猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定、致病性与药敏试验

从湖北省几个猪场具有严重呼吸道症状的疑似病例中,采集了肺脏、扁桃体、关节液及心包液等病料,进行了细菌的分离培养及菌落形态观察、染色镜检、生化试验、PCR检验、血清型鉴定、药敏试验及致病性试验.结果表明,分离到的8株细菌为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP).血清型分型鉴定结果为1型的6株,3型的2株.药敏试验结果显示,分离的菌株对头孢类、先锋霉素类表现较高的敏感性,为猪场用药提供了科学参考.     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定

从江西省猪场病死猪肺脏中分离到三株胸膜肺炎放线杆菌。本试验对分离菌株的理化特性进行了测定，并用分离菌株制备了灭活疫苗，有效控制了菌株分离场的猪传染性接触性胸膜肺炎。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白对小白鼠的最适免疫剂量

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型外膜蛋白为试材,分别用1、4、7、10、13、16、19、22、25μg/只的剂量对80只30日龄的小白鼠进行攻毒试验,结果其对小白鼠的最适免疫剂量为16μg/只。     

胸膜肺炎放线杆菌的PCR诊断方法研究

采用胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)外膜脂蛋白Om/A基因序列合成了1对特异性引物,建立了用于检测App的PCR方法.结果表明:经过PCR扩增,3株App分离株均能扩增出长约950 bp的预期DNA片段,而大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella sp.)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、葡萄球菌(Staphylococcus sp.)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、变形杆菌(Proteus sp.)和链球菌(Streptococcus sp.)等与猪病有关的8种病原菌均为阴性;App DNA最低检出浓度可达55.0 ng/mL,且试验结果与传统的生化反应鉴定结果完全一致,符合率达100%,证明此方法特异性和敏感性强,可用于猪传染性胸膜肺炎的快速诊断.     

猪放线杆菌性胸膜肺炎的诊治

猪放线杆菌性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌引起的一种伴有胸膜炎的出血性坏死肺炎．可发生于仟何年龄的猪只,呈世界性分布。     

猪胸膜肺炎放线杆菌基因组文库的构建

由猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起的猪传染性胸膜肺炎是猪最重要的呼吸道传染病之一。为研究该细菌表面蛋白的结构与功能,选取APP代表菌株,提取其基因组DNA,用TSPS091随机消化成3～8kb的片段并回收,连接到预先消化的入ZAPⅡ载体上,经过包装、扩增和滴定后,成功地构建了APP基因组文库。     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxⅠ对小鼠的致病性及免疫原性研究

将血清10型胸膜肺炎放线杆菌接种于含0.02%NAD、5%犊牛血清、1mMcaCl<,2>的LB液体培养基中培养12h,离心后的上清液经硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶分子筛层析,分离纯化Apx Ⅰ.将纯化的ApxⅠ进行半数致死量测定,并对小鼠剖检后进行内脏器官病理变化观察.将纯化的Apx Ⅰ与弗氏佐剂按1:1的比例混合制备亚单位疫苗,免疫小鼠,初免2周后加强免疫1次,二免2周后用血清10型胸膜肺炎放线杆菌攻毒,测定最佳免疫剂量.根据最佳免疫剂量于30日龄和45日龄免疫小鼠,60日龄时分别用血清1、3、5、7型胸膜肺炎放线杆菌攻毒.结果该毒素对小鼠的LD50为80.9mg/kg,LD50的95%平均可信限为63.2～103.5mg/kg;Apx Ⅰ亚单位疫苗的最佳免疫剂量为40μg,对血清1、3、5、7型胸膜肺炎放线杆菌的攻击具有一定的免疫保护效果.     

鲁西地区猪胸膜肺炎放线杆菌流行病学调查

[目的]为调查鲁西地区猪传染性胸膜肺炎病的流行状况,建立了检测胸膜肺炎线杆菌（Aetinobacillus pleuropnemunoniae,APP）的PCR方法。[方法]利用PCR方法对186头病死猪的病变组织及545头无临床症状健康猪群进行了APP的流行病学研究。[结果]186份病料中APP阳性率占43．0％（80／186）,545份猪血清APP阳性占7．9％（43／545）。[结论]该PCR方法可作为APP临床诊断的重要手段之一。     

免疫磁珠分离胸膜肺炎放线杆菌的研究

为尝试从混合样本中提高胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)的分离率,实验优化各种条件,将多种磁珠的表面连接抗AppS1或S2血清型的IgG,制备成免疫磁珠,测定各种免疫磁珠特异性捕获细菌的富集效果。结果表明各种磁珠均能特异性富集相对应的细菌,与直接分离培养相比,提高混合样本和人工模拟样本中特异性目标细菌的分离率,但各种磁珠的最佳反应体系不同,如磁珠与抗体的结合量、菌液与免疫磁珠的最佳体积比。试验中100μLS1425S磁珠与20μL的IgG结合,菌液浓度为106CFU·mL-1时,100μL菌液与50μL免疫磁珠的作用体系免疫富集效果最佳。这为推广使用免疫磁珠提高App分离率提供科学依据。     

猪胸膜肺炎放线杆菌致病性生物Ⅰ型PCR诊断方法的建立

根据已发表的猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)apxⅣ毒素基因序列的保守区域设计1对特异性引物,建立检测致病性APP 1~12血清型标准菌株的PCR方法。在双盲试验中,血清1型(2株)、3型、5型和7型临床分离株与致病性APP 1~12血清型标准菌株一样,均能扩增出预期大小为876 bp的apxⅣ片段,可检出最低活菌数为2×102cfu.mL-1,最低检出DNA含量为9 pg.μL-1。检测疑似传染性胸膜肺炎感染猪的10份病变肺组织样品,阳性6份,与细菌分离鉴定结果一致。而副猪嗜血杆菌1~15型(缺失8型)、猪放线杆菌、猪源多杀性巴氏杆菌、猪霍乱沙门氏菌、奇异变形杆菌、猪源支气管败血波氏菌、猪丹毒杆菌的PCR检测结果都为阴性。结果表明:该PCR方法可用于致病性APP生物Ⅰ型的快速特异性检测和诊断。     

猪胸膜肺炎放线杆菌16SrDNA基因的克隆及序列分析

为了阐明猪胸膜肺炎放线杆菌16S rDNA基因的遗传变异情况,选择猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的16S rDNA基因设计引物,应用聚合酶链反应(PCR)扩增APP的16S rDNA基因的部分序列,将该产物克隆到pMDI8-T载体上,重组质粒通过菌落PCR鉴...     

胸膜肺炎放线杆菌诊断抗原的制备及初步临床应用

利用14个血清型的胸膜肺炎放线杆菌的标准菌株制备诊断抗原，通过玻片凝集试验，琼脂扩散试验和对流免疫电泳，以标准抗血清作为参考，检验各种诊断抗原的灵敏性和特异性。分别用凝集抗原、超声波处理抗原和酚水抗原对来自湖北、湖南、江西、河南、安徽5省猪场的155份送检血清进行检测。结果表明可以对送检血清快速、准确地进行鉴别诊断和血清分型。     

胸膜肺炎放线杆菌ApxIA N端基因的克隆与原核表达

[目的]为猪接触传染性胸膜肺炎的诊断和基因工程疫苗的研制提供理论依据。[方法]以胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清10型菌株为材料,采用PCR技术对其ApxIA的N端基因进行扩增,将扩增产物转入克隆载体和表达载体中进行克隆和表达,用重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用免疫印迹分析鉴定ApxIAN端基因表达产物的免疫活性。[结果]ApxIA N端基因PCR扩增产物与标准10型ApxIAgene（D16582）的同源性为99.7%。NcoI和HindⅢ双酶切鉴定结果表明,目的基因已成功转入原核表达载体pET-32a中。含重组质粒的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后表达了相对分子量为779 kDa的目的蛋白,该蛋白分子量与标准ApxIA蛋白（Marker）相同。[结论]SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测结果表明,ApxIAN端基因在表达载体中得到高效表达,且表达产物具有免疫活性。     

Cloning and Expression of Actinobacillus pleuropneumoniae Gene Coding for TbpA and Development of an Indirect TbpA-ELISA

This study presents the cloning and expression of gene encoding transferrin-binding protein A from Actinobacillus pleuropneurnoniae in Escherichia coli expression system and the development of an indirect TbpA-ELISA. The gene coding TbpA was amplified from the A. pleuropneumoniae serotype 2 genome using polymerase chain reaction and cloned to pET-28b expression vector under the control of strong, inducible T7 promoter. The recombinant plasmid was expressed in E. coli BL21 （DE3）. The expressed fusion protein was analyzed using SDS-PAGE and Western blotting. The diagnostic potential of recombinant TbpA （rTbpA） was evaluated through an antibody-detection indirect ELISA based on the purified rTbpA. The TbpA antibodies were detectable in mice on day 7 after vaccination with purified rTbpA protein or infection with A. pleuropneumoniae serotype 10 with the TbpA-based ELISA. In addition, the TbpA-ELISA was able to detect 12 serotyping rabbit antisera postinoculation （PI） with A. pleuropneumoniae 12 serotypes experimentally. The comparable result was obtained by detecting the 117 clinical serum samples using, respectively, the TbpA-ELISA and indirect hemagglutination test （IHA） based on multiplex antigen. The result indicates that the TbpA-ELISA was the more sensitive method compared with the Mix-IHA method because of its consistent presence in A. pleuropneumoniae serotypes. In conclusion, the conserved TbpA of A. pleuropneumoniae can be used for the development of a cross-serotype diagnostic method for the detection of antibodies against A. pleuropneurnoniae.     

二温式PCR检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌方法的建立与应用

为了探索简便、快速确诊猪传染性胸膜肺炎的方法,根据猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)apx IV基因序列,设计合成1对特异性引物,建立聚合酶链反应(PCR)检测APP的方法。采用该方法对APP和其他6种猪病病原核酸进行检测,结果只对APP扩增出与预期大小相符的422bp DNA片段,而对其他6种猪病病原核酸的扩增结果为阴性。该PCR最低可检出10pg的APP DNA。对送检的46份可疑病猪组织进行检测,结果有19份样品为阳性,27份为其他病原感染。     

猪胸膜肺炎放线杆菌Ⅱ型分泌蛋白结构与功能的研究

猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起猪传染性胸膜肺炎,是猪的最重要呼吸道传染病之一。通过筛选APP 3～8 kb随机基因组文库,获得1株阳性克隆。测序拯救质粒得到序列,通过BLAST分析确定此片段为APP Ⅱ型分泌蛋白基因,预计成熟蛋白分子量为45.716 KD。根据序列设计特异性引物PCR扩增该基因,分子克隆表达该Ⅱ型分泌蛋白。Western blot结果表明,该蛋白与APP康复期血清发生反应;研究还发现,纯化的Ⅱ型分泌蛋白能结合C3。     

猪传染性胸膜肺炎病原学研究进展

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的,该病是一种呼吸道疾病,影响着全世界养猪业的发展。综述了猪传染性胸膜肺炎的病原学研究进展,为该病的诊断及研究高效的猪传染性胸膜肺炎疫苗提供理论依据。     

Cloning, Expression of apxI Gene of Actinobacillus pleuropneumoniae and Development of ELISA

Based on the published nucleotide sequence of the apxICA of Actinobacillus pleuropneumoniaein Genbank(S4074), a pair of primers were designed. A 3 640 bp(4 687 -8 326 bp)gene fragment was ampli-fied by PCR from the isolated strain of A. pleuropneumoniae serovar 1. Then, it was cloned into pMD18-T,identified by both restriction endonuclease and sequence analysis, and inserted into pET-28a expression vectorto yield the expression plasmid. SDS-PAGE result indicated expression of apxICA in BL21 (DE3), Westernblot analysis showed the protein's immunogenicity. Using the expressed protein, ELISA was established to de-tect serum antibody against ApxI. The feature of ELISA to detect highly virulent A. pleuropneumoniae strainsinfection was proved by primary clinical application.     

猪胸膜肺炎放线杆菌山东分离株的血清型与Apx毒素型研究

 从山东省不同地区采集的85份具有严重呼吸道症状病死猪的肺脏、气管和扁桃体进行胸膜肺炎放线杆菌（APP）的分离鉴定，采用凝集试验和PCR方法对分离菌株进行血清型和APX毒素型的检测。结果从山东省不同地区分离到20株分属5个血清型的APP，其中，血清7型6株、血清5型5株、血清3型4株、血清4型3株、血清8型2株，血清7型、5型为优势血清型。不同地区分离的APP血清型不同，同一地区也存在不同的血清型。PCR检测结果表明，不同血清型的 APP共含有4种溶血毒素(Apx)，其中，血清3、4、8型APP含ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ，血清5型含ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅣ，血清7型含ApxⅡ和ApxⅣ，20株APP分离株均含有ApxⅡ和ApxⅣ两种毒素，表明野毒株的血清型与毒素基因的种类有一定的相关性。毒素序列分析结果表明，相同毒素型APP，其毒素基因序列的同源性在99.5％~100％之间，与血清型无关。致病性试验结果表明，所含毒素类型不同的APP对小白鼠的致病性不同，其中含ApxⅠ和ApxⅡ的血清5型APP毒力最强。该研究为猪传染性胸膜肺炎的免疫预防、亚单位疫苗的研制及基于ApxⅣ的PCR检测奠定了基础。