巴马小型猪和贵州小型猪封闭群的遗传结构分析

巴马小型猪(Bama,BM)和贵州小型猪(Guizhou,GZ)是我国自行培育的2个重要的小型猪封闭群,但长期以来对其群体遗传结构状况并不十分清楚。本试验应用本实验室筛选的32个微卫星位点组合对这2个小型猪封闭群进行了遗传结构分析。结果显示:BM封闭群的平均观察等位基因数和有效等位基因数分别是5.750 0和2.572 7,GZ封闭群的相应参数为6.187 5和3.783 7;2个猪群的平均杂合度分别是0.542 8(BM)和0.697 8(GZ),多态信息含量分别是0.546 9(BM)和0.729 6(GZ)。结果表明:GZ猪群的遗传变异程度略高于BM猪群,但它们都是比较好的封闭群群体,符合封闭群小型猪的遗传要求。     

大约克和二花脸猪5个微卫星座位多态性分析

利用5个微卫星分析了大约克、二花脸两个种群的有效等位基因、期望杂合度、多态信息含量、F-统计量、迁移率等多态性。研究结果表明:各群体的期望杂合度He在0.571 0~0.869 0之间变动;多态信息含量PIC均大于0.5,说明两品种内的遗传变异较大,但F-统计量、迁移率检验结果表明:两猪种之间的遗传结构差异较小。     

广西巴马小型猪近交群体的遗传结构分析

本研究以33头广西巴马小型猪为研究对象,利用19个微卫星标记,通过估算其等位基因数(N)、多态信息含量(PIC )和近交系数(F)等参数,对广西巴马小型猪近交群F10~F15世代进行了遗传学检测。试验结果显示,19个微卫星座位上共检测到31个等位基因,其中F10~F15分别具有27、29、28、27、26和25个等位基因,平均每个位点分别仅有1.42、1.53、1.47、1.42、1.37和1.32个等位基因;6个世代群体平均多态信息含量为0.1044。广西巴马小型猪F10~F15世代的平均近交系数分别为0.8070、0.8263、0.8491、0.8710、0.8904、0.9118。结果表明,广西巴马小型猪近交群体的基因多态性低、近交程度高,是一个遗传性稳定的群体。     

广西巴马小型猪MyoG基因克隆及外显子3多态性分析

为了解RT-PCR扩增广西巴马小型猪肌细胞生成素(MyoG)cDNA序列,并分析与其他物种间的聚类关系,试验采用PCR-SSCP技术分析广西巴马小型猪、长白猪、杜洛克猪、大约克猪MyoG基因外显子3多态性,根据GenBank中已发表的猪MyoG基因序列设计PCR引物,以广西巴马小型猪肌肉组织总RNA为模板进行RT-PCR,所得目的片段经纯化、克隆、鉴定和测序;从4个猪种的耳组织中分别提取30个个体的基因组DNA,采用PCR的方法扩增出外显子3并进行SSCP分析。结果表明:克隆得到广西巴马小型猪MyoG基因编码区长675 bp,与四川野猪、人、奶牛、小鼠同源序列相似性分别为99.7%、93.8%、91.7%、90.5%,且不同物种间保守性较强;与四川野猪相比,克隆得到的广西巴马小型猪MyoG cDNA序列在第233位点及第642位点上发生基因突变;广西巴马小型猪MyoG基因的基因型只有AA型,而长白猪、杜洛克猪、大约克猪MyoG基因的基因型只有AB型,各群体内无多态性。     

广西巴马小型猪动脉粥样硬化模型的制作

本试验旨在制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化模型,初步判断猪发生动脉粥样硬化时的指数值,以期为今后建立相关模型提供依据。试验选取广西巴马小型猪试验组和对照组各10头,通过饲喂高脂高胆固醇饲料建立动脉粥样硬化模型,检测建模过程中血液生化指标,将动脉粥样硬化指数与血管切片作关联分析,初步拟定发生动脉粥样硬化时的指数值。屠宰后血管切片结果显示,试验组有2头广西巴马小型猪发生动脉粥样硬化,对照组均正常。2头广西巴马小型猪的血管切片结果与动脉粥样硬化指数进行关联分析后,初步拟定的动脉粥样硬化指数值在3.8以上,并持续3个月以上。     

四个微卫星标记在苏钟猪中的多态性分析

微卫星标记是近年来发展起来的一种检测基因DNA多态性的新型DNA标记，因其数量多、分布广、多态性丰富及检测方便等优点而倍受推崇。本文利用四个微卫星标记分析其在苏钟猪中的遗传多样性。结果表明，四个微卫星座位在苏钟猪中均存在较高的遗传多样性，基因杂合度为0.5962-0.8823；多态信息含量为0.5146-0.8709；有效等位基因数为2．4768-8．4935。以上结果表明，本研究采用的四个微卫星标记可以作为苏钟猪的遗传多样性的标记辅助选择。     

四个微卫星标记在苏钟猪中的多态性分析

微卫星标记是近年来发展起来的一种检测基因DNA多态性的新型DNA标记,因其数量多、分布广、多态性丰富及检测方便等优点而倍受推崇。本文利用四个微卫星标记分析其在苏钟猪中的遗传多样性。结果表明,四个微卫星座位在苏钟猪中均存在较高的遗传多样性,基因杂合度为0．5962～0．8823;多态信息含量为0．5146～0．8709;有效等位基因数为2．4768～8．4935。以上结果表明,本研究采用的四个微卫星标记可以作为苏钟猪的遗传多样性的标记辅助选择。     

四个微卫星标记在苏钟猪中的多态性分析

微卫星标记是近年来发展起来的一种检测基因DNA多态性的新型DNA标记,因其数量多、分布广、多态性丰富及检测方便等优点而倍受推崇。本文利用四个微卫星标记分析其在苏钟猪中的遗传多样性。结果表明,四个微卫星座位在苏钟猪中均存在较高的遗传多样性,基因杂合度为0.5962～0.8823;多态信息含量为0.5146～0.8709;有效等位基因数为2.4768～8.4935。以上结果表明,本研究采用的四个微卫星标记可以作为苏钟猪的遗传多样性的标记辅助选择。     

云南高黎贡山猪微卫星DNA多态性分析

高黎贡山猪是云南省独特的小型猪种,其肌内脂肪的非饱和脂肪酸和营养必需脂肪酸的含量远高于其他猪种,具有发展优质保健猪肉的良好潜质。本研究选用世界粮农组织（FAO）和国际动物遗传学会（ISAG）联合推荐的20个微卫星位点对高黎贡山猪和杂种群体进行遗传学检测和分析。结果表明：20个微卫星座位在群体中均表现为多态,每位点等位基因数2—5个。群体平均多态信息含量高黎贡山猪为0．6829,杂种群体为0．5924,平均杂合度分别为0．7302和0．6465。     

猪微卫星DNA座位的突变率

为在 3个 F2代猪群体中进行数量性状基因座(QTL)定位 ,本研究检测了 38个微卫星的基因型 ,在总数为6 6 4 36个亲本—后裔传递的微卫星等位基因中检测到 5个突变等位基因 ,这表明每世代每个座位的总突变率为 7.5 2× 10 - 5。突变率与其它因素 (如侧翼区的 GC含量、杂合度、重复数 )之间没有显著关联 (P>0 .0 5 )。详细的测序结果表明 ,5个突变等位基因中的 4个是分别由 1～ 5个重复插入引起的。剩下的一个突变等位基因要么是由 3个重复插入引起的 ,要么是由 30个碱基对的变化引起的 (16个 CT重复的缺失和 1个 CA重复插入 )。在一个微卫星的侧翼区还检测到 1个碱基对的插入。总之 ,这些数据表明在微卫星之间伸展比收缩更普遍 ,突变过程是非常复杂的 ,并不符合严格的逐步突变模型 ,而且在不同座位之间也有差异。     

新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞体外培养体系的建立

利用微量液体组织块贴壁法原代培养分离新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏;通过接触抑制和解除抑制研究该类细胞的增殖潜力,免疫荧光进行鉴定;并通过脂质体介导对分离到的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞分别进行EGFP-N1和DsRed-N1基因转染。结果成功分离到新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞,体外可以大量传代和冷冻,目前已经传至50代以上,生长良好;冷冻复苏和接触抑制解除后仍可以正常培养和传代;细胞免疫荧光检测,波形蛋白表达阳性,角形蛋白表达阴性;转染48h后荧光显微镜下可以观察到绿色荧光和红色荧光,表明瞬时转染新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞可以获得成功,其中转染DsRed-N1基因的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞已经传至60代以上。结果表明,本试验成功建立了新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞的体外培养体系,在体外能稳定培养和传代,并可以成功获得转基因的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞。     

荧光标记微卫星分析广西树鼩群体的遗传多态性

选取10个微卫星位点,结合荧光标记(FAM) PCR扩增技术,运用毛细管电泳检测扩增产物,利用Microsatellite Toolkit、PopGene软件计算遗传相关指标,探讨广西树鼩群体的遗传多态性。结果发现,在10个微卫星基因座中,共检测到64个等位基因,平均等位基因数为6.4个,平均有效等位基因数为3.7892,平均观察杂合度和平均期望杂合度为0.6156和0.6963,平均多态信息含量为0.6367,其中7个是高度多态位点,3个属中度多态位点。此外,在10个微卫星基因座中,有5个位点偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)。结果表明广西树鼩遗传多态性较丰富,所选微卫星位点基本可用于评估广西树鼩群体遗传多样性。     

草原红牛群体中微卫星DNA多态性的研究

选用草原红牛42头作为试验牛群体,经过牛血液基因组DNA的提取、8对微卫星引物的PCR扩增、扩增产物的聚丙烯酰胺电泳分型、UVIBAND计算机凝胶成像分析系统分析各位点等位基因及全部个体的标记基因型、PPAP3.0软件计算基因频率、多态信息含量(PIC)和杂合度等步骤,从分子水平上分析了草原红牛在8个位点的遗传多态性。结果表明,ETH225、IDVGA2、IDVGA46和IDVGA44等位基因数分别为5、4、3和4,多态信息含量分别为0.542 0,0.673 6,0.521 8和0.575 0,这4个位点为高度多态位点。而另4个位点BM2113、BM1824、IDVGA55和TGLA44等位基因数分别2、2、2和5,多态信息含量分别为0.369 8,0.360 4,0.353 8和0.470 8,属于中度多态性位点。8个位点作为遗传标记应用于草原红牛遗传育种研究之中是可行的。     

广西巴马小型猪卵泡抑素的克隆及原核表达

从广西大学巴马小型猪卵巢中提取总RNA，并以其为模板，应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR），在合成的特异性引物引导下，扩增获得广西巴马小型猪卵泡抑素（follistatin）cDNA的全序列，长度为1035 bp。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析，结果表明：广西巴马小型猪卵泡抑素cDNA序列与GenBank中已报道的家猪卵泡抑素同源性高达99.4%。同时，将目的基因插入到原核表达载体pET 32a+多克隆位点中，构建了follistatin的原核表达载体，并转化于大肠杆菌BL21。转化菌经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析，结果表明：试验已成功表达了follistatin的融合蛋白(约58.4 ku)。     

5个猪种CAST基因第二内含子微卫星标记的遗传多态性分析

猪CAST基因第2内含子中存在以GT为核心序列的微卫星座位。分析了长白猪、大白猪、杜洛克猪、马身猪和山西黑猪等5个猪种227个个体在该座位的遗传变异,检测到4个等位基因,分别是A(171bp)、B(179bp)、C(185bp)和D(191bp)。在山西黑猪和杜洛克猪中,等位基因D的频率较高,分别为0.6389和0.5143;在马身猪群体中,等位基因B的频率较高,为0.6310;在大白猪和长白猪群体中,4种等位基因的频率相近,分别介于0.1389～0.3889之间和0.1417～0.3500之间。在所检测的群体中,共有10种基因型,在长白猪和大白猪群体中,纯合子所占比例较高,其遗传纯合度分别为0.6667和0.7037,而在山西黑猪和马身猪中,杂合子比例较高,其遗传杂合度分别为0.6111和0.5476。由于CAST基因是影响猪肉质品质的候选基因之一,推测该微卫星座位可能对肉质品质有一定影响。     

广西巴马小型猪脂联素cDNA的克隆及序列分析

为了克隆广西巴马小型猪脂联素基因的cDNA全序列及序列分析,试验利用引物悬挂延伸PCR法,以基因组总DNA为模板,先分别扩增得到编码脂联素的第2外显子和第3外显子的序列,再以这2个外显子为模板,进行第2轮PCR,纯化连接pMD 18-T载体后转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆体,鉴定后测序.结果表明:经PCR产物测序证明,得到大小与脂联素基因编码序列大小相同的片段,此片段长度为732 bp;同源性比较分析发现,广西巴马小型猪脂联素cDNA序列与GenBank中已报道的家猪脂联素同源性高达99.7%,有2处发生了碱基错义突变.     

广西巴马小型猪BMP2基因克隆、生物信息学及组织表达分析

本研究旨在对广西巴马小型猪骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic proteins 2,BMP2）基因进行克隆及其结构和功能的预测,并检测其在广西巴马小型猪和长白猪中的表达差异。以广西巴马小型猪基因组DNA为模板,通过测序鉴定BMP2基因外显子区的单核苷酸多态性（SNPs）,利用多种生物信息学软件对广西巴马小型猪BMP2基因启动子区、编码区（CDS）、3'UTR区进行了分析,预测分析广西巴马小型猪BMP2基因编码蛋白的基本理化性质、磷酸化位点、O-糖基化位点、跨膜区域、亲疏水性、蛋白质修饰结构、二级结构和三级结构等,并对miRNA结合位点及其相关通路进行分析,绘制了广西巴马小型猪和长白猪的组织表达谱。结果显示,试验成功克隆了广西巴马小型猪BMP2基因CDS区,总共1 188 bp,编码395个氨基酸;与猪参考基因组相比,广西巴马小型猪BMP2基因在G1663A、G1897C发生了同义突变,在C1896T（Pro→Leu）、T1971C（Gly→Ser）、G2000A（Leu→Ser）发生了3处错义突变;在3'UTR区域存在miR-142-5p、miR-129-5p等共13个miRNA结合区域;相似性比对结果显示,广西巴马小型猪与野猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、马、澳洲野犬、家犬、猕猴对应区段的相似性依次为99.92%、91.75%、91.84%、91.92%、91.92%、90.50%、89.43%、90.91%和90.91%;系统进化树结果表明,广西巴马小型猪与野猪的亲缘关系最近,与黄牛的亲缘关系相对较近,与猕猴亲缘关系较远;BMP2蛋白分子质量为44.55 ku,理论等电点为8.37,预测其有12个O-糖基化位点,42个磷酸化位点;预测分析发现该蛋白为亲水性蛋白,且是膜外蛋白。组织表达谱发现,广西巴马小型猪生长板软骨中BMP2基因表达量显著低于长白猪（P<0.05）。该研究为进一步探索广西巴马小型猪中BMP2基因的功能提供了理论基础,也为广西巴马小型猪品种资源的利用提供了重要参考。     

实验用巴马小型猪的遗传多样性研究

为了研究屏障环境下小规模保存实验用巴马小型猪的遗传学背景,试验运用19个微卫星基因座,对长期在屏障环境下封闭饲养的同世代、同父本但不同母本的3窝巴马小型猪(BM/HVRI猪)进行分子群体遗传学检测,计算平均等位基因数(Na)、平均观察杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He),检验Hardy-Weinberg平衡并进行遗传分化分析。结果表明:该群体的Na、Ho和He分别为3.05±0.71,0.703 7±0.019 2和0.574 6±0.023 1,3窝仔猪的He分别为0.558 3±0.029 3,0.552 0±0.037 3和0.549 2±0.030 8,且差异不显著(P>0.05);经完全枚举法检验,A窝和C窝分别有3个和5个基因座偏离Hardy-Weinberg平衡;经U检验,A窝和C窝分别有4个和6个基因座存在杂合子过剩,仅C窝1个基因座表现出杂合子缺失现象。说明该猪群遗传多样性较低,处于低度杂合状态,窝系之间不存在遗传分化。     

广西巴马小型猪IFN-Y基因的克隆和序列分析

将猪外周淋巴细胞进行体外培养,在刀豆球蛋白A(conA)刺激培养15h后,提取培养淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR技术扩增广西巴马小型猪Y-干扰素(IFN-Y)基因,并克隆到PMD18-T载体上,进行测序。测序结果表明,扩增的cDNA全长558个碱基,包含501个碱基开放阅读框架,编码166个氨基酸,分子量为19．42ku。此cDNA与人、牛、山羊、马、狗和鼠的IFN-Y基因核苷酸比较,同源性分别为74．9％,86．5％,86．9％,81％,58．7％和63．3％,与其它猪种的IFN-Y基因核苷酸比较同源性为100％。     

草原红牛及其杂交群体中微卫星DNA多态性研究

选用草原红牛及其与利木赞牛的杂交后代66头作为试验牛群体,提取血液及肝脏基因组DNA,设计8对微卫星引物进行PCR扩增,从分子水平上对草原红牛及其杂交群体8个位点的遗传多态性进行微卫星分析。结果表明,在草原红牛中,ETH225、IDVGA2、IDVGA46和IDVGA44等位基因数分别为5、4、3和4,多态信息含量(PIC)分别为0．5420、0．6736、0．5218和0．5750,这4个位点均为高度多态。而另4个位点BM2113、BM1824、IDVGA55和TGLA44等位基因数分别,2、2、2和5,多态信息含量分别为0．3698、0．3604、0．3538和0．4708,属于中度多态性位点。在杂交牛群体中,BM2113、ETH225、IDVGA2、IDVGA46、ID- VGA44、BM1824、IDVGA55和TGLA44这8个位点的等位基因数分别为4、5、4、4、5、4、4和6,多态信息含量(PIC)分别为0．6432、0．5943、0．6593、0．5794、0．7259、0．6121、0．6120和0．6204,杂合度为0．7034,均属于高度多态性位点。这些微卫星位点作为遗传标记应用于草原红牛遗传育种研究之中是可行的。