV,将其命名为TS02。应用设计的特异性引物扩增TS02株的Nsp2基因,并与国内外PRRSV分离株的Nsp2基因序列进行了比较。结果表明,TS02株Nsp2基因推导的氨基酸序列出现30个不连续的缺失,与PRRSV高致病性毒株JXA1、GD、WUH1、Jiangxi-3的核苷酸序列同源性分别为97.7%、97.7%、96.5%和97.1%。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株的鉴定及部分Nsp2基因序列分析

本研究采集山西省不同地区的发病猪脏器组织与血液样品,采用特异性 RT-PCR方法检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)样品16份,应用设计的特异性引物扩增出Nsp2基因序列,利用DNAStar生物信息学分析软件,对获得的序列与国外代表毒株VR-2332、国内代表毒株CH-1a、BJ-4、HB-1及PRRSV变异毒株HuN4和JXA1的序列进行了比较,绘制系统发生树。氨基酸序列比较分析发现山西省流行毒株同源性分别在69.8%~71.7%、85.3%~87.9%、68.7%~70.6%、91.7%~94.3%、94.3%~98.5%、95.1%~98.9%。所获得的16株病毒之间的同源性在90.9%~100%之间。研究结果发现所获得的序列同源性与国内近几年流行的PRRSV的变异毒株HuN4和JXA1毒株的序列同源性最高,分别在94.3%~98.5%与95.1%~98.9%之间,Nsp2 基因缺失位置一致,其Nsp2均有2个部位出现了缺失,即Nsp2基因分别为编码1个氨基酸的3个核苷酸的缺失和编码29个氨基酸的连续87个核苷酸的缺失,结果表明,山西省目前流行PRRSV的变异毒株与国内流行株属于同一分支。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒 Nsp10基因的克隆及序列分析

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒 BJ-4序列,选择Nsp10基因保守区域设计并合成特异性引物,用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州地方株(命名为JL株)Nsp10基因片段,克隆到pMD18-T载体并测序,应用DNASTAR、Clustal_1.81和Mega序列分析软件进行同源性比较.结果表明:贵州JL株Nsp10基因的cDNA长699 bp,可编码233 个氨基酸;贵州JL株Nsp10基因与早期分离毒株MLV株、BJ-4株、VR-2332株、CH-1a株、CH2002株和GS2004株相应序列的核苷酸同源性为 91.7%～94.0%,氨基酸同源性为97.4%～98.7%;而与最近分离毒株HN2007株、SX2007株、GD2007株、YN2008株、GS2008株、XL2008株、TJ株和JXA1株的核苷酸同源性为 98.3%～98.6%,氨基酸同源性为 99.6%～100%.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒JX0708株的分离鉴定及其Nsp2 基因的遗传变异分析

采集江西省某猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,RT-PCR检测可扩增出PRRSV ORF7特异性片段,序列分析发现其与美洲型毒株序列一致性达93.9%以上,与欧洲型毒株仅为69.8%。将采集的脑和肺脏处理后接种Marc-145细胞盲传,在盲传的细胞中可扩增到PRRSV ORF7特异性片段,传至第6代时出现明显的细胞病变;将该毒株NSP2非结构蛋白基〖JP2〗因测序分析,发现其编码的氨基酸与国内近年来分离的高致病性PRRSV毒株有较高的同源性,与美洲型代表株VR-2332相比缺失第482位和533-561位共30个氨基酸;纯化病毒并进行电镜观察,可见典型的PRRSV病毒粒子。第8代的细胞毒回归30日龄仔猪,可观察到猪繁殖与呼吸综合征典型症状和病理变化。这表明已成功地分离到1株美洲型PRRSV变异株,命名为JX0708株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒JX0708株的分离鉴定及其Nsp2基因的遗传变异分析

采集江西省某猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,RT-PCR检测可扩增出PRRSV ORF7特异性片段,序列分析发现其与美洲型毒株序列一致性达93.9%以上,与欧洲型毒株仅为69.8%。将采集的脑和肺脏处理后接种Marc-145细胞盲传,在盲传的细胞中可扩增到PRRSV ORF7特异性片段,传至第6代时出现明显的细胞病变;将该毒株NSP2非结构蛋白基因测序分析,发现其编码的氨基酸与国内近年来分离的高致病性PRRSV毒株有较高的同源性,与美洲型代表株VR-2332相比缺失第482位和533-561位共30个氨基酸;纯化病毒并进行电镜观察,可见典型的PRRSV病毒粒子。第8代的细胞毒回归30日龄仔猪,可观察到猪繁殖与呼吸综合征典型症状和病理变化。这表明已成功地分离到1株美洲型PRRSV变异株,命名为JX0708株。     

PRRSV流行株Nsp2、ORF5和ORF3基因序列的分析

采用RT-PCR方法扩增2006年--2007年从江西、湖南、海南、广东等4省的不同猪场病猪体内分离的11株猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行株的Nsp2、ORF5和ORF3基因,并进行序列分析。结果表明,11个PRRSV流行株的Nsp2均发生30个氨基酸的不连续缺失,缺失位置与JXA1毒株相同;11个PRRSV流行株的ORF5、ORF3基因和JXA1相应序列的核苷酸同源性分别为99．2％～99．8％、99．1％～99．6％,氨基酸同源性分别为98．0％～99．5％、98．4％～99．6％;11个PRRSV流行株之间ORF5基因的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为98．8％～100．0oA、98．0oA～100．0％,其中5个流行株的ORF3基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为99．0％～99．6％、98．8％～99．69,6。根据Nsp2所建立的遗传系统发育树可知这11个PRRSV流行株与JXA1株的亲缘关系很近。     

一株Nsp2蛋白自然缺失123个氨基酸的PRRSV分离和鉴定

通过RT-PCR方法检测到一份猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性肺组织病料。将该病料研磨、过滤后感染Marc-145细胞,连续传代都能产生明显的细胞病变。为鉴定细胞病变是否由PRRSV引起,抽提细胞总RNA,通过RT-PCR的方法成功的检测到了PRRSV基因。同时用间接免疫荧光方法证实了感染的细胞内有PRRSV N蛋白的表达。将成功分离的毒株命名为GXYL1403株。对分离株的ORF5基因和Nsp2高变区进行扩增、克隆和遗传进化分析,结果发现该毒株Nsp2高变区与NCBI登录的参考序列VR-2332氨基酸同源性为68.6%,JXA1的同源性为90.8%。通过ORF5遗传进化分析该分毒株为北美型PRRSV,且与高致病性PRRSV分布在同一个小分支上。Nsp2序列对比显示该分离株Nsp2蛋白含有高致病性PRRSV特异的1+29个氨基酸的缺失。特别的是,在缺失29个氨基酸区域的上游,含有连续20个氨基酸缺失,在下游更出现了连续73个氨基酸的缺失。该PRRSV毒株的分离和Nsp2蛋白部分序列的缺失鉴定,为下一步研究Nsp2部分氨基酸缺失对病毒生物学特性影响奠定了基础。