益生芽孢杆菌B.licheniformis29质粒Pbl29性质的研究

质粒pBL29为闭合环状质粒，酶切分析证明质粒pBL29有大量的单酶切位点，如EcoR I、Sma I、Hind Ⅲ、Bgt Ⅱ、Pst I、Xba I、BamH I等，并根据限制性酶切各片段的分子量作出了质粒pBL29的内切酶图谱。对质粒pBL29进行测序和分析，证明了其大小为3711bp，具有大量的单酶切位点、编码卡那霉素抗性基因以及富含A／T序列的复制起点。     

拟南芥AFP4的克隆、原核表达和纯化及其与ABI5的互作

拟南芥ABI5相互作用蛋白AFP4(ABI five binding protein 4)是植物中的一个小分子蛋白,其表达特性与ABI5相似,受ABA诱导。以拟南芥Arabidopsis thaliana L. (Heyn) cv. Columbia为材料,通过PCR扩增了AFP4基因的完整编码序列。扩增片段插入到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点之间和酵母双杂交载体pGBKT7的多克隆位点EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点之间。将ABI5基因的编码序列插入到酵母双杂交载体pGADT7的多克隆位点EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点之间。重组质粒测序结果表明,所克隆的AFP4和ABI5编码区序列分别与NCBI数据库收录的AFP4基因(GenBank登录号NM_111081.2)和ABI5基因(GenBank登录号NM_129185.3)完全一致。重组原核表达载体含有AFP4片段的重组融合蛋白的理论分子量为53.4 ku。将重组质粒转化至大肠埃希菌表达菌株BL21 Star (DE3)中诱导表达,并经Ni-NTA亲和层析柱分离纯化、SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。将含有AFP4和ABI5的酵母双杂交重组质粒共同转化酿酒酵母AH109中进行酵母双杂交。结果表明,重组融合蛋白在大肠埃希菌E. coli BL21 Star (DE3)中表达的适宜条件为:IPTG浓度为0.4 mmol·L^-1、25 ℃下诱导表达6 h。在上述条件下,重组融合蛋白占细胞破碎后上清液总蛋白的41.6%。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,AFP4融合蛋白在SDS-PAGE分析时呈现单一条带。该条带经过抗6xHis标签肽的抗体分析,呈阳性。该条带经酵母双杂交分析结果表明,AFP4和ABI5在酵母细胞中可以相互作用。     

鹅细小病毒延边株VP3基因真核表达质粒构建

用碱裂解法对鹅细小病毒延边分离株进行GPV基因组DNA提取.根据已发表的鹅细小病毒VP3基因序列,设计1对含有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的引物,以GPV基因组DNA为模板,应用PCR扩增出VP3基因片段,将VP3基因与克隆载体pMD 18-T连接,转化到感受态大肠杆菌BL21中进行克隆.用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切该片段并回收该片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAXI真核表达载体中,获得重组质粒pVAXI-VP3,经PCR鉴定,限制性内切酶双酶切分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性.     

核黄素合酶基因RNAi表达载体的构建

根据拟南芥RS基因的编码序列设计引物,利用PCR技术从pGADT7-RS重组质粒上扩增到RS基因编码区476 bp片段。利用双链RNA介导的基因沉默技术,构建RS基因沉默表达载体,为进一步研究该基因在植物与蛋白激发子HpaGXoo互作中的功能及其作用机制奠定基础。首先将RS基因片段连接到pUCm-T载体上,用Pst I/BamH I和Pst I/Xho I分别对pUCm-RS重组载体进行酶切,得到2个RS基因片段;先后将其连接到用相应限制酶酶切的pBSSK-in载体上,构建成pBSSK-RS-in-RS重组载体,该重组载体中的2个RS片段大小一致,反向重复;最后用Sac I/Kpn I酶切pBSSK-RS-in-RS载体得到RS-intron-RS片段,连入表达载体pCAMBIA1301中,构建成该基因的沉默表达载体。     

猪肌生成抑制素功能区编码基因的原核表达与纯化

根据猪肌生成抑制素基因设计1对引物,PCR扩增出猪肌生成抑制素功能区编码基因片段,将该片段克隆至pGEM-T载体中。重组克隆质粒经序列分析,克隆序列与目的基因序列完全一致。重组克隆质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,目的基因片段克隆到表达质粒径pGEX-4T-1,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,融合蛋白占菌体可溶性总蛋白的18%以上。     

Epstein-Barr病毒胸苷激酶（TK）基因表达质粒的构建

目的：构建高效表达EBVTK的重组克隆体系。方法：以pUC8X为模板，5'-CTGAATTCATG—GCTGGATTTCC-3’及5’CAACTGCAGCCTAGTCCCGATT-3’为引物，用PCR技术扩增出EBVtk基因的DNA片段。EcoR I／Pst I双酶切PCR产物和载体pBV220，T4连接酶使目的基因tk定向克隆至选定质粒pBV220中。结果：重组质粒pBV220-tk经EcoR I／Pst I双酶切后得两条电泳带分别位于1．8kb、3．6kb处；以pBV220-tk为模板，两引物同上进行PCR扩增，产物电泳带于1．8kb处。结论：目的基因tk已定向克隆至质粒pBV220中。     

番鸭源禽1型副黏病毒HN基因主要抗原结构域和V基因融合表达载体的构建

为构建番鸭源禽1型副黏病毒HN主要抗原结构域(HNd)和V基因融合表达载体,经PCR及融合PCR分别从重组质粒pMDHN和pMDP中扩增HN基因主要结构域和V基因cDNA.将HNd经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切、V基因用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,分别定向插入真核载体pcDNA3的多克隆位点相应的酶切位点中,对2个单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV进行酶切和测序鉴定.利用融合PCR技术扩增出HNd-V基因,定向克隆至pcDNA3的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切酶切位点之间,转化感受态细胞后,经PCR反应初筛后,对阳性克隆进行酶切分析及测序鉴定.对单表达重组质粒进行酶切分析及测序鉴定,结果表明:HNd和V基因已被正确定向克隆至真核表达载体peDNA3,成功构建了2个基因的单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV;对融合重组质粒酶切分析和测序鉴定表明,HNd-V融合基因正确克隆进真核表达质粒pcDNA3中,成功构建了融合表达载体pcDNAHNd-V.     

Myo5a特异性片段原核表达重组质粒的构建

为了构建Myo5a特异性片段的原核表达重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a,采用PCR扩增出Myo5a基因特异性片段的蛋白编码序列,经BamH I和Xho I双酶切后,将片段插入原核表达载体pGEX-4T-3,构建重组子PGEX-4T-3/Myo5a。最后重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a经鉴定完全正确。     

新城疫病毒Mukteswar株F基因重组pGAPZα-F的构建

以RT-PCR扩增新城疫病毒Mukteswar株F基因F1片段和F2片段,以核酸内切酶Kpn I和Xba I对目的基因片段及质粒pCAPZαA进行酶切,连接酶切产物,转化E. coli DH5α.以PCR方法确定Mukteswar F1和Mukteswax F2的阳性重组子均为4个.对阳性重组子进行酶切鉴定及序列分析,结果,重组质粒pGAPZαA-F1、pGAPZαA-F2及质粒pGAPZαA的酶切电泳条带与试验设计大小相符;基因测序得到的重组子中F1和F2序列长度分别为1 198 bp、269 bp,与新城疫病毒Mukteswar株F基因序列比对,其序列长度和核苷酸排列完全一致.结果表明重组质粒中目的基因片段的核苷酸序列、大小和插入位置是正确的,为以酵母表达系统表达F1和F2,研究Mukteswar株与基因Ⅶ型毒株之间F蛋白的抗原性差异程度打下基础.     

NDV F与ChIL-18融合基因"自杀性"质粒的构建

根据GeneBank公布的鸡新城疫病毒(NDV)Lasota株F基因和鸡源性白细胞介素18(ChIL-18)基因序列分别设计特异性引物,且在鸡NDV F基因引物上游引入BamH Ⅰ位点、下游引入Sal Ⅰ位点,在Ch IL-18基因引物上游引入Sal Ⅰ位点、下游引入Hind Ⅲ、BamH Ⅰ位点.以鸡新城疫病毒Lasota株RNA为模板RT-PCR扩增其F基因,将F基因插入pMD18-T的BamH Ⅰ与Sal Ⅰ位点中.同时扩增上游带有Sal Ⅰ位点、下游带有Hind Ⅲ、BamH Ⅰ位点的ChIL-18基因,并将其插入到含有F基因的pMD18-T质粒的Sal Ⅰ、Hind Ⅲ位点之间,从而使NDV F基因与ChIL-18基因形成具有一个完整阅读框的融合基因,然后将融合基因片段定向克隆到pSFV单一启动子(CMV)下游,构建成F-ChIL-18融合基因重组"自杀性"质粒pSFV-F-ChIL-18.     

禽流感病毒PA基因的原核表达载体的构建及鉴定

以重组质粒pcDNA-PA为模板扩增PA全基因,并构建原核表达载体pGEX-6p-1-PA。根据GenBank公开发表的禽流感病毒PA基因的序列设计引物,用PCR方法从重组质粒pcDNA-PA中扩增禽流感病毒的PA基因,将该基因定向插入到原核表达载体pGEX-6p-1中,然后将连接产物转化宿主菌DH5α,挑取阳性克隆进行PCR和BamHⅠ、NotⅠ双酶切鉴定并测序。测序结果表明,禽流感病毒PA基因全长2151 bp,编码717个氨基酸,原核表达载体pGEX-6p-1-PA已构建成功。从而为禽流感蛋白PA的表达及其多克隆抗体的制备奠定了基础。     

大菱鲆hepcidin抗菌肽基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

通过同源克隆结合RACE的方法从大菱鲆(Scophthal mus maximus)肝脏中克隆了大菱鲆hepcidin抗菌肽基因全长cDNA(GenBank accession number AY994074)。大菱鲆hepcidin基因cDNA全长778bp,包含有1个273bp的开放阅读框,编码1个长90氨基酸的前体肽。将大菱鲆hepcidin抗菌肽基因的成熟肽序列重组至原核表达载体pGEX-4T-1中,用IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示在29ku处有特异性蛋白条带出现,表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,融合蛋白约占总蛋白的26%。Western-blotting分析发现表达的融合蛋白可以特异性地与GST抗体相识别。这些结果表明大菱鲆hepcidin抗菌肽基因成功实现了原核表达。     

鹅副粘病毒M基因主要抗原位点片段的原核表达及鉴定

根据GenBank中发表的GPMV SF02株M基因核苷酸序列设计合成一对引物,通过RT-PCR扩增JS/1/97/G0株M基因主要抗原位点片段M1,将其克隆入pMD18-T载体,序列测定和分析表明,所扩增的M1基因核苷酸长为444 bp,共编码148个氨基酸.将M1同载体PGEX-6P-1连接后,转化入E.coli BL21(DE3)PlysS,经IPTG诱导表达出目标蛋白,与预计相符.对表达的M1蛋白进行Western blot鉴定,表明所表达的M1蛋白可以与GPMV SF02株阳性血清发生特异性反应.     

蜡梅花香基因SAMT的cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

[目的]研究蜡梅花香基因SAMT cDNA的克隆及表达。[方法]以蜡梅花瓣总RNA为模板进行RT-PCR,扩增得到与预期大小相同的PCR产物带,回收RT-PCR产物,将其与PMD18-T载体进行T-A克隆连接并导入大肠杆菌DH5α,经菌落PCR和双酶切鉴定,筛选带有目的基因的重组质粒并进行测序。[结果]测序证实成功克隆得到蜡梅花香基因SAMT cDNA的ORF片段,其长度为1 196 bp,编码380个氨基酸残基,与已报导的蜡梅SAMT(ABU88887)的同源性为99.2%。将SAMT基因亚克隆到原核表达载体PGEX4T-1中获得重组菌种命名为PGSAMT,用0.01 mol/L的IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,SAMT的融合表达蛋白分子量约为66 kDa,与预期的26 kDa的GST带和42.3 kDa的蜡梅SAMT基因编码蛋白构成的融合蛋白大小接近。[结论]该研究成功克隆并表达蜡梅花香基因SAMT。     

蜡梅花香基因SAMT的cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达(英文)

[目的]研究蜡梅香基因SAMT的cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达。[方法]以蜡梅花瓣总RNA为模板进行RT-PCR,扩增得到与预期大小相同的PCR产物带,回收RT-PCR产物,将其与PMD18-T载体进行T-A克隆连接并导入大肠杆菌DH5,经菌落PCR和双酶切鉴定,筛选带有目的基因的重组质粒并进行测序。[结果]测序证实成功克隆得到蜡梅花香基因SAMTcDNA的ORF片段,其长度为1196bp,编码380个氨基酸残基,与已报导的蜡梅SAMT(ABU88887)的同源性为99.2%将SAMT基因亚克隆到原核表达载体PGEX4T-1中,转化大肠杆菌DH5α获得其原核表达菌株pGSAMT;采用0.01mol/L的IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,SAMT的融合表达蛋白分子量约为66kDa,与预期的26KDa的GST带和42.3KDa的蜡梅SAMT基因编码蛋白构成的融合蛋白大小接近。[结论]该研究成功克隆并表达了蜡梅花香基因SAMT。     

猪生长激素cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

用逆转录－聚合酰链式反应（RT－PCR）方法，从猪脑垂体总RNA中扩增出编码猪生长激素（GH）成熟及基因序列，定向克隆至质粒pUC18，序列分析表明，克隆的猪GH cDNA长573bp，不含信号肽序列，并在该序列之前加入一起始密码子ATG。将猪GHcDNA定向克隆至原核表达载体pBV220，构建成重组GH基因表达载体pBVpGH7。SDS－PAGE和薄层扫描分析表明：经42℃诱导，pBVpGH7在大肠杆菌中可表达一分子量约2200的特异蛋白，表达量约占细胞总蛋白的20．5％。     

枣树水通道蛋白基因生物信息学分析及原核表达载体的构建

利用生物信息学软件对已获得的枣树水通道蛋白基因cDNA序列ZjPIP2(DDBJ/EMBL/GenBank的注册号为:AB530493)进行了同源性及功能位点等多项参数分析,结果表明,此序列为全长846 bp的开放读码框(ORF),编码281氨基酸,分子量为29.87 kD,理论等电点为8.77;具有膜蛋白(MIP)家族典型的保守氨基酸序列HINPAVTFG和2个NPA保守肽段。序列相似性分析表明,该蛋白与已知的其他12种植物膜蛋白中的水通道蛋白具有极高的同源性,属于水通道蛋白的质膜膜内蛋白PIP2类。三级结构预测表明,其与菠菜(Spinacia oleracea)水通道蛋白(1z98A)有相似的三维结构。以克隆载体pSPORT1携带的枣树水通道蛋白基因cDNA序列为模板,PCR扩增后,经BamHⅠ和SalⅠ消化,与pET28a载体进行重组连接,测序结果显示,其原核表达载体构建成功。此结果为研究枣水通道蛋白基因在植物组织的分布、生物学功能以及可能的活性调节方式奠定了基础。     

奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素cDNA的克隆及原核表达

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。本研究通过RT-PCR方法从奥利亚罗非鱼丘脑中扩增出长约400 bp的目的序列GnRH,并将其克隆到T载体中,经酶切鉴定、序列测定分析后表明其与尼罗罗非鱼和乌颊海鲷具有较高的同源性,处于同一个进化分支上;而与日本青、金鱼、拟鲤、壁虎等的同源性较低。将此cDNA片段定向克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH,转化到大肠杆菌TB1中,0.3M IPTG诱导4 h后成功表达出与预期大小相符的约56 kD的融合蛋白。表明大肠杆菌表达系统可以成功地体外表达奥利亚罗非鱼GnRH,为进一步制备抗体了解其免疫调节作用奠定基础。     

欧李八氢番茄红素合成酶cDNA克隆、序列分析及在大肠杆菌中的功能表达

 【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis（Bge）Sok]八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,最大开放读码框为1 194 bp,可编码398个氨基酸,命名为ChPSY。核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在70%和65%以上,并且发现欧李PSY的N末端存在1—55个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在37—58和219—240氨基酸区域包含2个跨膜结构域。SDS-PAGE分析表明,原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,相对分子量约为45.8 kD。通过大肠杆菌异源表达证实ChPSY可编码一个功能蛋白,促进工程菌株中β-胡萝卜素含量增加。【结论】该研究成功地克隆了欧李PSY cDNA全长并在大肠杆菌中功能表达,为进一步研究该酶蛋白特性和欧李果实类胡萝卜素的合成机制奠定了基础。     

鲮胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA的分子克隆和序列分析

采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法，从鲮肝脏总RNA中扩增出胰岛素样生长因子-I（IGF-I）基因，克隆至质粒PUGm-T。测定该基因序列，推导其编码的蛋白质序列。克隆的鲮IGF-IcDNA编码序列包括信号肽、B、C、A、D和E6个区域，共161个氨基酸残基。与鲤IGF-I比较，信号肽由44个氨基酸残基组成比鲤少17个，成熟肽核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为95.2%和100%,E区域分析结果表明，克隆的鲮IGF-I序列属于IGF-I Ea-2亚型。