水稻叶片cDNA-AFLP选择性扩增反应体系的优化

在水稻Oryza sativa叶片响应稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis取食后的cDNA-AFLP试验中,对25μL体系中预扩增和选择性扩增的引物浓度、dNTP浓度、镁离子浓度及Taq DNA聚合酶用量4种反应条件影响因子进行不同梯度的优化研究.结果表明.PCR选择性扩增反应时,总反应液25μL体系中引物浓度为0.2μmol/L、dNTP浓度为0.2mmol/L、镁离子浓度为2.0mmol/L、Taq DNA聚合酶用量为13.336n kat/25μL时,可得到更多鲜明可辩的TDFs.     

白桦cDNA-AFLP体系的优化和建立

为了建立适合白桦的cDNA-AFLP体系,对反应体系中的酶切、预扩增、选择性扩增的引物筛选等几个重要的影响因素进行优化,得到了适合白桦的cDNA-AFLP反应体系。选择白桦雄花为研究材料,用改良的CTAB法提取总RNA,采用低频酶EcoRⅠ和高频酶MseⅠ酶切双链cDNA。通过研究发现,预扩增中Mg2+浓度为2mmol/L,引物浓度为0.3μmol/L,dNTP浓度为0.25mmol/L,Taq酶浓度为1U,退火温度控制在60℃时,预扩增结果较好。另外,从16对引物组合中选出11对选择性较好的引物组合,扩增的产物经过6%的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳和银染检测,得到清晰、分辨率高、信号强度明显且重复性好的结果,表明该cDNA-AFLP分析体系适用于白桦相关的功能基因的研究。     

枣cDNA-AFLP技术体系建立与优化

建立了枣(Ziziphus jujuba Mill.)cDNA-AFLP分析的优化体系和反应程序。提取获得的总RNA以人工合成的Oligo(dT)18为引物,利用鼠源反转录酶(M-MLV RT)合成cDNA第1链,合成双链cDNA后用限制性内切酶EcoRⅠ(识别6个碱基位点)与MseⅠ(识别4个碱基位点)酶切,酶切连接后,使用与接头序列互补的预扩引物对cDNA片段池进行PCR扩增,扩增后的cDNA池定量至1 ng/μL,作为选择性扩增的模板,优化得到的选扩反应体系为:20μL的反应体系中含5μL模板,2μL 10×PCR buffer,2μL MgCl2(25 mmol/L),EcoRⅠ特异性引物(50 ng/μL)1μL,MseⅠ特异性引物(50 ng/μL)1μL,10 mmol/L dNTP0.4μL,5 UTaqDNAPolymer-ase 0.12μL。选扩程序:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,65℃退火30 s(每个循环降0.7℃),72℃延伸1 min,13个循环;94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,31个循环;72℃7 min。     

菜心cDNA-AFLP分析体系的优化与建立

以菜心的顶端分生组织为试材,对影响菜心cDNA-AFLP体系的关键因子进行了探讨,以期建立适于菜心转录组差异表达的cDNA-AFLP分析体系。结果表明:Trizol法适用于菜心总RNA提取;SMART双链cDNA合成法效率较高,其中第二链cDNA合成的最佳循环数为24个;Taq I/Ase I分步各酶切3 h可使双链cDNA酶切完全;预扩增体系以模板稀释20倍,27个循环扩增效果较好,退火温度对扩增结果影响不大,但Mg2+对PCR扩增影响较大,经比较加入2.5μL Mg2+(25 mmoL/L)的预扩及选扩电泳的效果均最佳;预扩产物稀释20倍用于选择性扩增,其PAGE电泳可以获得丰富且重复性好的带型。cDNA-AFLP分析体系的优化与建立为菜心抽薹开花分子机理进一步研究奠定了基础。     

番鸭cDNA-AFLP体系的建立

以番鸭脑垂体为材料,用Trizol法提取总RNA,用Superscipt Ⅱ-RT合成第一链cDNA,RNase H和DNA Polymerase合成第二链cDNA,最后用EcoR Ⅰ/Mse Ⅰ分步酶切cDNA各2h,经T4连接酶合成双链cDNA,预扩增反应后产物稀释40倍进行选择性扩增反应.经1％琼脂糖电泳及6％变...     

马褂木ISSR-PCR扩增体系的优化

【目的】建立稳定的马褂木ISSR-PCR扩增体系,为马褂木种群ISSR多样性分析提供技术支持。【方法】采用单因素试验对ISSR-PCR扩增体系中的MgCl2、dNTPs、引物浓度、TaqDNA聚合酶、DNA模板用量和退火温度等主要因素进行筛选优化。【结果】采用试剂盒方法提取马褂木叶片DNA的效果优于改良CTAB法,最优PCR反应体系为：总体积20.0μL中含有10×Buffer2.0μL、MgCl21.8mmol/L、dNTPs0.2mmol/L、引物0.5μmol/L、TaqDNA聚合酶1.00U、DNA模板60ng、退火温度59.1℃。【结论】优化后的马褂木ISSR-PCR扩增体系能够扩增获得清晰、稳定的条带,可满足马褂木种群ISSR多样性分析的要求。     

枣选择性扩增微卫星体系的建立及优化

【目的】建立和优化枣的选择性扩增微卫星（SAM）技术体系,丰富枣群体遗传学研究的方法,同时为枣利用SAM法开发SSR引物提供技术参考和模板。【方法】以冬枣、大荔龙枣和金丝小枣为试材,采用CTAB法提取样品DNA,对SAM试验过程中的酶切-连接、抑制性扩增、预扩增、选择性扩增等关键因子进行研究。【结果】利用PstⅠ和MseⅠ双酶切系统,分步法进行酶切-连接是后续试验成功的关键,抑制性扩增（20.0μL体系）模板取酶切连接液2.0μL,预扩增和选择性扩增（20.0μL体系）的模板分别取上步扩增的稀释产物各2.0μL;抑制性扩增和预扩增反应中,ExTaq取0.5 U,反应25个循环,产物稀释20倍进行下一步扩增;选择性扩增采用前6个循环中退火温度梯度降低（每循环降低1℃）的反应程序,体系中可将ExTaq用量增加到1.0 U以保证酶的保真效果。【结论】试验利用优化后的反应体系,选用16个MseⅠadapter+NN primer和SSR primer（PCT6）组成引物对进行筛选,获得了谱带清晰、分辨率高、多态性丰富的电泳图谱。该研究结果为利用SAM技术开展枣的亲缘演化、遗传多样性分析及SSR引物开发等方面的研究打下了基础。     

薏苡ISSR-PCR扩增体系的优化

采用改进的SDS法提取薏苡种子胚基因组DNA,测试薏苡ISSR扩增的最适退火温度,并采用单因素试验,测试Mg2 、dNTP、BSA、引物浓度及模板DNA、TaqDNA聚合酶用量等6个因素对ISSR-PCR扩增结果的影响。结果显示,10μl PCR反应体积中包括:1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl pH值9.0,50 mmol/LKCl,0.1%Triton X-100),1.75 mmol/L Mg2 ,0.6 mmol/L dNTP,1 mg/ml BSA,10 ng模板DNA,20 pmol引物,0.45 UTaq酶。     

一种适于cDNA-AFLP分析的茶树叶片总RNA提取方法

茶树富含多糖、多酚,从茶树组织中提取高质量的RNA较为困难,cDNA-AFLP技术对RNA质量要求较高,因而从茶树叶片中提取高质量的RNA是cDNA-AFLP试验正常进行的重要保障。该试验采用改进的CTAB法从茶树叶片中提取总RNA,结果表明:琼脂糖凝胶电泳显示28S、18S、5S 3条带清晰,完整性好,产率高;A260/A280值为2.07,范围为1.8~2.1,DNA和蛋白质污染较少;经逆转录、双链cDNA合成和cDNA-AFLP检测,证实提取的RNA能满足cDNA-AFLP技术对RNA质量和数量的要求。该方法为应用cDNA-AFLP技术顺利开展茶树分子生物学方面的研究奠定了基础,处理方式简单且成本较低。     

小麦春化相关特异性PCR扩增体系的建立

以小麦幼苗DNA为模板 ,采用小麦春化相关特性Verc2 0 3序列设计合成的春化特异引物 ,进行PCR扩增。通过对扩增体系中引物浓度、Taq酶浓度、Mg2 + 、退火温度以及扩增程序的选择优化 ,确定了PCR扩增的最佳条件 ,获得稳定而理想的扩增效果     

芥菜cDNA-AFLP反应体系的优化

选用红叶芥和青叶大头菜为试材,对cDNA-AFLP反应体系中的几个关键影响因素进行优化,建立了适合于芥菜的cDNA-AFLP反应体系.结果表明:在20 μL PCR反应体系中,预扩增产物稀释30倍,Mg2+浓度1.2mmol/L,dNTP浓度0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶加入0.8 U时,选扩的效果最佳.     

高粱四杂29号cDNA-AFLP试验体系的建立与优化

[目的]建立与优化cDNA-AFLP试验体系。[方法]以经典cDNA-AFLP方案为基础,以高粱种子为材料,对试验体系进行研究,并且加以改良。[结果]得到的cDNA-AFLP试验方案以蒸馏水代替去离子水、以普通国产试剂代替进口试剂、以国产试验设备代替进口设备,降低了试验成本,减小了试验难度。[结论]建立了一套简便、经济、快速、安全、适合国内普通试验使用的cDNA-AFLP试验方法,为高粱分子育种的研究奠定了基础。     

板栗花序与叶的cDNA-AFLP的差异表达分析

为给板栗的分子遗传育种工作提供重要的分子数据参考,作者通过cDNA-AFLP的方法,以同株板栗幼年花序和叶片为实验材料,在转录水平上进行差示分析。结果显示:64对引物组合共产生了2131条PCR产物,对其中的110条克隆测序,发现有28条基因与已知功能基因相关,其中包括参与植物转运﹑代谢﹑能量产生相关的蛋白,从而证明这些基因在板栗生长发育中的重要作用。     

利用cDNA-AFLP技术分离与小麦耐盐性相关的 cDNA片段及基因的可行性研究

利用cDNA-AFLP技术分析了耐盐性受主效基因控制的小麦品系98-160盐胁迫前后基因表达的变化。对112个克隆的cDNA片断进行了tBlastx分析，约有65.2%的基因与已知基因有较高的同源性，从中筛选出18个与小麦耐盐性密切相关的片段，主要包括转录因子、与离子转运有关的蛋白、信号传导相关蛋白、胁迫相关蛋白以及与蛋白-蛋白相互作用有关的蛋白。目前已得到部分序列的全长cDNA，RT-PCR结果表明一些基因与耐盐性密切相关。     

沙冬青cDNA-AFLP体系的建立及引物筛选

[目的]建立适合于沙冬青cDNA—AFLP的反应体系。[方法]以对照、3种逆境处理的沙冬青为材料,采用Trizol法和改良CTAB法提取总RNA。[结果]改良的CTAB法可抽提到较高质量的总RNA,适于沙冬青总RNA的提取。采用EcoRI/MseI酶切体系,64对选择性扩增引物中有35对适合沙冬青cDNA-AFLP分析。[结论]该研究为利用cDNA-AFLP标记对沙冬青抗逆基因进行深入研究奠定基础。     

小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的cDNA-AFLP分析

 【目的】分析经叶锈菌诱导小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的基因表达情况,寻找与抗病基因表达相关的片段。【方法】应用cDNA-AFLP技术从mRNA表达水平研究TcLr38和感病对照Thatcher与小麦叶锈菌05-22-65（THTS）互作时基因表达的差异。【结果】76对引物组合检测到约3 800条条带,平均每一对选择性引物可以获得50条条带,其中28对能够在小麦近等基因系TcLr38和感病对照Thatcher之间扩增出特异性条带。多态性条带划分为8种类型,其中3种类型可能与抗病基因相关。最终得到95条小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的特异性表达的转录衍生片段（TDF）,其中19条差异TDFs只在接种叶锈菌的TcLr38中出现,为上调表达,而8条差异TDFs为下调表达。对可能与抗病相关的特异TDFs中的21条片段进行序列测定与分析,经BLASTx比较,17个TDFs所推导的蛋白质序列在数据库中找到其所对应的同源序列,15个TDFs为已知功能的基因。【结论】通过对功能已知的基因分析,推测决定蛋白激酶C、ATP结合蛋白、类受体激酶、信号传导组氨酸激酶（HPK）、肽酶家族M23、Dnak抑制蛋白DksA、甲硫氨酸tRNA合成酶、RanGTP酶激活蛋白1、烯酰辅酶A水合酶的TDFs可能与抗病或防御过程相关。     

烟草cDNA-AFLP体系中选择性引物筛选

为确定cDNA-AFLP技术在烟草中的最适合的选择性碱基数目,本实验对低钾胁迫下的烟草根系进行了cDNA-AFLP分析,通过240对引物组合的筛选,共得到2100个转录衍生片段,并根据不同选择性碱基的组合对2100个片段进行了分析。结果表明,在扩增产物过多时,应将引物中选择性碱基的数量调整到3个较为合适。     

红叶芥叶色性状的cDNA-AFLP研究

利用cDNA-AFLP技术分析红叶芥叶片变红前后的基因表达差异, 共发现60条目标条带, 随机选取5 条差异片段进行了克隆测序. 结果发现其中TDFV1T2(149 bp)属于芥菜叶绿体基因片段, 另外4条序列分别与拟南芥中编码二酰基甘油激酶、半胱氨酸肽酶、肽基脯氨酰顺反异构酶亲环型家族蛋白、阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶等具有一定的同源性.