瘤胃总甲烷菌实时荧光定量PCR方法的构建

试验构建了瘤胃总甲烷菌实时荧光绝对定量PCR的标准品及标准曲线用于总甲烷菌的定量测定,并提取瘤胃微生物总DNA, 以甲烷菌特异性引物进行PCR扩增, 回收纯化PCR产物,与pBS-T载体连接并转化到大肠杆菌,再用氨苄西林培养基筛选阳性重组质粒, 提取含目的片段质粒DNA, 通过PCR及测序鉴定重组质粒.根据OD值确定浓度, 将梯度稀释的质粒作为模板, 进行荧光定量PCR反应并作出标准曲线.结果表明: 所构建的标准曲线具有很高的相关性(R2=0.992), 并获得了高扩增效率产物.     

实时荧光定量PCR对瘤胃纤维分解菌定量方法的构建

试验构建了白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌及产琥珀酸丝状杆菌等3种瘤胃纤维分解菌实时荧光绝对定量PCR的标准品及标准曲线,以用于纤维分解菌的定量测定。提取瘤胃微生物总DNA,以各菌特异性引物进行PCR扩增,回收纯化PCR产物,与pMD18-T Vector连接并转化到大肠杆菌。用氨苄青霉素培养基筛选阳性重组质粒,提取含目的片段质粒DNA,通过PCR及测序鉴定重组质粒。根据OD值确定浓度,将梯度稀释的质粒作为模板,进行荧光定量PCR反应做出标准曲线。结果表明:所构建的3条标准曲线具有很高的相关性(R2>0.999),并获得了高扩增效率产物(白色瘤胃球菌为101%、黄色瘤胃球菌为98.0%、产琥珀酸丝状杆菌为97.7%),说明成功构建了瘤胃纤维分解菌实时绝对定量PCR的标准品和标准曲线,为定量研究瘤胃纤维分解菌奠定基础。     

实时荧光定量PCR构建BIM基因表达标准品质粒和标准曲线

为了能够快速、准确定量BIM基因的mRNA,试验构建了小鼠BIM基因的标准品质粒和标准曲线,根据Gen Bank中鼠基因编码区保守序列,设计特异性引物,从N2a细胞中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增该基因122 bp的核苷酸片段,经纯化、连接和转化后,提取质粒并进行酶切、测序鉴定,然后将阳性重组质粒10倍递减稀释作为标准模板,通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,建立了BIM标准曲线及直线回归方程。结果表明:产物熔解曲线峰值单一,引物特异性高;标准曲线相关系数r2=0.998,线性关系好。说明成功构建了目的基因BIM的标准品质粒和标准曲线。     

实时荧光定量PCR检测布鲁菌方法的建立

旨在建立实时荧光定量PCR检测布鲁菌的方法。经选取高度保守的具布鲁菌属特异性的BSP31基因设计了一对引物及探针,并采用矩阵法优化反应体系,筛选出引物、探针、dNTP和Mg2+最优浓度配比,同时进行了特异性和灵敏性试验,建立了实时荧光定量PCR检测布鲁菌的方法。该方法可用于对布鲁菌病普查监测及进出境动物及其产品的检验检疫。     

3种瘤胃纤维分解菌实时定量PCR方法的建立

为探索以减毒胞内侵袭菌介导的黏膜免疫对宿主动物胃肠道微生态的影响,本试验以白色瘤胃球菌、黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌3种主要瘤胃纤维分解菌16S rRNA分别设计引物,以山羊瘤胃液提取细菌总DNA,分别扩增3种纤维分解菌目的DNA片段,并连接至pMD-18 T Vector上,经PCR和测序鉴定后,以不同稀释度的重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应。结果显示,扩增得到的3种瘤胃纤维分解菌目的片段与已知菌种相应片段的同源性大于99%;以不同稀释度重组pMD-18 T为模板建立的荧光定量PCR扩增曲线差异明显,绘制标准曲线的相关系数均接近1,熔解曲线均呈单一峰值。因此,本试验成功建立了3种瘤胃主要纤维分解菌的实时定量PCR方法,为减毒胞内侵袭菌介导的黏膜免疫研究奠定了基础。瘤胃纤维分解菌;Real-time PCR;标准曲线;     

实时荧光定量PCR检测猪细小病毒

根据已报道的猪细小病毒基因组序列,设计并合成了引物和探针,从猪细小病毒(PPV)感染的细胞中提取DNA,经PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌JM109,筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行PCR和测序鉴定,表明目的片段已经成功克隆.将104～108拷贝反应的重组标准品质粒进行荧光定量PCR,系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系.动力学曲线分析表明,在该反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度为102拷贝.本方法的建立为猪细小病毒感染的早期诊断奠定了基础.     

实时荧光定量PCR构建绵羊PrP基因标准品质粒和标准曲线

羊痒病是一种传染性的致死性神经退行性疾病,常引起绵羊和山羊发病,该病在欧洲流行了大约250年,但是它的流行病学和传播机制还不是很清楚.正常的朊蛋白（PrPc）不能引起神经退行性病变,虽然目前已经对许多组织的PrP mRNA进行了检测,但是对它的生物学功能还知之甚少,对PrP基因表达的机制尚不清楚.研究显示,不同组织来源的细胞中朊蛋白的表达程度差异很大,主要出现于神经细胞中.PrPc在细胞中的高水平表达可促使PrPc向PrPsc转变,目前的研究中,对绵羊PrP mRNA的转录机制尚未阐释清楚.因此,对绵羊外周和中枢系统PrP mRNA的表达进行定量,有助于探讨各组织器官中的PrP在羊痒病的发生过程中的作用.     

鹿布鲁菌分型实时荧光定量PCR检测方法的建立

鹿布鲁菌病主要是由牛型、羊型和猪型布鲁菌引起的,其他感染型少见,本研究依据布鲁菌的特异性基因BruAB20168、BMEII0466、BR0952上的部分高度保守片段设计猪型、牛型、羊型引物和探针,用于检测并区分鹿源布鲁菌的种型,且优化了反应体系,筛选出引物、探针的最优浓度配比。将扩增产物连接到pUC57载体上,制备标准品及标准曲线,建立鹿布氏菌各分型荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、稳定性、敏感性进行评价。由标准曲线敏感性可知该方法的最低检测浓度分别可达到12、9、8copies/μL,比常规PCR灵敏度高出很多。     

用实时荧光定量PCR技术检测奶牛瘤胃纤维降解菌相对定量方法的研究

为了选择适合反刍动物瘤胃纤维降解菌的实时定量PCR相对定量方法,选用三头安装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛,针对奶牛瘤胃主要纤维降解菌,使用三种实时荧光定量PCR相对定量方法进行比较研究。结果表明：在相同条件下,对于同一个菌株基因的相对定量结果来说,SCF法和Pfaffl,M.W.法检测奶牛瘤胃主要纤维降解菌有很好的相关性（R=0.96～0.99,P〈0.05）;三种方法比较结果显示,SCF法省略了制作标准曲线等一系列试验操作过程,具有准确率高、快速和定量效果较好等特点。     

沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的研制与应用

根据沙门菌保守的fimY基因序列设计合成了引物和TaqMan探针，建立了快速检测沙门菌的实时荧光定量方法，并对反应条件进行了优化，组装成快速检测试剂盒。通过对临床样品的检测，该试剂盒的检测灵敏度达4.5CFU（25μL反应体系），比常规PCR高100倍，而且稳定性良好，至少可以冷冻保存9个月。结果表明，所建立的沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒具有操作简便、快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点，适于大量样品的检测。     

实时荧光定量PCR检测鸡生长激素基因方法的建立

本研究旨在建立定量分析鸡生长激素(Growth hormone,GH)基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法,为鸡GH基因mRNA表达水平的定量分析及探讨其与马立克氏病遗传抗性间关系奠定基础。根据GenBank数据库中鸡的GH基因序列,使用Oligo7软件在该基因保守区域设计合成一对引物并扩增GH基因片段,经回收纯化后连接到pGM-T载体,成功构建了含有GH基因片段的pGM-T-GH标准质粒。在此基础上,通过SYBR GreenⅠ染料法建立了pGM-T-GH重组质粒的实时荧光定量PCR标准曲线及其回归方程,成功建立了实时荧光定量PCR检测鸡GH基因的方法。     

鉴别牛羊布鲁菌实时荧光定量PCR方法的建立

[目的]建立准确、快速检测布鲁菌、羊种布鲁菌、牛种布鲁菌的方法。[方法]以BCSP31作为布鲁菌菌属特异性基因,以IS711插入元件作为布鲁菌菌种特异性标志,设计引物和Taqman探针;分别构建标准阳性质粒模板,将其10倍倍比稀释作多重实时荧光定量PCR标准曲线,评价多重实时荧光定量PCR反应体系的敏感性、特异性、重复性。[结果]建立了鉴别牛种、羊种布鲁菌的实时荧光定量PCR方法,并用该方法对临床样品进行检测。[结论]所建立的多重实时荧光定量PCR诊断方法能够快速、准确地鉴别牛种和羊种布鲁菌。     

胞内劳森菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立用于检测临床粪便样品中胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,L.intracellularis)的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究参考GenBank中发表的L.intracellularis PHE/MN1-00株基因组序列设计50对引物,通过SYBR GreenⅠ荧光染料法PCR验证引物的特异性,针对扩增效率最好的特异性上、下游引物合成相应的TaqMan探针,优化反应条件,对其线性范围、敏感性和重复性进行验证,系统的完成了该方法的建立。结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR方法,特异性强;在靶标核酸为2.95×10¹～2.95×10⁶拷贝/μL区间线性关系良好,相关系数R²=0.998 1,扩增效率为96.51%;最低检测浓度为5拷贝/μL;批间和批内的CV均小于2%,重复性好。使用普通PCR方法与本方法对2020年10月至2021年2月采自江西地区猪场的373份粪便样品进行检测,L.intracellularis的总检出率分别为21.4%(80/373)和27.6%(103/...     

单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)的快速检测方法,本研究以LM iap基因为靶基因设计合成引物及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR快速检测LM的方法。结果显示,对15株试验菌株进行实时荧光定量PCR检测,只有LM菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为6.5 CFU/mL;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的139份样品进行检测,共计检出3份LM阳性样品,与国标法(GB 478930-2010)检测结果一致。该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。     

实时荧光定量PCR技术研究进展及应用

实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术.它利用荧光实时检测PCR反应,具有灵敏度高、特异性强、节约时间等优点.文章就常用的4种方法,即DNA结合染色、水解探针、分子信标和杂交探针的原理和特点进行介绍,同时综述了荧光定量PCR技术在实践中的应用.     

实时荧光定量PCR检测PrP基因表达标准品质粒和标准曲线的构建

对金黄地鼠P rP基因序列进行分析,选择其高度保守区域设计引物,对金黄地鼠各组织提取mRNA,经RT-PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行酶切、PCR和测序鉴定,表明P rP基因保守区段已经成功克隆。将107~102拷贝/反应的重组标准品质粒进行荧光定量PCR,10次重复C t值平均分别为17.50±0.5、21.38±0.2、25.29±0.7、29.12±0.7、31.34±0.4、33.89±0.1,系统自动分析软件显示C t值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系,回归系数为0.998。对动力学曲线分析表明,在该反应体系和反应条件下,该标准曲线的灵敏度为102拷贝/反应。荧光PCR P rP基因表达检测标准品质粒和标准曲线的建立,为检测P rP基因的组织特异性表达和动物传染性海绵状脑病发生的分子机理奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的构建

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7和猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR/PCR扩增,分别扩增出大小为308 bp和417 bp的部分基因片段。用T4连接酶将目的片段与pGEM-Teasy载体系统连接,并转化到大肠杆菌DH-5α株感受态细胞。提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为PRRSV和PCV2的阳性重组质粒。将重组标准质粒10倍系列稀释后作为模板,通过实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR),建立了PRRSV、PCV2的标准曲线及其直线回归方程,并确定其最佳读板温度。该方法具有线性关系好、特异性强、敏感性高、重复性好等特点,为分析PRRSV和PCV2共感染猪体内病毒的绝对含量提供了必要的技术平台。     

猪性控精子纯度实时荧光定量PCR检测方法的建立

研究旨在利用实时荧光定量PCR法检测杜洛克猪性控精子,以期建立一种快速、准确且经济高效的性控精子纯度检测方法。选取位于猪Y染色体上的Y染色体性别决定区（sex-determining region Y,SRY）基因和位于X染色体上的A-激酶锚定蛋白4（A-kinase anchoring protein 4,AKAP4）基因,以猪耳组织样提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增验证引物的特异性,利用胶回收试剂盒进行回收并质粒小提,将获得的两种质粒经检测后稀释至相同浓度（20 ng/μL）,混合构建含有不同比例SRY和AKAP4基因的质粒模板,用于绘制检测精子纯度所用标准曲线的反应模板。分别使用SRY和AKAP4基因特异引物检测3个混合的X精子（P.x_gro1、P.x_gro2、P.x_gro3）和3个混合的Y精子（P.y_gro1、P.y_gro2、P.y_gro3）的纯度。结果显示,用SRY基因特异性引物检测P.x_gro1、P.x_gro2、P.x_gro3精子的纯度分别为91.44%、91.93%、88.99%,P.y_gro1、P.y_gro2、P.y_gro3精子的纯度分别为89.91%、87.31%、88.71%;用AKAP4基因特异性引物检测P.x_gro1、P.x_gro2、P.x_gro3精子的纯度分别为91.44%、91.93%、88.99%,P.y_gro1、P.y_gro2、P.y_gro3精子的纯度分别为89.91%、87.31%、88.71%;卡方适合性检验结果显示,两次检测结果之间差异不显著,表明使用这种方法进行精子纯度检测所得结果准确。本试验通过实时荧光定量PCR法准确检测了经流式细胞仪分选后的精子的纯度,建立了一种利用实时荧光定量PCR法检测猪精液中X精子和Y精子比例的新方法。     

羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

山羊痘和绵羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。为了更快、更准确的诊断该病,本研究根据Gen Bank已经发表的GTPV和SPPV参考毒株(登录号分别为AY077836和AY077832)A29L基因序列,设计合成了1对特异性引物和2条Taq Man探针,同时制备重组质粒标准品。经过反应条件的优化,建立了羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的实时荧光定量PCR方法反应体系的特异性、灵敏性和重复性进行了评价,并用此方法对19份临床样品进行了检测。结果显示:该诊断方法与4种非羊痘病毒不发生交叉反应,并且山羊痘病毒和绵羊痘病毒之间也不发生交叉反应。该方法的重复性试验变异系数均低于2%,并且双重实时荧光定量PCR最低浓度检测限分别为470和440 fg。对标准阳性模板进行定量检测,生成的标准曲线相关系数分别为0.995和0.997。在检测的临床样品中,GTPV和SPPV阳性分别有14和4份,混合感染有1份。结果表明所建立的方法具有良好的特异性,灵敏性、稳定性,可以对GTPV和SPPV进行准确的定量检测。     

布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据布鲁菌BCSP31基因序列设计布鲁菌通用检测引物和探针,建立了布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法。以构建的含BCSP31基因的质粒标准品10倍递进稀释为模板检测其敏感性,结果显示,本方法能检测约10个拷贝的阳性质粒,且标准曲线的线性关系良好。用本方法检测5株不同种的布鲁菌以及猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等4株对照菌。结果显示,5株不同种的布鲁菌均出现典型的"S"型扩增曲线,4株对照菌40个循环内均无CT值出现。用本方法和B4/B5-PCR方法对来自布鲁菌病流行地区3个不同牛场的40份血样、奶样和血清样进行平行检测。结果显示,本方法和B4/B5-PCR方法的结果符合率为80.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的27份样品经本方法检测均为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的13份样本,经本方法检测,其中8份呈阳性,5份为阴性。本方法的敏感性明显高于B4/B5-PCR方法。试验表明,所建立的Cycling探针荧光定量PCR方法具有敏感、特异、稳定等特点,可用于布鲁菌感染的快速检测。