RT-PCR法克隆广谱抗病基因TGA2及其植物表达载体构建

文章采用Trizol Reagent提取拟南芥总RNA,设计相关引物;采用反转录PCR方法克隆TGA2转录因子,利用酶切连接方法,将该基因正向导入植物表达载体.经过相关检验,结果表明,TGA2转录因子正向插入中间载体的CaMV35S启动子和T-nos终止子之间,成功构建包含TGA2转录因子的p35ST-TGA2植物表达载体.     

RT-PCR克隆广谱抗病基因NPR1及其蛋白表达载体构建

[目的]克隆植物广谱抗病基因NPR1并构建其蛋白表达载体。[方法]提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆NPR1基因;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达载体。[结果]经过相关检验,将NPR1正向插入pMXB10载体中,得到了pMXB10-NPR1蛋白表达载体。[结论]成功构建了包含NPR1的蛋白表达载体。     

RT-PCR克隆广谱抗病基因NPR1及其蛋白表达载体构建

[目的]克隆植物广谱抗病基因NPR1并构建其蛋白表达载体。[方法]提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆NPR1基因;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达载体。[结果]经过相关检验,将NPR1正向插入pMXB10载体中,得到了pMXB10-NPR1蛋白表达载体。[结论]成功构建了包含NPR1的蛋白表达载体。     

RT-PCR法克隆拟南芥中NPR1基因及其植物表达载体的构建

园林植物多进行保护地栽培,高温高湿的局部小气候使园林植物更容易感染多种病害,一旦染病则极大地影响园林植物的观赏价值,造成较大的经济损失。文章采用RT-PCR扩增的方法从拟南芥基因组中克隆到能够介导植物广谱抗病的NPR1基因,并将其构建植物表达载体,为下一步的转化园林植物工作打下基础。     

DREB 2A基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

研究提取盐处理的拟南芥植株叶片总RNA,用DREB2A基因特异引物通过RT-PCR扩增出1050bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的DREB2A基因序列同源性达100%。进一步将DREB2A基因分别克隆至植物表达载体卡盒pCCE12和pCC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的DREB2A基因植物表达载体pCDRE12和pCDR29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导的DREB2A基因对植物的遗传转化奠定基础。     

拟南芥蛋白磷酸酶基因AtPP2C的克隆及植物表达载体的构建

根据GenBank中已发表的拟南芥蛋白磷酸酶基因AtPP2C(AT1g07430)的cDNA序列设计并合成了1对引物。通过RT-PCR方法从NaCl处理的拟南芥总RNA中扩增出AtPP2C基因的全长cDNA片段,采用gateway技术中的BP反应将其克隆到pDONR201中。测序表明,该片段与GenBank上报道的序列具有100%的同源性。采用gateway技术中的LR反应,以植物表达载体pLEELA为基础,构建了由组成型启动子35S调控的AtPP2C基因的植物表达载体pLAT35S。     

ThIPK2基因植物表达载体的构建

为培育高度抗逆和无选择标记的转基因小麦,本研究从NCBI数据库中搜索到ThIPK2基因序列,依据该基因编码的氨基酸序列,参照小麦偏爱的密码子对该基因进行密码子优化,并将重复的和不必要的酶切位点去掉后进行人工合成。将改造后的ThIPK2基因插入到强启动子Ubiquitin和终止子AtSac66之间,然后将其插入到含有玉米Ac/Ds转座子背景骨架的植物表达载体中,获得了具有删除选择标记功能的、由玉米Ubiquitin启动子驱动ThIPK2基因的植物表达载体。经过限制性内切酶分析鉴定,该植物表达载体构建成功。     

AtDREB2B基因的克隆及植物表达载体的构建

[目的]获得耐旱转录因子的植物表达载体,进而转化植物获得耐旱性提高的新植物株系。[方法]提取脱水处理的拟南芥总RNA,利用AtDREB2B特异引物通过RT-PCR扩增出1.2kb片段,并将其克隆至pBS-T上,测序。[结果]序列分析表明,该克隆序列与GenBank上登录AtDREB2B基因序列的一致性为100%。进一步通过片段的亚克隆,将其构建至植物表达载体pCAMBIA1301和pBin438上,分别由rd29A启动子和重复35S启动子调控基因表达。[结论]成功构建了2种AtDREB2B的植物表达载体,并通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101,为农杆菌介导的AtDREB2B基因对植物的遗传转化奠定基础。     

拟南芥Dof1基因原核表达载体的构建及应用

【目的】构建拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆转录因子Dof1基因,将其连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组原核表达载体pET32a(+)-Dof1,经酶切鉴定和测序验证后将其转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后,纯化重组蛋白,以分离到的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备抗血清,检测植物中Dof1蛋白表达水平。【结果】成功构建了拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体pET32a(+)-Dof1,在28℃、1mmol/L IPTG诱导6h的大肠杆菌中可高效表达分子质量约为42ku的重组蛋白,其分泌到细胞质中,不形成包涵体;Western-blotting检测结果证明,制备的抗血清有较好的抗原-抗体识别反应。【结论】成功实现了Dof1基因的原核表达,制备出的重组蛋白Dof1多克隆抗体可用于植物Dof蛋白表达水平的检测,可为Dof1基因的进一步研究奠定基础。     

EPSPS基因克隆及其表达载体的构建

[目的]克隆大豆EPSPS基因并构建其表达载体,为培育抗草甘膦作物提供理论基础和技术储备.[方法]以抗草甘膦大豆总基因组为模板,扩增EPSPS基因,构建EPSPS基因的植物表达载体PCAMBIA1300-UBI-GFP-EPSPS,并导入农杆菌,使其能够进行作物的遗传转化.[结果]扩增获得EPSP基因全长1368 bp,共编码455个氨基酸.测序结果表明,其与GenBank(AF464188.1)中已知的CDS序列完全一致,成功构建了EPSPS值物表达载体,并将其导入农杆菌菌株EHA105中.[结论]构建的表达载体可用于甜高粱等单子叶作物抗草甘膦性状的遗传改良.     

翅碱蓬脱水素基因克隆及表达载体构建

【目的】克隆翅碱蓬脱水素蛋白基因并构建其植物表达载体,为其耐盐性研究奠定基础。【方法】提取翅碱蓬总RNA,通过同源克隆和RACE方法分离获得翅碱蓬脱水素蛋白基因,并构建该基因的植物表达载体pBI121-DHN。【结果】克隆获得翅碱蓬脱水素蛋白基因的全长cDNA为847bp（GenBank序列编号：KC013239）,命名为SsDHN。序列分析结果表明,SsDHN全长cDNA中5＇-UTR为61bp,ORF为678bp,3＇-UTR为108bp且包含29bp的poly（A）尾巴,其起始密码子ATG位于62bp处,终止密码子TAA位于737bp处,编码225个氨基酸。氨基酸比对结果表明,该基因推导的氨基酸与已知其他植物DHN基因序列有35%～48%的相似性。聚类分析结果显示,翅碱蓬（SsDHN）与拟南芥和荠菜DHN亲缘关系较近,与咖啡、杜鹃花的亲缘关系较远。【结论】成功克隆了翅碱蓬脱水素基因,并构建了其表达载体,可用于翅碱蓬抗盐的遗传改良。     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和移动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(Coat protein,CP)和移动蛋白(Movement protein,MP)基因序列合成了CP和MP基因的上下游引物,通过PCR扩增获得目的片段,经过Sal I和Pst I双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序,构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP,用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白,为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒互作的寄主因子和克隆寄主因子,以及其种类和功能打下坚实的基础.     

大麦黄矮病毒GPV株系运动蛋白基因原核表达载体的构建

大麦黄矮病毒GPV株系ORF4基因编码一种17 kDa的蛋白,利用一对特异性引物,通过RT-PCR对ORF4基因进行了扩增,序列测定表明其长度为456 bp,与已报道的序列一致,并构建了原核表达载体。     

GUS基因分泌型植物表达载体的构建及对烟草的转化

为了验证PR1B分泌肽对谜底蛋白的分泌和增强功能,以GUS基因为靶基因,成功构建了PR1B 和GUS融合基因的植物表达载体,通过三亲融合法转入LBA4404农杆菌,并对烟草进行了转化,在216株卡那抗 性植株中共获得2株GUS染色阳性植株。     

犬细小病毒VP_2基因原核表达载体的构建与分析

从犬细小病毒/犬瘟热进口二联苗中提取犬细小病毒基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamH I和XhoI双酶切后,克隆至pET22b(+)质粒的相应位点上,构建了原核表达载体pET22b/VP2.重组质粒经限制性内切酶酶切和核苷酸序列分析表明,VP2基因已正确克隆到pET22b(+)载体上,从而成功地构建了pET22b/VP2表达载体.     

野生罂粟BBE基因克隆及RNAi载体构建

以野生罂粟(Papaver somniferum)试管苗幼叶为材料,用Trizol试剂盆提取总RNA,通过RT-PCR法获得BBE基因的cDNA片段,序列分析表明,所获得的cDNA序列全长1 608 bp,具有完整的开放阅读框(ORF),编码536个氨基酸,经blast检索该片段与GenBank中的小檗碱桥酶基因BBE(AF025430)同源性为94.84%.以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,构建了CaMV-35S启动子驱动的含小檗碱桥酶基因片段反向重复序列的RNAi双元表达载体pARB,为培育低吗啡,高蒂巴因的罂粟新品系奠定了基础.