实时荧光RT-PCR鉴别小反刍兽疫病毒疫苗株和野毒株

为快速鉴别小反刍兽疫病毒的疫苗株和野毒株,本研究通过分析Gen Bank中已发布的小反刍兽疫病毒全基因组序列,设计了1对通用引物以及疫苗株和野毒株特异性探针各1条,建立了小反刍兽疫病毒鉴别实时荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法对疫苗株和野毒株的检测灵敏度均可以检测至10拷贝/反应,在108至101拷贝/反应之间具有良好的线性关系,扩增效率均接近1。该方法具有良好的特异性,能够区分不同谱系的野毒株株和疫苗株。使用该方法对136份临床疑似样品检测,检出的阳性数量与普通RT-PCR相同,并且测序后的区分结果也相同。本方法的建立为该病的实验室鉴别检测和流行病学调查提供了技术支持。     

小反刍兽疫疫苗毒与野毒实时荧光RT—PCR鉴别检测方法的建立

为了建立鉴别检测小反刍兽疫疫苗毒与野毒的快速分子生物学检测方法,通过对自行测序的疫苗毒基因组序列及GenBank中登录的野毒基因组序列进行比对分析,设计了2套引物和TaqMan荧光探针,对实时荧光RT-PCR反应条件进行优化,建立了小反刍兽疫疫苗毒与野毒实时荧光RT-PCR鉴别检测方法。特异性试验证实,该检测方法只能检测到目的病毒核酸,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,检测疫苗株的最低检测限可达1．38mg／L的总RNA,检测野毒株的最低检测限为0．16mg／L的核酸。对同一样品进行重复性检测,检测的荧光扩增曲线阈值完全重舍,证明其重复性极好。从180份临床样品中,检测出2份疫苗病毒株阳性样品,其余均为阴性。结果表明,本研究所建立的实时荧光RT-PCR方法能对小反刍兽疫疫苗毒及野毒进行鉴别检测,具有特异性好、灵敏度高、重复性极好的优点,是开展小反刍兽疫疫情监测的有力工具。     

小反刍兽疫病毒野毒与疫苗毒双重荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

对GenBank中的小反刍兽疫野毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)及疫苗毒株的基因序列进行分析,设计两对引物和两条特异探针,建立小反刍兽疫病毒野毒与疫苗毒株的双重荧光RT-PCR鉴别检测方法。特异性检测表明,建立的双重荧光RT-PCR方法,可特异检测野毒(FAM通道)和疫苗毒(VIC通道)。灵敏度实验表明,FAM通道可检测到10~(-5)稀释度的RNA(3.576 ng/mL),VIC通道可检测到10~(-3)稀释度的RNA(27.6 ng/mL)。重复性实验表明,该双重荧光RT-PCR方法重复性较好。用建立的二重荧光RT-PCR方法对20份组织样品进行检测,结果显示,该方法可以有效区分野毒和疫苗毒株,且野毒检测结果与实验室确诊阳性结果一致,可以用于临床检测。     

小反刍兽疫病毒Ⅱ系与Ⅳ系毒株SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为建立小反刍兽疫病毒(PPRV)Ⅱ系与Ⅳ系毒株SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR的鉴别检测方法，针对PPRV-H基因的高变区域设计1对特异性引物，确定反应条件，分析其敏感性和特异性，并对临床样本进行验证。60℃退火、76℃收集荧光信号获得试验效果最好，熔解曲线为单一峰，Ⅱ系毒株熔解温度78.63℃,Ⅳ系毒株熔解温度80.08℃,易于区分；最低检测限为10拷贝/μL,批内、批间变异系数均小于0.5%,羊口疮病毒(ORFV)等4种病毒无扩增曲线产生；检测140份临床样本，与国家标准检测方法结果符合率100%。本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR检测方法可以快速、灵敏和特异地鉴别检测出PPRVⅡ系与Ⅳ系毒株，满足疫病快速诊断的需求。     

小反刍兽疫实验室诊断

为了对小反刍兽疫疑似病例进行实验室确诊,采集疑似小反刍兽疫病羊材料,用实时荧光定量RT-PCR检测方法以及一步法RT-PCR检测方法进行检测,并针对小反刍兽疫N基因序列设计引物扩增N基因并进行克隆测序及序列分析。试验结果可见,疑似小反刍兽疫病羊临床剖检表现为胃肠道及肺部出现坏死,肠道出现线状出血。实时荧光定量RT-PCR和一步法RT-PCR方法检测结果显示均为小反刍兽疫病毒(PPRV)核酸阳性。N基因测序结果 China-GZ株与小反刍兽疫4个支系毒株序列比对显示,核苷酸同源性为89.0%~97.3%。本试验通过临床症状表现和实验室分子生物学诊断确诊该病例为小反刍兽疫病毒感染所致。     

应用PCR-焦磷酸测序技术快速检测小反刍兽疫病毒

为适应小反刍兽疫快速、准确、高通量诊断的需求,建立一种基于PCR及焦磷酸测序技术平台的小反刍兽疫病毒鉴定方法。对Gen Bank中已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行分析,设计专用引物进行PCR扩增及焦磷酸测序,测得序列经比对分析可以确定是否为小反刍兽疫病毒感染。采用所建立的PCR-焦磷酸测序方法对西藏采集的10份血清样品进行检测,检测结果表明,该方法可以用于小反刍兽疫病毒的检测,而且该样品可初步鉴定为疫苗株感染。     

一步法RT-PCR检测小反刍兽疫病毒

为建立一步RT-PCR检测小反刍兽疫病毒(PPRV)方法,针对Gen Bank中PPRV F基因进行序列比较分析,设计一对特异性引物,通过优化RT-PCR反应条件,建立了一步RT-PCR检测PPRV方法。该方法最佳退火温度为60℃,最佳引物用量为8pmo L/μL。利用这种方法对小反刍兽疫临床阳性样本进行检测,获得了特异性的扩增目标条带,但不与口蹄疫病毒、羊口疮病毒、犬瘟热病毒等发生反应。本方法具有高度灵敏性,最低检测量为3.576×10-5g/L,可广泛应用于临床小反刍兽疫病毒核酸的检测。     

小反刍兽疫灭活抗原RT-PCR检测方法的建立及其相关序列分析

以灭活的检测用抗原为材料,抽提灭活小反刍兽疫病毒的基因组RNA作为模板,根据参考文献及GenBank下载的序列,设计3对位于F基因的引物(2对为套式引物),进行RT-PCR扩增及扩增片段的T载体克隆、序列分析。结果显示,所设计引物单独或套式RT-PCR对模板均有预期大小的片段扩增;扩增片段经核苷酸序列测定和分析,表明所扩增片段为小反刍兽疫病毒的F基因片段。且所设计引物对同属牛瘟病毒、犬瘟热病毒无扩增,证明所用引物为小反刍兽疫病毒特异性引物,此3对引物可用于小反刍兽疫与牛瘟等同属病毒的鉴别诊断。     

小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒多重荧光RT-LAMP鉴别检测方法的建立及应用

旨在建立一种可视化多重荧光RT-LAMP方法用于检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的核酸,并初步应用于小反刍兽疫和蓝舌病临床样品的检测。比对GenBank中小反刍兽疫N基因和蓝舌病NS3基因保守区域,设计2套LAMP引物,在每条内引物FIP的5′端标记荧光基团。对反应条件进行优化,验证方法的特异性、灵敏度和干扰性,同时应用该方法检测168份临床样品。结果表明,该方法对小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒高度特异,与口蹄疫病毒、鹿流行性出血热病毒、牛瘟病毒、山羊痘病毒等其他反刍动物病毒均无交叉反应,检测灵敏度为200 copies/μL,干扰性小,可同时检测两个不同浓度的模板。对168份样品的检测结果显示,小反刍兽疫病毒的感染率为3.6%,蓝舌病病毒的感染率为13.1%,无两种病毒混合感染;与荧光RT-PCR方法相比,此多重荧光RT-LAMP方法敏感性为91.7%～100%,特异性为100%。表明建立的多重荧光RT-LAMP可快速、准确地检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒,具有较好的临床应用价值。     

陕北白绒山羊小反刍兽疫病毒RT-PCR方法的建立

为了建立适用于本地区小反刍兽疫病毒的分子生物学快速检测方法,通过分析NCBI数据库中小反刍兽疫病毒N基因序列,根据该基因设计特异性引物,建立针对本地区小反刍兽疫病毒N基因的一步法RT-PCR检测方法,利用该方法对来自疫源地的不同病料样本进行检测,结果显示该方法对病料的可选择性较多,对检测到的阳性条带通过测序分析,发现流行毒株与陕西毒株基因型差异不明显。该检测方法的建立有利于开展小反刍兽疫疫情监测,为有效防控小反刍兽疫提供技术支撑。     

小反刍兽疫病毒N基因的原核表达

目的是表达出小反刍兽疫病毒的核蛋白,并鉴定其活性.根据GenBank发表的小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria 75/1株N基因序列,对其进行基因优化并合成.设计引物,利用PCR的方法扩增PPRV-N基因,将该基因片段定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达栽体pET-28a-N.阳性质粒转化原核...     

小反刍兽疫活疫苗的安全性评价试验

2007年小反刍兽疫(PPR)在我国西藏首次暴发,在西藏和新疆部分地区使用PPR Nigeria 75/1疫苗株制造的疫苗进行免疫接种。为明确疫苗的安全性,中国兽医药品监察所国家牛瘟参考实验室对其安全性能进行了系统评价。健康易感山羊、绵羊及怀孕山羊、怀孕绵羊按不同剂量接种疫苗后,均未观察到异常临床反应;怀孕母羊所产羔羊数量与对照组无明显差异。疫苗对小白鼠、豚鼠的非特异性安全试验表明,所有接种动物均健活。结果表明该疫苗安全性良好,可在田间大规模使用。     

小反刍兽疫分子生物学研究进展

小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病。山羊高度易感;牛、猪等动物也可以感染带毒,野生动物偶有发生。作者主要介绍了小反刍兽疫病毒各基因结构特点,6种结构蛋白的功能,以及小反刍兽疫的诊断技术等方面的最新研究进展。     

小反刍兽疫的诊断与综合防控措施

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性、亚急性传染性疾病,主要感染绵羊、山羊及一些野生小反刍动物,发病率和死亡率均较高,给广大农牧民和养殖场造成巨大的经济损失。因此,对该病的诊断及综合防控措施进行概述,以期为该病的防控提供参考。     

我国首例小反刍兽疫诊断报告

2007年7月我国西藏发生不明山羊疫情,国家外来动物病诊断中心对当地动物疫病控制中心送检的14只病死山羊病料和一批血清样品分别进行病原学和血清学检测。利用较敏感的小反刍兽疫病毒(PPRV)特异性荧光定量RT-PCR方法,在11只病羊组织中检测到小反刍兽疫病毒核酸。利用次敏感的PPRV普通RT-PCR方法,从8只病羊组织中检测到PPRV核酸。针对1号样本病原核酸N基因和F基因片段进行遗传发生分析,该病原属于4系。利用竞争ELISA试剂盒对送检的13份血清样本进行抗体检测,结果全部阳性。将1号组织样本接种Vero细胞分离病毒,透射电镜观察下,发现了500纳米左右的病毒粒子。对分离毒株进行PCR检测同样证实其为PPRV。     

Prion蛋白致病机理的研究

Prion这一术语是Prusiner提出的,其中Pr源自英文蛋白质(protein),i源自英文传染性的(infec-tious),on意指粒子(particle)。Prions病也称为传染性海绵状脑病(transmissible spongiform enceph-alopathies,TSEs),是发生于动物与人类的一种致命性神经退行性疾病(Attwood等,2000)。TSEs包括疯牛病(mad cow disease,MCD),即牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy,BSE)、羊瘙痒症(scrapie)、克-雅氏病(creutzfeldt-jakob dis-ease,CJD)、GSS综合征(gersrmann-straussler-scheikerg disease,GSS)和致死性睡眠综合征(fatalfamil…     

小反刍兽疫快速诊断技术及其疫苗的研究进展

小反刍兽疫（PPR）是一种感染家养和野生反刍类动物的急性传染病，它是由副粘病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒（PPRV）引起的。本病没有有效治疗方法，只能预防,因此诊断监测技术是控制该病的重要手段。由于传统的血清学检测技术，如琼脂糖凝胶免疫扩散(AGID)、病毒中和试验（VNT）等存在诸多缺陷，难以用于大规模的疫情监控。目前国际上发展的主流是以分子生物学技术为基础的检测方法，如RT-PCR、PCR-ELISA等，这些新技术灵敏便捷，高通量，而且能够在野外进行。而疫苗以重组疫苗为研究方向。     

Establishment of Vero Cell Line Expressing Goat SLAM Receptor Stably

Signalling lymphocyte activation molecule (SLAM,also called CD150) serves as a main cell receptor for PPRV (peste des petits ruminants virus).This study was aimed to establish a cell line,using Vero cells as the parental cell,to express goat SLAM stably,which could be used to isolate and propagate PPRV.The gene encoding goat SLAM in vitro was synthesized and cloned into eukaryotic expression vector pIRES2-GFP,and the recombinant expression plasmid pIRES2-gSLAM was obtained.The positive stably transfectant Vero-gSLAM cells were screened by G418 and identified by immunofluorescence(IF) and RT-PCR.The result of virus titration by Vero-gSLAM cell line showed that PPRV strain N75/1 had a titre of 10^-4.65 TCID₅₀ per 0.1 mL in Vero cell at 5 day after infection and the titre of PPRV N75/1 strain was 10^-5.75 TCID₅₀ per 0.1 mL in Vero-gSLAM cells.The cell line would play an active role in virus isolation,biological characteristics study and vaccine virus production of PPRV.     

稳定表达山羊SLAM受体的Vero细胞系的建立

信号淋巴激活分子（signalling lymphocyte activation molecule, SLAM）又称CD150,是小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus, PPRV）和犬瘟热病毒（canine distemper virus, CDV）等麻疹病毒属病毒感染淋巴细胞的主要受体,在病毒侵入细胞中发挥着重要作用。为了建立稳定表达山羊SLAM真核细胞系,本研究将全基因合成的gSLAM基因克隆至真核表达质粒pIRES2-GFP中,构建了重组质粒pIRES2-gSLAM。将该重组质粒转染非洲绿猴肾细胞（Vero）,经G418筛选后,筛选到稳定表达gSLAM基因的细胞系Vero-gSLAM,该细胞系在传代至第10代,仍能稳定表达gSLAM基因,PPRV N75/1病毒株可以感染且能形成明显的细胞病变（CPE）,相比在Vero细胞上10^-4.65 TCID₅₀/0.1 mL的毒价,在Vero-gSLAM上为10^-5.75 TCID₅₀/0.1 mL,其毒价有所提高。该细胞系可用于PPRV强毒分离和致弱机制等相关研究。     

Evidence of mixed infection of peste des petits ruminants virus and bluetongue virus in a flock of goats as confirmed by detection of antigen, antibody and nucleic acid of both the viruses

A mixed infection with peste des petits ruminants virus (PPRV) and bluetongue virus (BTV) occurred in goats which exhibited symptoms characteristic of PPR. A number of samples were collected from ailing or dead goats for labrotory diagnosis. Antibody to BTV and PPRV was detected in sera samples by competitive ELISA. No PPRV antigen was detected in tissue samples like lung and spleen, however, presence of PPRV antigen in some sera samples was confirmed by sandwich ELISA. All the blood samples collected from the ailing animals were found positive for BTV antigen by a sandwich ELISA. BTV- and PPRV nucleic acids were amplified from the pooled blood and tissue samples respectively by RT-PCR assays. The identity of the amplicons was confirmed by cloning and sequencing. All these tests confirm that the goats were infected with PPRV and BTV simultaneously. Isolation of viruses from the clinical samples is underway.