紫云英根瘤菌质粒的研究——Ⅱ紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)经高温和吖啶橙处理后结瘤和固氮突变株的产生和质粒的消除

用高温和吖啶橙处理紫云英根瘤菌菌株7653~r和S_(52)分别获得了表型性状为不结瘤(Nod~-)和结瘤而不同氮(Nod~+,Fix~-)突变株。与亲本菌株具有的两条大质粒带相比,上述突变株均丢失了其中的一个较大的质粒。这一结果初步表明:菌株7653~r的nod基因和S_(52)的nif或fix基因可能定位在已消除的那一个大质粒(pRa7-2和pRa5-2)上。     

紫云英根瘤菌结瘤因子的生物学功能

利用紫云英种子浸提物诱导紫云英根瘤菌野生型菌株７６５３Ｒ产生结瘤因子（ＮｏｄＲｈ）。根毛卷曲试验表明，ＮｏｄＲｈ能诱导产生各种形式的根毛变形、卷曲和分枝，并且能诱导形成典型的“牧羊拐”状卷曲，与菌体正常侵染所引起的变化相同。同时发现，相对较高浓度的结瘤因子ＮｏｄＲｈ能抑制根的生长，形成粗短根。在制备紫云英根瘤菌接种剂的过程中，利用种子浸提物诱导产生结瘤因子，能显著提高根瘤菌的侵染结瘤能力。     

华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)研究进展

综述了华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)遗传多样性、质粒多样性、质粒的功能、结瘤因子、结瘤基因、胞外多糖等方面的研究进展。这类菌只能在紫云英上结瘤,1997年并入Mesorhizobium。选取大量菌株进行REP-PCR、16S和23S rDNAPCR-RFLP等分析,揭示其分为16种16S rDNA基因型。选用不同16S rDNA基因型的部分代表菌株进行部分16S rDNA测序。能够在紫云英上结瘤的根瘤菌可以分为2个类群。表明这类菌具有遗传多样性,存在不同的种。它们多数含共生质粒,共生质粒定位于最大或次大质粒上,质粒数1~5个不等,其分子量范围在53~906 kb之间。质粒缺失菌株表现为不结瘤(Nod-)和结瘤而不固氮(Nod ,Nif-)。某些质粒缺失还影响LPS合成、抗酸性、竞争结瘤能力。其结瘤因子能诱导紫云英根毛变形,它们的结瘤因子结构类似于苜蓿根瘤菌的结瘤因子。它们的结瘤基因具独特性,nodA与nodBC分隔一定距离,且具有保守性。它们产生的胞外多糖在侵染结瘤过程中发挥重要作用。     

铝对苜蓿生长、结瘤及根毛变形的影响

以紫花苜蓿为材料,探讨了铝对根伸长、根毛变形、结瘤和苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)生长的影响,旨在阐明豆科作物共生结瘤的初期铝毒害的机制。结果显示,在3、6、9!mol·L-1AlCl3处理24h后,初生根相对伸长率分别为对照(不加铝)的78.4%、43.1%和26.8%,根瘤菌的活菌数分别比对照减少了47.37%、63.16%和84.21%;在不接种根瘤菌而添加结瘤因子的情况下,苜蓿结瘤初期根毛对结瘤信号的应答反应-根毛变形的比率降低了44.59%、71.43%和80.09%,而在缺乏结瘤因子的情况下,铝对根毛变形无显著的影响;在接种根瘤菌条件下,用2、3、4、5、6!mol·L-1Al处理48h后,根毛变形率分别减少了24.54%、33.18%、51.82%、63.05%和67.86%。这些结果说明,在铝胁迫下根毛变形受阻可能是铝抑制结瘤信号传递的结果。     

6种根瘤菌系统发育分析及其耐硒能力

【目的】研究不同硒含量土壤中生长的紫云英和大豆共生根瘤菌种类和硒耐受能力。【方法】采用涂布平板法从植物根瘤中分离根瘤菌,提取根瘤菌总DNA,进行16S r DNA扩增、克隆与测序,并建立系统发育树进行分子系统发育分析。再将各菌株在不同浓度含硒平板上进行培养,以菌落变红为临界条件,筛选各菌株的硒耐受能力。【结果】(1)从高硒土壤上生长的紫云英和大豆根瘤中分离纯化得到5个根瘤菌菌株,从低硒土壤上生长的大豆根瘤中分离纯化出1个根瘤菌菌株。(2)6个菌株分属4个不同的属别,竹山、炼铁湾、渔塘坝紫云英根瘤菌供试菌株归属土壤杆菌属(Agrobacterium)、低硒大豆根瘤菌供试菌株归属慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、高硒大豆根瘤菌供试菌株归属中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、曾家紫云英根瘤菌供试菌株归属根瘤菌属(Rhizobium)。(3)竹山、炼铁湾、渔塘坝紫云英根瘤菌耐硒能力均为6μg/m L,曾家紫云英根瘤菌耐硒能力为5μg/m L,低硒、高硒大豆根瘤菌耐硒能力均为3μg/m L。【结论】在高硒自然环境(竹山、炼铁湾、渔塘坝、曾家)下生长的根瘤菌有较强耐硒能力,紫云英根瘤菌的耐硒能力高于大豆根瘤菌。     

超慢型大豆根瘤菌的分离和初步鉴定

1982年从辽宁省铁岭地区的风沙干旱盐碱地区的野生大豆(Glycine soja) 根瘤中分离得到一个大豆根瘤菌的新类群——超慢型大豆根瘤菌。此类群与快生型和慢生型大豆根瘤菌一样,在栽培大豆上结瘤良好,并能固氮。但不在草木樨、豌豆、紫云英、百脉根等豆科植物上结瘤,可在绿豆上结瘤并能测出固氮酶活性。生理生化特性上有许多特性与另外两群有较大差异,已进行的初步鉴定表明,主要表现在:(1)菌落如针尖大小,直径≤1mm:(2)在根瘤菌标准培养基上产碱能力强。据对超慢型12个菌株液体培养,生长5天pH达7.72～8.09,而所测定的慢生型大     

紫云英根瘤菌的质粒特征及内源抗药性

对22个野生型紫云英根瘤菌菌株的质粒和抗性基因的研究结果表明,不同紫云英根瘤菌菌株都含有1-4个数量不等的质粒,其分子量变幅在18.5-300Kb之间。大部分野生型分离菌具有不同程度的抗庆大霉素,卡那霉素,四环素和链霉素的能力;其中抗庆大素和抗卡那霉素的能力超出一般快生型根瘤菌的许多倍。对菌株HR104的热处理消除试验结果表明,抗庆大霉素的因子与其中的一个巨型质粒(p104c)相关。用消除质粒p104c的突变株回接寄主植物仍能够形成有效根瘤,说明该质粒的存在与共生固氮过程无关。     

缺磷调控水稻根毛生长发育的机制

通过水培试验,研究了正常供磷(300μmol·L~(-1))和缺磷(0μmol·L~(-1))处理下水稻根毛生长、根系分泌物中独脚金内酯含量和根系中生长素水平的变化以及施加外源独脚金内酯和生长素及其抑制剂对水稻根毛生长发育的影响。结果表明,与正常供磷处理相比,缺磷胁迫下水稻的根毛和根系分泌物中的独脚金内酯含量显著增加,而根系中的生长素含量则显著降低。在缺磷条件下施加外源独脚金内酯合成抑制剂(Abamine)能够抑制根毛的生长;施加外源生长素(IAA)对根毛的生长发育没有影响;施加Abamine和IAA条件下水稻根毛的生长情况与单独施加Abamine条件下相似,在正常供磷条件下施加外源独脚金内脂(GR24)能够增加根毛数量,施加生长素运输抑制剂NPA根毛数量没有变化,施加GR24和NPA条件下水稻根毛的生长情况与单独施加GR24条件下相似。由此可以推断,缺磷胁迫下独脚金内酯可能作用于生长素的下游来调控水稻根毛的生长。     

豌豆根瘤菌共生质粒pJB5JI对费氏中华根瘤菌共生固氮作用的影响

通过两亲本接合转移,将豌豆根瘤菌T83K3共生质粒pJB5JI转入费氏中华根瘤菌HN01及其质粒缺失突变株中,获得8个转移接合子,其中受体为HN01和pSfrHN01a缺失突变株HND28的接合子能够在大豆上形成有效根瘤,无论是人工传代还是与植物共生,外源质粒pJB5JI与受体菌内源质粒均能稳定存在,但不能在豌豆上结瘤,与大豆共生固氮能力和竞争结瘤能力与受体菌亲本相比没有明显变化.消除共生质粒的突变株HND29和共生质粒与pSfrHN01a质粒均消除的突变株HND100作受体菌的接合子,既不能在大豆上结瘤,也不能在豌豆上结瘤.研究结果表明,pJB5JI与HN01的3个质粒属于不同的不相容群.pJB5JI在HN01中的表达功能可能受到受体菌的共生质粒和染色体基因的共同影响.     

抗姜瘟病菌芽孢杆菌的诱变改良

为改良拮抗姜瘟病菌的芽孢杆菌,从未发病土壤分离得到1株对茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)等8种病原菌具有较强拮抗能力的蜡状芽孢杆菌菌株L1.为进一步改进该菌的拮抗活性,采用紫外线(UV)、甲基磺酸乙酯(EMS)、吖啶橙等诱变因素对L1菌株进行诱变改良.结果表明:改良后菌株的拮抗性能显著提高,其中菌株EMS-2和UL-1的拮抗蛋白浓度分别比L1菌株提高30.38%和29.18%,其差异均达极显著水平;L1对UV照射十分敏感,尤其在前60 s,而90 s的照射处理正突变率最高,达24.8%;吖啶橙处理L1后,没有筛选到发生正突变的菌株;L1在EMS处理80 min后,致死率达到90%左右,因此,为大量获取正突变菌株,应采用较低剂量的EMS(0.16 mol?mL-1)、长时间处理程序(60 min为宜).     

翻压紫云英条件下化肥配施生物炭基肥对水稻Cu吸收转运的影响

针对稻田土壤重金属Cu污染问题,在翻压紫云英条件下,探究化肥与生物炭基肥配施对土壤-水稻系统Cu吸收及转运的影响。采用盆栽试验,设置5个施肥处理:对照(CK,不施肥)、常规施氮(CN)、紫云英+氮肥(CNG)、紫云英+有机肥+氮肥(CNGO)、紫云英+生物炭基肥+氮肥(CNGC)。研究了不同施肥处理对早稻五优156生长和重金属Cu吸收特性的影响。结果表明:与CN相比,CNG在无污染和污染土壤中水稻籽粒产量分别提高47.1%和50.1%;与CNG相比,CNGC在无污染和污染土壤中水稻籽粒产量分别提高4.5%和12.8%。单施化肥条件下水稻植株体中Cu的总吸收量最大,且水稻根部Cu含量最高;在污染土壤中,CNG处理下水稻糙米存在一定的重金属污染风险,而在CNGC处理下糙米中Cu含量低于相关食品卫生标准(≤10.0 mg·kg~(-1))。进一步研究表明,翻压紫云英能提高Cu从根向秸秆的转运能力,而在污染土壤条件下Cu从秸秆向谷壳的转运能力会受到抑制。在污染土壤中CN处理下Cu有效态含量最高,CNGC处理比CN处理土壤Cu有效态含量降低39.4%,比CK处理降低17.6%。研究表明,翻压紫云英条件下化肥配施生物炭基肥可以提高水稻产量,抑制水稻对Cu的吸收和转运,降低水稻籽粒中Cu含量,适宜在重金属Cu污染稻田施用。     

紫云英根瘤菌的分离与鉴定

从采自福建各地紫云英的根瘤中分离出具有一般根瘤菌特征的菌株18株,在对其进行初步细菌学特性鉴定的基础上,利用16S rDNA进行序列分析,确定其系统发育地位.鉴定结果为:YX、Z3、GZ与ZK1为中慢生根瘤菌属Mesorhizobium菌种,B3、XZ、M6与百脉根中生根瘤菌Mesorhizobiumloti可能为同一菌属的不同变种;ZLH2为黄单孢菌属Xanthomonas菌种;M3、M10、ZK7、ZQH、B4、B7为土壤杆菌属Agrobacterium菌种;B6、B5、B1、Z1为根瘤菌属Rhizobium菌种.为了进一步考察各鉴定菌株的结瘤情况,利用琼脂试管法和水培法将部分菌株与紫云英闽紫品种(1号、5号、6号、7号)和80410411品系进行配对结瘤,研究结果不仅进一步阐明了紫云英根瘤菌的系统发育多样性,并且通过对比琼脂试管法和水培法在结瘤结果上的异同,为探究紫云英与不同根瘤菌结瘤能力的差异提供了一种简便可行的研究方法.     

基于Image J软件的水稻根毛长度测量

以体视镜拍摄的水稻(Oryza sativa)中旱5号(ZH5)和珍汕97(ZS97)的主根照片为研究对象,利用图像分析软件Image J建立了一种全新的水稻根毛长度测量方法。在不同的培养时间和培养条件下,分别对位于水稻主根不同部位根毛的长度进行统计,得到一组最优的水稻根毛的测量方法和测量条件。用所建立的水稻根毛长度测量体系,对两组肉眼观察根毛长度无明显差异的水稻品种进行了测量,结果表明,此种方法可以检测出两个水稻品种间根毛长度的差异。     

利用EMS筛选豆科模式植物百脉根的根瘤突变体及突变部位

豆科植物百脉根是研究共生固氮体系的模式植物之一,被根瘤菌感染后形成根瘤,根瘤菌固定氮素变换成铵态氮,植物利用铵态氮进行营养生长,而根瘤菌利用植物供给的碳酸同化产物为能源。为获得根瘤的成熟、维持的基因,本研究利用化学诱变试剂EMS处理百脉根MG-20得到多种突变体,筛选根瘤成熟、维持有异常的突变植株,利用SSR标记和dCAPS标记进行基因定位。结果表明:约10万M2百脉根植株中获得nup85突变体2株,nup133突变体4株,pollux突变体6株,ccamk、symrk、castor、nin、nfr1、nfr5突变体各1株等不结瘤突变体(Nod~-)18株;结无效根瘤突变体(Fix~-)6株并确定了突变体的突变部位。     

苦马豆抗盐愈伤组织突变系的筛选

为获得苦马豆抗盐愈伤组织突变系及筛选抗盐系的适合盐浓度,采用苦马豆子叶外植体在添加1.79 mg/L 2,4-D和1.15 mg/L Kt的MS培养基上诱导的愈伤组织为材料,经不同盐浓度(100,200,280 mmol/L)条件下胁迫,并测定其在不同时间(0,3,6,9天)胁迫处理后的可溶性蛋白含量、SOD和POD活性及丙二醛与脯氨酸含量等生理指标,以确定筛选抗盐系的适合盐浓度.验证性试验显示,200 mmol/L NaCl胁迫下比100 mmol/L胁迫获得的抗性愈伤组织的数量多,而280 mmo儿胁迫下无抗性愈伤组织产生,表明获得苦马豆抗盐愈伤组织突变系的适宜盐浓度为200mmol/L NaCl.     

快生型大豆根瘤菌的研究——Ⅲ.湖北ZA1等11个菌株的互接种族关系试验

前人的研究已经指出,快生型大豆根瘤菌可超越大豆族的范围,在豇豆和绿豆上结瘤,但不与三叶草、草木樨、紫云英、碗豆、菜豆和花生等豆科植物结瘤共生。为了全面了解湖北省土壤中分离的11个菌株的性能,继研究其生理生化特性,固氮活性和竞争性能之后,又进了本项试验,兹简报如后。材料和方法11株快生型大豆根瘤菌由本校生物固氮研究室从湖北等地土壤中分离。紫云英根瘤菌、苜蓿根瘤菌、三叶草根瘤菌、羽扇豆根瘤菌均由我校微生物专业菌种保藏室提供。花生根瘤菌97-1由中国农科院油料作物研究所提供。碗豆根瘤菌NO300,菜豆根瘤菌NO3622-15由王长霖同志提供(引自英国洛桑试验站)。     

紫云英根瘤菌分子遗传学研究进展

总结了紫云英根瘤菌分子遗传学研究进展。这类根瘤菌的寄主范围较窄，早先根据互接种族概念将其定名为Rhizobium astragali。后来定名为Rhizobium huakuii。最近并入Mesorhizobium属，对大量菌株进行的16S和23SrDNAPCR-RFLP分析和代表菌株的部分16SrDNA碱基测序，揭示了7个不同基因型，表明这类菌具有遗传多样性。可以认为存在不同的种，它们都有质粒，数量1-5个，因菌株而异，可分为不同质粒型。共生基因常定位在最大的一个质粒上，即共生质粒，它们的结瘤基因具有独特结构。采用包括nodA,nodB。noC,nodD的苜蓿根瘤菌突变株进行基因互补，从紫云英根瘤蓖基因文库中获得了相应的转移接合子，这类结瘤基因的这种结构在7个基因型的菌株中都是一致的，说明结瘤基因的保守性。     

减量化肥配施紫云英对稻田土壤碳、氮的影响

以11 a(2008—2018年)长期定位试验为对象,研究了减施40%化肥下紫云英不同翻压量对双季稻产量及土壤活性有机碳、氮(DOC+MBC、DON+MBN)的影响,以探讨紫云英替代化肥的可行性和适宜翻压量。试验设置CK(不施紫云英和化肥)、GM_(22.5)(单施紫云英22.5 t·hm~(-2))、100%CF(常规施肥)和减施40%化肥(60%CF)条件下将紫云英翻压量设为15、22.5、30、37.5 t·hm~(-2)4个水平,共7个处理。于2018年晚稻收获后采集土壤样品,分析土壤微生物量碳、氮(MBC、MBN)和可溶性有机碳、氮(DOC、DON)。结果表明:与常规施肥相比,减施40%化肥下各紫云英不同翻压量处理早稻及全年两季稻谷产量持平或略有增加,且均随紫云英翻压量增多而提高。紫云英翻压量为15～30 t·hm~(-2)时,晚稻稻谷产量随紫云英翻压量的增多而提高,当紫云英翻压量多于30 t·hm~(-2)时,则呈下降趋势。除翻压紫云英15 t·hm~(-2)外,其他紫云英与化肥配施处理晚稻稻谷产量与常规施肥相比无显著差异;与常规施肥相比,紫云英与化肥配施均不同程度地提高了土壤MBC、MBN、DOC、DON含量。紫云英翻压量为15～22.5 t·hm~(-2)时,土壤MBC、MBN、DOC、DON均随紫云英翻压量增加而增加,当翻压量多于22.5 t·hm~(-2)时呈下降趋势;MBC/SOC和MBN/TN均随紫云英翻压量的增加呈先增加后降低的趋势,MBC/SOC在60%CF+GM_(22.5)处理最高,MBN/TN以60%CF+GM_(30)处理最高。DOC/SOC和DON/TN均在60%CF+GM_(15)处理最高;相关分析结果表明,土壤MBC、MBN、DOC、DON、DOC+MBC、DON+MBN与土壤有机碳(SOC)、全氮(TN)呈极显著正相关(P0.01)。土壤各活性有机碳、氮与早、晚稻及全年两季稻谷产量均呈极显著正相关(P0.01)。综合考虑双季稻的产量效应及土壤培肥效果,在本试验条件下或与该试验区域气候特点和种植制度类似的南方水稻主产区,在减少40%化肥条件下,紫云英翻压22.5～30 t·hm~(-2)较为适宜。     

系列玉米雄穗突变系的创制

通过对野生型玉米自交系(A378)离体花粉生殖细胞N-甲基-N亚硝基脲处理所得M1～M2群体的雄穗性状的筛查,创制出3种类型的玉米雄穗突变系。结果显示,与A378相比,第1类型雄穗突变系具有无分枝、主轴发育不良、无花粉的性状;第2类型雄穗突变系显示主轴退化、主轴与分枝上部分小穗雌化的性状;第3类型雄穗突变系具有正常发育的主轴与短小簇生的分枝。这些雄穗突变性状在M2群体中均出现表型分离现象。其中,1份雄穗雌化突变系具有显性性状,别的突变系均具有隐性性状。这些玉米突变系有望用于玉米雄性生殖器官发育与性状表达遗传机制的研究。     

产β-甘露聚糖酶菌株育种及培养基优化

利用实验室筛选保藏最高酶活为10.7 U/mL的白腐真菌作为出发菌株,进行紫外诱变育种及培养基优化,以期提高菌株产β-甘露聚糖酶能力.结果表明,紫外诱变条件为孢子悬液浓度106～107个/mL,诱变时间10 min,此条件下的孢子致死率达78％,获得了13株正向突变株,经6代遗传稳定性试验证明UV-2突变株酶活最高,遗传稳定性最强,比出发菌株酶活提高了2.075倍.通过单因素试验确定了该突变株的最佳碳源、氮源分别为魔芋粉和硝酸铵,对酶活影响较大的无机盐为磷酸二氢钾.通过正交试验,确定了最佳产酶培养基为魔芋粉4.0 g/L、NH4NO3 5.0 g/L、KH2PO4 5.0 g/L、NaCl 1.0 g/L、MgSO4·7H2O1.0 g/L,在此条件下测得甘露聚糖酶最大酶活为46.17 U/mL,比优化前提高了40.3％.