龙眼APETALA1(AP1)同源基因的克隆与序列分析

根据植物APETALA1(AP1)同源基因的高度保守性,设计合成一对特异引物,从龙眼基因组DNA中扩增出一条长400bp左右的基因片段,插入到pMD-T载体中。测序后分析表明,扩增得到了龙眼AP1同源基因片段。该片段序列包含两个内含子(长96bp和165bp),编码区编码36个氨基酸。与其它植物AP1同源基因的相应区域氨基酸序列具有较高的同源性,其中与花椰菜AP1基因同源性高达91%,与欧亚种葡萄、苹果、柑橘、枇杷的AP1基因同源性都在80%以上。     

苹果LEAFY同源基因的cDNA克隆与表达分析

 从苹果的果台枝顶芽中克隆了两个长约1.4 kb的cDNA片段，分别定名为AFL1和AFL2。它们的碱基序列在编码区有90%的同源性，但在3’末端非编码区仅有约印％的同源性。它们表达的肽链氨基酸序列与小叶杨、大豆、矮牵牛等有70％以上的同源性，与番茄、金鱼草、拟南芥有近70%的同源性，证明它们是LFY的同源基因。RT-PCR的结果表明，生长期AFL2在萼片、子房、根、茎、叶以及果台枝顶芽中都有表达，而AFL1只在果台枝顶芽中表达；在不同发育时期的果台枝顶芽中，AFL1在顶芽停止营养生长转向生殖生长以后才清晰表达，而AFL2在生长期6~10月都有表达。因此认为苹果中的这两个LFY同源基因虽有共同的起源，但是在功能上存在差异，在花和营养组织的发育中起不同的作用。DNA印迹分析表明，在苹果属及近缘的梨属植物中LFY同源基因是多拷贝的。     

君子兰转化酶基因片段(CMCW1)的克隆和序列分析

 分析植物酸性转化酶基因的保守区序列，设计一对PCR引物，以君子兰基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增出长约500 bp的DNA片段，克隆入pGEM-TEasy载体，测序结果表明获得君子兰酸性转化酶基因家族的一个成员CMCW1，该基因片段长518 bp，不含内含子，编码172个氨基酸。其序列已在GenBank中登记(登记号为AY151269)。在GenBank中进行同源性检索的结果表明，该成员编码的氨基酸与其它植物细胞壁酸性转化酶编码的氨基酸同源性较高。     

柑橘及其近缘属植物LFY同源基因的比较

LFY基因处于成花调控网络的关键位置,不仅调控开花时间和花转变,而且在花序和花的发育中也起重要作用。为了进一步探讨柑橘及其近缘属植物开花的分子机理,利用PCR技术分别从兴津温州蜜柑(Citrus unshiuMarcovitch)、无核椪柑(Citrus reticulata Blanco)、沙田柚[Citrus grandis(L.)Osbeck]、融安金柑(Fortunella crassifoliaSwing)和无核黄皮[Clausena lansium(Lour.)Skeels]叶片中分离克隆了LFY全长同源基因。结果表明兴津温州蜜柑、无核椪柑、沙田柚、融安金柑和无核黄皮中的LFY全长同源基因的核苷酸长度分别为2090、2086、2092、2081、2089bp,分别编码398、398、398、398和397个氨基酸,这些同源基因均由3个外显子和2个内含子组成。同源性分析发现,这些LFY全长同源基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性高,分别为92%～99%和95%～100%。亲缘关系分析结果与当前的植物学分类结果一致。     

柑桔MADS盒APETALA1同源DNA 片段克隆

 用PCR 扩增法, 从柑桔基因组分离出了AP 1 同源基因中的一个片段。序列分析表明, 它与其它植物的MADS 盒基因同源性较高, 氨基酸序列同源45%~73%, 但是否与发育有关, 还需做功能性检测。     

草莓LFY 同源基因的克隆及其表达分析

 以草莓（Fragaria × ananassa）品种‘花姬’为试材,通过PCR和RACE的方法克隆出LFY同源基因的cDNA全长序列,命名为FaLFY（GenBank收录号JN788260）,通过定量PCR的方法检测了该基因在草莓植株各组织和花器官中的表达。结果表明FaLFY编码区长度为1 236 bp,编码412个氨基酸,与其他物种的氨基酸序列都有一定的同源性,其中与蔷薇科玫瑰的LEAFY-1同源性最高,达到88%。实时定量RT-PCR结果表明,在不同的组织、不同的花器官中FaLFY的表达量存在差异,其中在花芽中的表达量最高,在营养生长的组织中基本不表达,在成熟花器官中同样不表达,说明该基因在草莓的成花进程中发挥重要作用。     

柑橘酸性转化酶基因片段的克隆

分析植物液泡和细胞壁转化酶基因的保守区序列，分别设计一对PCR引物，以柑橘基因组DNA为模板，采用PCR方法分别扩增出长约740 bp和530 bp的DNA片段，分别克隆入pBS－T 和pMD18－T载体，进行测序，结果表明，获得柑橘酸性转化酶基因家族的两个成员，成员A和B基因片段分别长742 bp和524 bp。其序列已在GenBank中登记（登记号分别为AF014925和AF314197）。在GenBank中进行同源性检索，结果表明，成员A编码的氨基酸与植物液泡酸性转化酶的氨基酸同源性较高，与拟南芥的最高，达76％，而成员B编码的氨基酸与植物细胞壁酸性转化酶的氨基酸同源性较高，与豌豆的最高，达71％。两成员核苷酸和氨基酸序列同源性分别为55％ 和50％，推测酸性转化酶基因成员A 和B编码的蛋白分别定位于液泡和细胞壁。     

茶树LEAFY基因的克隆和表达分析

以茶树（Camellia sinensis）大叶且无蕾不开花的突变体‘大叶龙’及其母株为材料,通过同源克隆结合RACE-PCR方法,克隆了LEAFY（LFY）同源基因的全长cDNA序列,两种序列分别命名为CsLFL1和CsLFL2,其cDNA全长分别为1 448和1 466 bp,各自包含1 191和1 197 bp的完整开放阅读框,编码396和398个氨基酸。它们与漆树科、无患子科以及壳斗目（山毛榉目）一些物种的LFY同源序列具有77% ~ 79%的一致性,具有植物LFY成员作为转录因子的脯氨酸富集区、亮氨酸重复、酸性和碱性结构域以及保守的C–端等典型结构特征。系统发育分析表明,它们属于双子叶植物LEAFY分支,并且亲缘关系最近,说明两者的形成是发生在茶树物种进化过程中较晚期的复制事件。两种序列在正常开花母株及‘大叶龙’中没有区别,在母株花芽中强烈表达,在母株和‘大叶龙’叶芽中有微弱表达。这些结果说明CsLFL1和CsLFL2代表了茶树中LFY的同源基因,并且可能参与茶树的成花启动过程。     

牡丹SERK2基因的克隆和花芽休眠进程中细胞分裂频率分析

根据牡丹休眠相关的差减文库中筛选得到的类体细胞胚胎发生受体蛋白激酶基因SERK2的部分cDNA片段,采用RACE技术扩增到5′和3′ cDNA片段,通过拼接得到PsSERK2基因2 374 bp的全长cDNA序列,其中5′非编码区（UTR）为158 bp,3′UTR为341 bp,ORF为1 875 bp,编码625个氨基酸。同源性分析得出其与葡萄VvSERK2蛋白同源性最高,为92.95%。PsSERK2在初花期（大风铃期）茎中表达量最高,叶片中最低。Northern杂交和定量PCR结果均表明PsSERK2在低温解除牡丹花芽休眠前期上调表达,而后降低。低温累积过程中,花芽内各个组织细胞分裂频率逐渐增加。推测PsSERK2上调表达促进了休眠花芽的发育,进而促进内休眠的解除。     

番荔枝开花调控转录因子基因AsLEAFY的克隆与表达分析

利用同源克隆和RACE-PCR获得番荔枝LEAFY基因的全长cDNA序列,命名为AsLEAFY,Gen Bank登录号为KP866145。序列分析表明,克隆获得的番荔枝AsLEAFY基因长为1 236 bp,编码411个氨基酸,该氨基酸序列含有5′-N端脯氨酸富集区和中央酸性区,具有LEAFY(FLO)家族的典型结构特征。同源分析表明,该氨基酸序列与多种木本植物LEAFY类蛋白的同源性较高。进化树分析表明AsLEAFY与木本植物的亲缘关系高于草本植物。实时定量PCR结果表明,AsLEAFY在番荔枝花发育的整个过程中都有表达,在初期的花芽中表达量最高,在不同组织器官中表达量存在差异,在枝条去叶后的腋芽中的表达量最高。推测该基因在番荔枝花器官形成初期发挥重要作用。     

菜薹花芽分化及BrcuFLC基因的克隆与表达

通过制作石蜡切片研究了菜薹(Brassica campestris L. ssp. chinensis (L.) Makino var. utilis Tsen et Lee)早熟品种‘油青49’和晚熟品种‘油青甜菜心80天’的花芽分化过程,结果表明,当展开2~3片真叶时花芽分化开始启动。用已报道的拟南芥Flowering locus C (FLC) 基因和FRIGIDA (FRI) 基因的保守区域设计引物,通过RT-PCR的方法从两个菜薹品种中均克隆得到了两个决定开花的关键基因,并命名为BrcuFLC (GenBank登录号为EF138603)和BrcuFRI (GenBank登录号为EU700362)。半定量式RT-PCR表达分析表明, BrcuFLC基因在早、晚熟菜薹品种的不同发育时期表达存在差异,表达量随真叶数增加而逐步减少,但在晚熟品种中BrcuFLC表达量降低幅度小;BrcuFRI则在早、晚熟品种的所有阶段表达都较低。BrcuFLC在菜薹不同部位表达的情况不同,在茎、叶中的表达强,花次之,根中表达较弱;而BrcuFRI在早、晚熟品种根中的表达量明显高于其它3个部位。     

大白菜核雄性不育相关基因BrLTP1的克隆及特征分析

 利用cDNA-AFLP技术分析大白菜核雄性不育两用系‘AB02’可育株（msms）和不育株（Msms）花蕾的基因表达谱,在可育株混合花蕾cDNA中扩增出1条特异条带TDF-25,通过RACE和RT-PCR技术克隆了该基因的全长cDNA序列。序列分析表明,该基因编码脂质转移蛋白,命名为BrLTP1。BrLTP1全长cDNA序列为750 bp,推测编码1个包含183个氨基酸残基的前体蛋白。BrLTP1蛋白含有典型的脂质转移蛋白N端信号肽,保守的AAI结构域和半胱氨酸位点。预测BrLTP1蛋白含有多种修饰性位点,包括1个PKC磷酸化位点,2个N–糖基化位点和10个N–端豆蔻酰基化位点。基因表达模式表明,BrLTP1在两用系不育株花蕾中受到强烈抑制,在可育株的大花蕾、成熟花药以及花瓣中高水平表达。     

百子莲开花相关基因ApFT的克隆及表达分析

采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）方法得到了百子莲（Agapanthus praecox ssp. orientalis）FT基因cDNA全长序列,命名为ApFT,GenBank登录号为KC951108。序列分析表明,百子莲ApFT基因cDNA全长815 bp,其中开放阅读框534 bp,编码177个氨基酸,5′非编码区（5′UTR）和3′非编码区（3′UTR）分别为89 bp和192 bp。ApFT编码的蛋白有一个单一而非常保守的PEBP（Phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP磷酸乙醇胺结合蛋白）结构域,与玉米（MFT2）、拟南芥（AtFT）和温州蜜柑（CuMFT1）等植物的FT蛋白有较高的相似性,同源性均在50%以上。系统进化树分析表明,百子莲ApFT与玉米（MFT2）聚类关系最近。实时荧光定量qRT-PCR结果显示,整个花芽分化过程中ApFT在叶片中表达量高,茎尖中表达量低。随着花芽分化的进程,在叶片中ApFT表达量逐渐降低,而茎尖中ApFT的表达量在诱导期均高于营养期和花芽分化期,推测该基因可能在调节百子莲花芽分化过程中发挥重要作用。     

Identification and functional characterisation of a novel anther-specific LTP promoter from Brassica campestris ssp. chinensis

The pollen development-related gene msLTP from Brassica campestris ssp. chinensis belongs to the lipid transfer protein (LTP) gene family. The promoter of the msLTP gene was isolated by thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR). The functional elements of the promoter (named Bc15) were analysed. Some anther/pollen-specific elements, such as the GGTT box and the GTGA box, were identified in the sequence. In an attempt to confirm the promoter activity, a series of 5′-truncated constructs was fused with the GUS reporter gene to functionally analyse the key regulatory regions of the promoter. Transient expression analysis showed high GUS activity in onion epidermal cells containing the region from ?731 to ?1 bp. The truncated construct bearing the ?731 to ?1 bp fragment was stably introduced into Arabidopsis. Histochemical analysis of the transgenic plants showed distinct and specific GUS expression at different stages of anther/pollen development. Transverse sections of flower buds further indicated that the Bc15 promoter activates reporter gene expression in the anther specifically. These findings elucidated the molecular mechanisms of LTP gene regulation during pollen development, and suggested a potential application of the Bc15 promoter in engineering male sterility for hybrid production.     

香蕉抗逆相关基因MaERF的克隆与表达分析

 根据已获得的AP2/ERF基因片段,通过RACE方法获得一个香蕉ERF基因完整编码区序列,命名为MaERF。该基因cDNA全长1 611 bp,其中开放阅读框1 128 bp,编码376个氨基酸,包含一个保守的AP2/ERF结构域,基因组序列全长2 881 bp,含有一个内含子,剪切位点符合“GT-AG”规则;系统进化树表明该基因属于植物ERF转录因子家族的B2亚群。半定量RT-PCR分析表明,该基因在香蕉各个器官中均有表达,其中在根和叶中的表达量较低,而在果实和花中的表达较高;实时荧光定量Real-time PCR检测表明,受尖孢镰刀菌侵染及低温胁迫后,香蕉中该基因表达明显上调,推测其在香蕉胁迫反应中可能发挥重要作用。     

薄壳山核桃MADS-box基因CiMADS9的克隆与功能分析

以薄壳山核桃（Carya illinoinensis）‘马罕’雄花为材料,利用获得的MADS-box基因保守片段设计特异引物,通过RACE技术克隆MADS-box家族基因的cDNA序列,命名为CiMADS9。该基因长为1 077 bp,开放阅读框（ORF）768 bp,编码255个氨基酸残基。生物信息学分析表明该基因具有典型的MADS-box结构域和半保守的K区,是MIKC型MADS-box基因。聚类分析分析表明该基因属于AGL15亚家族。实时荧光定量PCR结果表明,CiMADS9在生殖器官（雄花、雌花、幼果）中的表达量高于营养器官（叶、枝条）中的,并且在雄花中的表达量最大。将目的基因通过农杆菌介导法转化拟南芥,获得了转基因植株。与对照相比,转基因拟南芥中过量表达该基因使植株开花延期,基生叶增加。     

Simultaneous down-regulation of DORMANCY-ASSOCIATED MADS-box6 and SOC1 during dormancy release in Japanese apricot (Prunus mume) flower buds

In temperate deciduous fruit crops such as Prunus spp., bud endodormancy is an important physiological phase affecting the timing of blooming and subsequent fruit development. Japanese apricot (Prunus mume) bears unmixed flower buds, separate from vegetative buds, that bloom slightly more than a month before vegetative bud burst. Seasonal expression of Prunus mume DORMANCY ASSOCIATED MADS-box genes (PmDAMs) has previously been analyzed only in vegetative buds, with an association between these genes and flower bud endodormancy release not yet confirmed. In this study, we performed a seasonal expression analysis of PmDAM1–6 genes in flower buds of two Japanese apricot genotypes – namely, high-chill and low-chill cultivars. The analysis revealed that PmDAM3, PmDAM5, and PmDAM6 expressions are closely associated with dormancy release in both flower and vegetative buds. In addition, a yeast two-hybrid screening demonstrated that PmDAM6 can interact in yeast with the homolog of Arabidopsis SOC1 (PmSOC1). Synchronized expression patterns were detected in PmDAM6 and PmSOC1 during dormancy release in flower buds of the two genotypes. Taken together, these results suggest that the dimer of PmDAM6 and PmSOC1 may play a role in the regulation of dormancy transition and blooming time in Japanese apricot flower buds.     

牡丹ACC氧化酶基因的克隆与反义载体的构建

根据报道的牡丹ACC氧化酶基因(DQ337251)cDNA序列,设计一对特异引物,以牡丹品种"洛阳红"基因组DNA为模板,用PCR扩增方法克隆出牡丹ACC氧化酶基因的部分片段,并将其连接到pMD18-T载体上进行测序.结果表明,克隆的序列全长为467 bp,其中包括一个长度为157 bp的序列,推测它可能是一个内含子,其它序列与已报道序列同源性为98.2%;用SacⅠ和XbaⅠ对重组质粒和载体pBI 121酶切、连接,构建牡丹ACC氧化酶基因的反义表达载体.     

蝴蝶兰PhSVP的克隆及其在花发育过程中的表达分析

从蝴蝶兰杂交品种‘大辣椒’中克隆到SVP同源MADS-box基因PhSVP，使用RACE方法获得PhSVP全长，其开放阅读框为687 bp，编码228个氨基酸。蛋白序列多重比对表明PhSVP蛋白包含一个高度保守的MEF2-like MADS结构域和一个中度保守的K-box结构域，且与兰科的SVP/AGL24同源蛋白相似度高，进化树分析也表明PhSVP蛋白与其他兰科植物的SVP/AGL24同源蛋白亲缘关系最近。PhSVP的空间表达模式表明其在营养器官表达量高，在萼片、侧瓣和唇瓣等生殖器官表达量低。进一步对PhSVP在成花转换和花发育过程中花序顶端的表达进行分析，表明PhSVP的转录水平在营养分生组织向花序分生组织过渡的过程中无显著变化，仅在花序分生组织阶段有少量上升，但在花发育早期花分生组织阶段中的表达水平显著升高，而在花发育后期的萼片原基、花瓣原基和合蕊柱原基阶段持续下降。此外还发现A类基因PhAP1在花发育过程中的花序顶端的表达模式与PhSVP相似，而B类基因PhPI和C类基因PhAG在花瓣原基和合蕊柱原基阶段的表达量最高。检测了PhSVP在抽葶期、花蕾期和盛花期的根、叶和花葶中的转录水平，结果表明PhSVP在花蕾期的根中的表达量稍高于其他时期，在不同阶段的叶中的表达水平无显著差异，而在抽葶期花葶中的表达量显著高于花蕾期和盛花期。试验结果暗示蝴蝶兰PhSVP可能起到调控花分生组织状态的维持、避免花器官原基过早分化的作用。