利用16S rDNA结合gyrA和gyrB基因对生防芽孢杆菌R31的快速鉴定

克隆16S rDNA、DNA促旋酶A亚基编码基因gyrA和B亚基编码基因gyrB对分离自石斛兰（Dendrobiumsp.）叶片的广谱抗真菌生防芽孢杆菌R31进行鉴定。首先通过生理生化测定和克隆16S rDNA序列,分析显示其属于芽孢杆菌属（Bacillus）,但不能准确鉴定到种;然后分别利用克隆的gyrA基因和gyrB基因以及其BLAST分析结果构建系统发育树,最终将该菌株确定为枯草芽孢杆菌（B.subtilis）。结果显示利用16S rDNA与gyrA基因组合可以快速鉴定枯草芽孢杆菌,利用16S rDNA与gyrB基因组合可以快速鉴定枯草芽孢杆菌及其近缘种。     

12种寄主来源的茄科雷尔氏菌16S-23SrDNA间隔区序列比较

应用PCR方法,获得了分离自广东番茄、茄子、辣椒、烟草、空心菜、沙姜、姜、马铃薯、花生、菊花、桑树和藿香等12种作物21个茄科雷尔氏菌菌株的16S 23S rDNA 间隔区序列（ITS）。序列分析结果表明,除HZ 1菌株外,其余20个茄科雷尔氏菌菌株ITS序列长均为503 bp,序列间相似性99.2%~100%,序列间差异仅1~4 bp;而HZ 1菌株的ITS序列长为498 bp,与其他菌株的ITS序列相似性为95.4%~95.6%。这些结果说明,这21株来源于12种不同寄主的茄科雷尔氏菌菌株的16S 23S rDNA ITS序列比较保守。系统进化分析显示,仅菌株HZ 1聚类于茄科雷尔氏菌区组2中,其余20个菌株均聚类于茄科雷尔氏菌区组1中。     

甜樱桃流胶病原菌的分子鉴定和致病性检测

 为明确甜樱桃流胶病的病原菌,采用普通细菌学方法从15个病样中分离获得10个代表性菌株,对病原菌的形态学特征、生理生化特性以及致病性进行了研究。利用PCR对菌株的16S-23S rDNA转录间隔区(ITS)序列进行扩增,扩增产物克隆测序,结果显示该菌株属于丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)。用MegAlign构建系统发育树,结果显示该菌株与丁香假单胞菌丁香致病变种(P. syringae pv. syringae)亲缘关系最近,两者最先聚在一起。分离菌株中均可检测到syrB基因。研究结果表明P. syringae pv. syringae为甜樱桃流胶病的病原菌。     

生防菌株2P24与CPF-10的鉴定及其生防相关性状的初步分析

 从山东省小麦根围土壤中分离到具有生防活性的细菌菌株2P24、CPF-10。通过对其16S rDNA序列同源性分析及生理生化测定鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),其中菌株2P24为生物型I,CPF-10为生物型V。对这2株细菌的生防相关性状分析表明,二者均可产生多种抗菌物质,如2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)、氢氰酸(HCN)、嗜铁素、蛋白酶等。平板对峙测定表明2株细菌对番茄青枯菌(Rastonia solanacearum)、棉花立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、棉花枯萎菌(Fusarium oxysporum)具有明显的拮抗作用。温室生测表明2P24对番茄青枯病的防效达63.0%。CPF-10达62.4%,且持续稳定。     

内生细菌B504的鉴定及对黄瓜枯萎病的生防作用

B504是从黄瓜植株中分离到的内生细菌。平板对峙试验表明,该菌株对黄瓜枯萎病菌等10种植物病原真菌具有拮抗作用,对黄瓜枯萎病菌的生长抑制率达44.1%。该菌株造成黄瓜枯萎病菌的分生孢子畸形,形成泡状物,尔后细胞壁消解,引起细胞内含物外溢,明显影响孢子萌发。用B504对黄瓜种子进行催芽处理,对黄瓜苗期、成株期枯萎病的防治效果分别为54.0%和41.7%。B504的16S rDNA序列与枯草芽胞杆菌具有高度相似性。根据菌体形态、培养性状、生理生化特性及16S rDNA序列分析等指标,确定B504为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）。     

秦岭山区无机磷细菌筛选及其Biolog和分子生物学鉴定

为获得具有高解磷活性,可用于微生物肥料研制和生产的无机磷细菌菌株资源,采用平板溶磷圈法,从秦岭山区植物根际土壤样品中筛选获得3株高效无机磷细菌,命名为NO.9、NO.15、NO.17,根据钼锑抗比色法,培养5 d后,检测菌株发酵液,确定3株细菌的可溶性磷含量分别为98.12、80.37 mg/L和104.91 mg/L,微生物量磷含量分别为62.85、53.61、36.59 mg/L。生理生化特征、Biolog和16S rDNA鉴定结果表明,3株细菌均属于革兰氏阴性非肠道菌,NO.9菌株为Inquilinus ginsengisoli,NO.15菌株为醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus),NO.17菌株为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。     

西瓜细菌性果斑病菌的16S rDNA序列分析及特异性引物的设计

 利用细菌16S rDNA基因的通用引物对16个供试菌株进行PCR扩增,把扩增产物进行核苷酸序列测定。将获得的序列与GenBank中相关菌株的16S rDNA序列进行同源性分析。以此设计出检测A.a.c的特异性引物,并利用最大简约法构建了16S rDNA系统演化树。系统演化关系分析表明,6~9号供试菌株的16S rDNA序列与A.a.c标准菌株仅有3个位点的差异,其同源性均在99.8%以上,在构建的系统演化树上,它们聚为同一个族群。利用设计的一对特异性引物(BFB64/65),对各供试菌株进行PCR检测,结果只有A.a.c相关菌株产生扩增条带,产物大小与预期一致。     

朝鲜蓟细菌性根茎腐烂病病原的分离与鉴定

 在湖南省常德市西洞庭管区种植的朝鲜蓟（Cynara scolumus  L.）上发现了一种新的病害,其症状表现为地上部分从外层叶片开始逐步枯萎,随后根部和主茎杆的髓部腐烂变褐,最后整株枯萎。从田间感病朝鲜蓟茎杆的病健交界处用NA培养基分离,获得10个菌株,分别指定为HNXDT001~010,并进行了致病性测定、形态观察和细菌学特征分析,同时对HNXDT002菌株进行分子生物学鉴定。结果表明,该系列菌株在NA培养基上均形成灰白色圆形菌落,稍突起,有光泽,半透明。在显微镜下菌体呈短杆状,两端钝圆,具有2～8根周生鞭毛,革兰氏阴性。10个菌株通过针刺法接种均可导致朝鲜蓟茎杆、胡萝卜、辣椒、白菜、土豆、番茄和莴苣茎杆软腐,经科赫法则验证为致病病原菌。该菌株的16S rDNA序列和果胶酶基因片段测序(分别用16S rDNA通用引物16SF/16SR和果胶酶基因引物Y1/Y2扩增)与系统发育学分析表明,其16S rDNA序列(GenBank Accession No. JF721958)与胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovorum  subsp.  carotovorum）菌株ATCC15713 (GenBank Accession No. U80197)序列同源性高达99％;果胶酶基因序列(GenBank Accession No. JF721960)与胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum）PC1菌株(GenBank Accession No. CP001657)序列同源性为93%。结果表明：朝鲜蓟细菌性根茎腐烂病病原为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种。     

一株芽胞杆菌QD-10的鉴定及生防特性分析

从青岛黄海海域采集的海泥中分离得到了1株具有较高拮抗活性的菌株QD-10,通过培养性状、形态特征观察、生理生化特性测定及16S rDNA、ITS、gyrA和rpoB基因部分序列比对,将其鉴定为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens。该菌株对本研究中选择的14种常见植物病原真菌和平菇褐斑病菌Pseudomonas tolaasii、大白菜黑腐病菌Xanthomonas campestris pv.campsetris 2种植物病原细菌均有不同程度的抑制作用,具有较宽的抑菌谱。该菌株能够产生嗜铁素、蛋白酶、纤维素酶和吲哚乙酸(IAA),表明其具备一定的生防相关性状。该菌株的不同浓度发酵液对番茄灰霉病的防效测定结果表明,在人工接种后第7 d和第11 d,菌株QD-10的发酵原液处理的防效均为100%,稀释5倍的发酵液防效分别为100%和41.7%,且二者均显著高于多抗霉素和多菌灵的防效。     

生防细菌FD6的鉴定及其对番茄灰霉病菌的作用机制

拮抗细菌FD6分离自福建闽侯青口青菜根围土壤,采用凹玻片法和离体叶片接种法测定菌株FD6的抑菌能力,经16S rDNA序列比对和相关生理生化性状分析,对生防细菌FD6进行了鉴定,并通过PCR扩增、薄层层析、薄层色谱生物自显影等探讨FD6产生抗生素的种类及其抑菌效果。结果表明,FD6的细菌悬浮液可显著抑制灰霉病菌分生孢子萌发,抑制率达99%,FD6培养滤液的抑制率仅为31%;细菌悬浮液对番茄灰霉病防效达59.7%。FD6的16S rDNA序列与假单胞菌属Pseudomonas的相似性达99%,系统进化树显示与荧光假单胞菌P.fluorescens遗传距离最近,结合生理生化表型特征将FD6菌株鉴定为荧光假单胞菌P.fluorescens。菌株FD6可产生硝吡咯菌素、2,4-二乙酰基间苯三酚、藤黄绿脓菌素、嗜铁素、氢氰酸和蛋白酶等抗菌物质,不产生吩嗪-1-羧酸,其中,硝吡咯菌素可直接抑制番茄灰霉病菌孢子萌发和菌丝的生长。     

广东桉树黄化(丛枝)病植原体分子鉴定与检测

从表现黄化(丛枝)症状的桉树上采集病叶,抽提主脉总DNA,采用植原体通用引物与巢式引物进行PCR和巢式PCR扩增,对扩增产物进行克隆和序列测定,获得了植原体的近全长16S rRNA基因及部分16～23S rRNA基因间隔区序列.序列分析揭示,所获得的序列与已知植原体基因组相应区段的序列高度同源,与柳叶菜变叶植原体(epilobium phyllody)和白腊树丛枝植原体(ash witches'-broom)相应序列(GenBank登录号:AY101386和AY566302)同源率为99.9%,与白腊树黄化植原体(aster yellows BD2)相应序列和番茄巨芽植原体(tomato big bud)相应序列同源率分别为99.6%和99.3%.该序列构建的系统进化树表明,引起我国广州地区桉树黄化(丛枝)病的植原体属于16SrI组(即翠菊黄化组),将其暂命名为桉树黄化(丛枝)植原体广东株系(Eucalyp-tus yellowing and witches'-broom phytoplasma strain Guangdong,EYWB-Gd).建立了桉树植原体巢式PCR检测方法,对疑似病样及桉树组培苗进行了检测,多数疑似病样检测结果为阳性,供试的10株组培苗未发现阳性样品.     

放线菌菌株MY02的鉴定及发酵液中抗真菌活性组分的分离

从东北地区蔬菜保护地土壤中筛选分离到一株放线菌菌株MY02,通过对其形态学特征及16S rDNA序列分析,初步鉴定其为龟裂链霉菌龟裂亚种Streptomyces rimosussub sp.rimosus。该菌株的发酵液具有抗真菌活性。发酵液经离心、过滤、萃取、硅胶柱层析等步骤分离纯化其活性物质,并进行高效液相色谱(HPLC)分析,表明其活性物质中含有两种抗真菌活性组分。对活性组分的正丁醇溶液进行紫外光谱扫描,结果表明该活性组分具有四烯类抗生素的典型特征吸收峰。     

Phylogenetic analysis of the citrus Huanglongbing (HLB) bacterium based on the sequences of 16S rDNA and 16S/23S rDNA intergenic regions among isolates in China

Phylogenetic analysis of Chinese isolates of the citrus Huanglongbing (HLB) bacterium based on the 16S rDNA and 16S/23S rDNA intergenic regions sequences was carried out. Nine HLB samples collected from different hosts with different symptoms in seven Chinese provinces, were subjected to PCR for amplifying and sequencing the 16S rDNA. The identity level among Chinese isolates was 98.5% to 100% and was the same with the Indian HLB isolate ‘Poona’ (GenBank accession number: L22532). By contrast, identity values were 97.5% to 97.8% with Candidatus Liberibacter africanus strain ‘Nelspruit’ (L22533), 96.3% to 97.3% with Ca. L. africanus subsp. ‘Capensis’ (AF137368), 95.3% to 96.5% with the Ca. Liberibacter sp. ‘LSg2’ (AY919312), and 94.9% to 96.0% with a strain of Ca. L. americanus from Brazil (São Paulo State; AY742824). A phylogenetic tree constructed with 16S rDNA sequences showed that all Chinese isolates belong to Ca. L. asiaticum. Analysis of the 16S/23S rDNA intergenic region was conducted on 18 HLB-diseased citrus samples with different symptoms, collected in seven provinces. These isolates showed no obvious variation and had an identity level >99.0% with one another. Sequence analysis of 16S/23S rDNA intergenic region and the relative phylogenetic tree showed that the Chinese isolates are very close to Ca. L. asiaticus, and distinct from Ca. L. africanus and Ca. L. americanus. These results suggest that the Chinese HLB isolates belong to the species Candidatus Liberibacter asiaticus. This is the first report on the classification of HLB isolates from China based on molecular investigations.     

半夏细菌性软腐病原菌的分离及鉴定

 在浙江省人工栽培的半夏[Pinellia ternata(Thunb.) Breit.]上发现一种新的软腐病害,软腐症状常常表现在块茎上,高温高湿条件可导致叶面腐烂和整株死亡。为了对病原菌进行鉴定,从软腐的半夏病株块茎中分离到10个菌株,分别指定为RF1~RF10,并进行了致病性测定、形态观察和细菌学特性分析,同时对RF1菌株进行了分子鉴定。结果表明,10个菌株均可经人工接种导致半夏、胡萝卜、马铃薯、番茄、黄瓜和白菜软腐。在电镜下菌体呈短杆状,两端钝圆,具有4~6根周生鞭毛。兼性厌氧、革兰氏阴性,DNA中G+C mol%为51。RF1菌株的16S rDNA测序和系统发育学分析表明,其与胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)M1菌株报告的序列相同点为99%,与该亚种另2个菌株(E161和441)的序列相同点达97%。结果表明,半夏软腐病原菌应归属于胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种。     

洋葱伯克霍尔德氏菌株Lyc2的鉴定及对棉苗的防病促生作用

 从烟草根际土壤中分离到一株细菌菌株Lyc2,平皿对峙培养显示该菌可显著抑制多种植物病原真菌菌丝体的生长。温室盆栽试验表明,Lyc2对棉花苗期立枯病的防治效果达到48.8%;水培棉花苗试验表明,Lyc2能显著增加棉苗的鲜重和干重,但对株高的影响不显著。该菌经形态、生理生化试验测定及16S rDNA和ITS序列分析,初步确定为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia);进一步通过种特异的recA基因序列分析,证明Lyc2菌株属于B. cepacia复合物中基因型IX,B.pyrrocinia。     

拮抗细菌B8对烟草黑胫病菌的抑制作用及其菌株鉴定

从烟草根际土壤中分离到对烟草黑胫病菌及其它植物病原菌具有抑制作用的菌株B8,平板对峙培养抑菌带内菌丝畸形、原生质凝集或外渗。其发酵原液和发酵液的无菌滤液均能抑制烟草黑胫病菌和蜡状芽孢杆菌;离体叶片接种法测定其发酵液对烟草黑胫病的防效,结果表明预防作用达100%。室内盆栽试验表明B8菌株发酵液对烟草黑胫病的预防作用可达78.1%,优于治疗作用。该菌菌体杆状,芽孢侧生、椭圆形,经形态学、生理生化性状和16S rDNA序列测定,将其鉴定为侧孢短芽孢杆菌。     

洛阳核桃黑斑病病原菌鉴定

<正>0引言核桃黑斑病是核桃的三大主要病害之一,发病范围广,危害严重,一般植株受害率70%～90%,果实受害率10%～40%,严重时达65%以上,导致核桃栽培经济效益大幅降低^[1]。核桃黑斑病病菌在病枝、芽鳞和残留的病果等处越冬,从气孔、皮孔、柱头、伤口等处侵入,借雨水、花粉、昆虫传播,可多次侵染^[2]。     

蝴蝶兰软腐病中一种新致病菌的分离与鉴定

 Soft rot disease often affects Phalaenopsis amabilis during the growing season. However, the pathogen of the disease is remaining poorly studied. In this study, bacterial strain R1 was isolated from soft rot tissues in Wuhan. The pathogenic, morphological, physiological, biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis were carried out. The homology of 16S rDNA sequence between strain R1 and Pseudomonas grimontii was 99.72%, and its physiological and biochemical properties were also similar to those of Pseudomonas grimontiis. All these evidences indicated that strain R1 could be identified as a novel strain of Pseudomonas grimontii. The pathogenicity of the novel isolate was proved according to the Koch's postulates. This is the first report that Pseudomonas grimontii can cause soft rot disease of Phalaenopsis amabilis.     

放线菌Snea253的鉴定及对大豆胞囊线虫的抑制作用

从土壤中分离筛选到一株具有杀线虫活性的放线菌菌株Snea253,该菌株对多种线虫有毒杀活性。通过形态学特征,生理生化特征及16S rDNA分析,初步鉴定为委内瑞拉链霉菌Streptomyces venezuelae。研究了Snea253菌株代谢物不同倍数稀释液对大豆胞囊线虫卵孵化及二龄幼虫活性的影响,结果表明：发酵原液对大豆胞囊线虫卵孵化的相对抑制率为88．73％;10倍稀释液浓度下,相对抑制率是70．49％,均与无菌水对照差异显著。处理24h后,发酵原液对二龄幼虫的校正死亡率是92．13％,各稀释浓度处理均与无菌水对照差异显著。