表达狂犬病病毒糖蛋白的复制缺陷型重组腺病毒的构建

利用大肠杆菌内质粒间同源重组的方法,将狂犬病病毒G基因插入腺病毒基因组的E1基因区,构建了带有狂犬病病毒G基因的重组腺病毒质粒。重组质粒经Pme酶切,线性化后转染293细胞,成功获得了均一的复制缺陷型重组腺病毒。荧光显微镜下能观察到重组腺病毒GFP报告基因的表达。用PCR方法证实了重组腺病毒基因组中含有G基因,RT-PCR方法可检测到G基因的转录产物mRNA,Westernblotting方法能检测到重组腺病毒在29细胞中表达的G蛋白。此重组腺病毒在293细胞连续传代10次,PCR方法都能扩增出G基因目的条带。试验结果表明,狂犬病病毒G基因已成功重组到腺病毒基因组中,不但能稳定表达,而且能在重组腺病毒基因组中稳定存在。     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因重组犬2型腺病毒的构建

应用PCR方法扩增出亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的VP1基因，继而构建出真核表达载体pVAX—VP1。再将含有巨细胞启动子CMV的目的基因表达盒连接到穿梭载体pVAX△E3上，筛选出VPl表达盒方向与E3区转录方向一致的重组子，获得转移载体。再经酶切，连接等方法获得重组腺病毒质粒。利用脂质体介导将重组质粒转染DK细胞，转染3次后，细胞出现明显的腺病毒病变。经PCR扩增、测序检测及基因组酶切鉴定，证明该病毒即为重组犬2型腺病毒。命名为CAV2／FMDV。经验证，该重组毒可稳定遗传，其毒价为10^3.5TCID50／mL。     

表达犬瘟热病毒H基因的重组犬2型腺病毒的构建与鉴定

将犬瘟热病毒 ( canine distemper virus,CDV ) H基因表达盒克隆入转移质粒 p VAXΔE3,构建含 CDV H基因表达盒的转移质粒 p VAXΔ E3L PH,用 Nru 和 Sal 分别酶切转移质粒 p VAXΔ E3L PH和犬 2型腺病毒全基因组质粒p Poly2 - CAV- 2 ,将 CDV H基因表达盒定向克隆入 p Poly2 - CAV- 2质粒中 ,构建 E3区部分缺失的包含 CDV H基因表达盒的犬 2型腺病毒重组质粒 p CAV- 2 / CDVL PH。 Asc 和 Cla 对 p CAV- 2 / CDVL PH进行双酶切 ,释放 CAV- 2 /CDVL PH重组基因组 ,利用脂质体将 CAV- 2 / CDVL PH重组基因组与去除 Sal 和 Nru 片段的 CAV- 2基因组两端片段共转染 DK细胞 ,盲传和重复转染 3次 ,4 d后出现典型 CAV- 2病变 ,获得重组病毒 CAV- 2 / CDVL PH。用 CDV H基因特异性引物经 RT- PCR扩增重组病毒 DK细胞培养物 ,能够扩增出相应的核酸片段 ,表明 CAV- 2 / CDVL PH在DK细胞繁殖的过程中能够转录 CDVL P H的 m RNA,重组病毒免疫犬 ,可以诱导犬产生特异的抗 CAV- 2 HI抗体和抗 CDV中和抗体     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白基因重组犬2型腺病毒的构建及鉴定

为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2),本研究将PRRSV GP5蛋白基因表达盒连接于E3区部分缺失的CAV-2全基因组重组质粒pPolyⅡ-CAV-2中,构建重组质粒pPoly-Ⅱ-CAV-2-GP5。并采用PmeⅠ和AscⅠ双酶切和脂质体介导法,将其转染MDCK细胞,获得重组病毒rCAV-2-GP5,经酶切鉴定显示该重组病毒含有目的基因。经RT-PCR检测表明,rCAV-2-GP5能够转录相应GP5蛋白基因mRNA;western blot检测证实GP5蛋白在MDCK细胞中得到表达。体外连续传30代检测表明,rCAV-2-GP5具有良好的遗传稳定性。本实验为PRRSV新型疫苗的研制奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF-2全基因重组腺病毒的构建与鉴定

扩增猪圆环病毒2型的ORF-2全基因(702 bp),将目的片段与缺陷型腺病毒穿梭质粒pacAd5CMV K-NpA连接,构建重组穿梭质粒CMV-ORF-2。将穿梭质粒与骨架质粒pacAd5 9.2-100经限制性内切酶PacI线性化后共转染293T细胞,进行细胞内重组。7~15 d后获重组腺病毒rAd5 CMV-OPFF-2与对照组重组腺病毒rAd5 CMV-GFP。使用293细胞进行病毒增殖,对增殖稳定的rAd5 CMV-ORF-2进行鉴定;rAd5 CMV-OPFF-2 TCID_(50),为10~(7.5/)50μL,用该代次rAd5 CMV-ORF-2进行PCV-2阳性血清中和试验,结果表明,重组腺病毒成功,PCV-2阳性血清不能中和重组腺病毒。     

犬2型腺病毒的分离鉴定

研究旨在通过对采集自辽宁省辽阳某犬专业合作社犬传染性肝炎患犬病料进行分离和鉴定,了解犬腺病毒（CAV）的生物学特性。试验通过分子生物学鉴定、病毒分离、抗性测定、电镜观察、病毒特异性鉴定和动物回归试验等对分离毒株的生物学特性及致病力进行研究。结果显示,通过PCR扩增可得到1 019 bp的特异性的核酸片段,命名为CAV A22株。通过核苷酸序列分析,分离株与GenBank上登录的国内外已发表CAV参考序列的核苷酸序列同源性最高达100%。由遗传进化树可知,分离株与U77082亲缘关系较近,处于同一分支;该分离株可在MDCK细胞上连续传代,病毒含量可达105.5TCID50/0.1 mL以上;电镜观察可见圆形、无囊膜、直径约80 nm的典型病毒粒子。病毒特异性鉴定表明分离株为犬2型腺病毒（CAV-2）。病毒回归试验表明,分离株致病力较弱,加以驯化可成为一株良好的疫苗毒株。     

狂犬病病毒糖蛋白单、双拷贝基因重组腺病毒穿梭载体的构建及表达

提取HEP-Flury株狂犬病病毒RNA,RT-PCR方法扩增糖蛋白G基因,并克隆入pMD18-T载体,进行测序鉴定和序列分析。之后双酶切下G基因,将其亚克隆入腺病毒穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1,经卡那霉素抗性、PCR、双酶切及测序鉴定,获得重组单G腺病毒穿梭载体pShuttle-G。应用PCR方法在G基因末端引入口蹄疫病毒2A自剪切肽序列,并克隆入T载体,同时构建含G基因的T载体,分别双酶切回收以上2片段并将他们定向亚克隆入pShuttle-IRES-hrGFP-1,经系列鉴定,成功构建由2A自剪切肽序列连接双G基因的重组腺病毒穿梭载体pShuttle-dG。转染以上2个表达质粒入Ad-293细胞,荧光显微镜观察到GFP的表达,斑点印迹试验结果显示G蛋白成功表达。     

犬腺病毒2型载体及其应用的研究进展

犬腺病毒2型也称犬传染性喉气管炎病毒,可诱导宿主产生细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫。将外源基因插入犬腺病毒2型早期转录区后可诱导宿主产生低水平的先天免疫,且能够在宿主体内安全、持续、稳定地表达外源基因,为基因转移提供了条件。犬腺病毒2型载体具有安全性和稳定性高、抗原表达能力强、易于进行各种遗传改造操作和携带大片段的外源基因等特点,是目前作为动物疫苗与基因治疗最有发展前景的非人类腺病毒载体之一。犬腺病毒2型载体已经广泛应用于动物疫苗研制、基因治疗等多个生物医学领域。笔者就犬腺病毒2型的分子生物学特性及犬腺病毒2型载体的发展、构建方式及在动物疫苗研制和基因治疗中的应用进行综述,旨在进一步挖掘犬腺病毒2型载体在基因治疗、动物疫苗研制中的作用,以及为下一代犬腺病毒2型载体平台的建设提供理论基础。     

猪圆环病毒2型GD株ORF2基因重组腺病毒的构建及其表达

根据PCV2ORF2基因的序列设计两条引物从PCV2的PK15细胞培养物中扩增出ORF2基因(702 bp).将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,经酶切、测序鉴定筛选出重组质粒pMD-ORF2.将PCV2 ORF2基因克隆入pAdeasy腺病毒载体系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV中,获得重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-ORF2,将重组质粒与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF2,然后用PacⅠ线性化后转染293细胞,在293细胞内包装出重组腺病毒.通过荧光显微镜观察、PCR检测和Western blot检测证明PCV2 ORF2基因在293细胞内获得表达,ORF2多肽具有良好的免疫原性.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白-重组犬1型腺病毒构建及在猪体内免疫特性

本试验根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组GP5蛋白的免疫原性,将PRRSV河北分离株GP5基因的表达盒克隆到犬1型腺病毒的感染性基因组的复制非必需区内,转染MDCK细胞,获得了重组病毒,免疫新生仔猪,分别在免疫后0～12周采集血清,通过ELISA检测证明,猪体同时产生了针对犬1型腺病毒和PRRSVGP5的抗体.说明GP5-重组犬1型腺病毒具有作为蓝耳病疫苗的潜力.     

Generation and efficacy evaluation of a recombinant adenovirus expressing the E2 protein of classical swine fever virus

Classical swine fever virus (CSFV) is the causative agent of classical swine fever (CSF), which causes significant economic losses to the pig industry worldwide. The E2 glycoprotein of CSFV is the main target for neutralizing antibodies. This study was aimed to develop a recombinant human adenovirus type 5 expressing the CSFV E2 gene (rAdV-E2) and evaluate its efficacy in rabbits and pigs. The results showed that the rabbits and the pigs immunized with the rAdV-E2 developed high-level CSFV-specific neutralizing antibodies. The rAdV-E2-immunized rabbits were protected from fever induced by infection with C-strain, which is pathogenic to the rabbit, and the rAdV-E2-immunized pigs were protected from lethal challenge with highly virulent Shimen strain. This indicates that the recombinant adenovirus can be an attractive candidate vaccine for preventing CSF.     

猪瘟病毒E0和E2蛋白融合表达的重组腺病毒构建及免疫保护性研究

为评价重组腺病毒融合表达猪瘟病毒(CSFV)E0和E2蛋白的免疫保护效果,本研究以CSFV基因组为模板,应用RT-PCR扩增E0和E2蛋白的编码基因,通过pET-32a载体将E0和E2基因串联,形成pET-E0-E2重组质粒。用KpnⅠ和NotⅠ双酶切pET-E0-E2得到E0-E2融合基因,定向亚克隆于穿梭载体pAdTrack-CMV中,采用"两步转化法"在细菌内同源重组,构建携带E0-E2基因的重组腺病毒转移载体质粒pAdEasy-E0-E2,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚胎肾细胞(HEK293),成功包装出重组腺病毒(rAd-E0-E2),PCR和western blot检测表明,E0-E2基因已重组于腺病毒基因组中并获得表达。将rAd-E0-E2接种于小鼠和猪,并通过ELISA进行抗体检测。另外,将rAd-E0-E2经肌肉2次(间隔7d)免疫接种6周龄～7周龄猪,3周后用103TCID50CSFV石门株攻毒。结果表明,rAd-E0-E2免疫组6/7头存活,各组织器官带毒时间不超过10d,而非重组腺病毒rAd-CMV免疫组和空白对照组全部死亡,各组织器官均能分离到CSFV。结果提示,rAd-E0-E2能使免疫猪抵抗CSFV强毒攻击,为进一步研制猪瘟基因工程疫苗提供了实验依据。     

表达A型口蹄疫病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达A型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组腺病毒,本研究通过人工合成A型FMDVP1-2A、2B和3C融合基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将目的基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带A型FMDV P1-2A-2B-3C基因的重组AdEasy-1。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得重组腺病毒rAd-A09。经PCR检测,该重组腺病毒在传代过程中目的基因稳定存在,病毒滴度在第8代时可达到108.5TCID50/mL。间接免疫荧光检测和western blot分析表明,rAd-A09在AD-293细胞中产生FMDV的结构蛋白VP0、VP1和VP3。该重组腺病毒的构建为口蹄疫新型疫苗的研究奠定了基础。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因重组腺病毒的构建

为构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)主要免疫原S1蛋白的重组腺病毒,本研究以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,以IBVCK/CH/LHLJ/04V株S1基因为外源插入靶基因,通过细菌内同源重组法构建了一株稳定表达IBVS1蛋白(90ku)的重组腺病毒,命名为rAdV-S1。通过PCR鉴定、间接免疫荧光及western blot检测证实S1蛋白在重组腺病毒中获得表达。对构建的重组腺病毒和亲本腺病毒的生长动力学分析表明,该重组病毒的毒价为108.25TCID50/mL,并且两者在生长动力学方面无显著差异。本研究为动物试验和该重组腺病毒免疫特性的研究奠定基础。     

Two genomic variations in the E1 region of canine adenovirus type 2 strains

We amplified the E1 region of canine adenovirus type 2 genomes by the polymerase chain reaction (PCR) and analyzed the PCR products by using eight restriction endonucleases. Restriction patterns of the E1 region cleaved with HaeIII and RsaI revealed two genomic variations among the canine adenovirus type 2 strains. Although the clinical significance of two distinct genotypes among the canine adenovirus type 2 strains is currently unknown, these genomic variations are well conserved among different strains in each genotype and suggest that the Japanese field strains, with reference to the E1 region, are different from the non-Japanese strains examined.