猪流行性腹泻免疫病理学研究Ⅲ.人工感染仔猪免疫器官SmIg~ B、ANAE~ T淋巴细胞的动态观察

对以猪流行性腹泻病毒吉毒株(PEDV-J)按种的10头仔猪肠系膜淋巴结、脾脏,特别是肠粘膜Peyer集合淋巴结的SmIg~ B淋巴细胞及ANAE~ T淋巴细胞进行了动态观察。结果表明,PEDV—J毒刺激仔猪既可产生全身免疫反应,又可产生局部免疫反应,且肠道粘膜局部免疫反应早于全身免疫反应。     

复方中草药免疫增强剂对断奶仔猪T淋巴细胞亚群的影响

T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8在免疫调节中起重要的作用，是医学上判别免疫缺陷的重要参数，国内采用中药对断奶仔猪T淋巴细胞亚群的影响未见报道，本试验旨在以断奶仔猪为研究对象，通过在断奶仔猪日粮中添加中草药，采用酸性α-醋酸萘酯染色法（ANAE法）测定T淋巴细胞转化的情况和用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群的含量以探讨中草药对断奶仔猪免疫功能的变化情况，为精制中草药饲料添加剂的临床推广应用提供科学依据。     

TNFRSF1A基因CpG岛甲基化与基因表达及T淋巴细胞亚群指标的相关性分析

旨在探讨TNFRSF1A基因CpG岛的甲基化水平,阐明该基因甲基化与基因表达及T淋巴细胞亚群性状的关系。本研究以抗病力强的华北型黑猪大蒲莲猪和抗病力相对较弱的引进猪种长白猪的仔猪为试验群体,通过亚硫酸氢盐处理后测序法(BSP)探求TNFRSF1A基因上游CpG岛甲基化情况,并将甲基化位点的甲基化频率与基因表达量及T淋巴细胞亚群性状进行相关性分析。结果表明:1)TNFRSF1A基因起始位点附近预测到2个CpG岛(Island),跨这2个CpG岛进行BSP测序后共发现25个CpG位点,其中Island 1和Island 2中各有9个CpG位点,其余位于2个CpG岛之间。Island 1的甲基化频率在大蒲莲和长白猪两群体间差异不显著(P0.05),Island 2的甲基化频率大蒲莲猪群体显著高于长白猪群体(P0.05)。2)Island 2中甲基化频率与ΔCt值成正相关,即甲基化频率与基因表达量成负相关,其中+126、+128、+159、+162和+164是重要的甲基化位点。3)两个猪群体中位于Island 2的+159和+164位点与CD4+CD8+CD3+指标显著正相关(P0.05)。Island 2中+159和+164位点甲基化频率与基因表达量成负相关,而且这2个位点又与T淋巴细胞亚群CD4+CD8+CD3+显著正相关,笔者推测,大蒲莲仔猪TNFRSF1A基因+159和+164位点的甲基化频率增加,可能导致TNFRSF1A基因表达量下降,影响T淋巴细胞亚群性状,从而影响机体的免疫水平。     

日粮共轭亚油酸对断奶仔猪外周血和回肠免疫反应的影响

试验旨在研究日粮添加共轭亚油酸(CLA)对断奶仔猪外周血和回肠免疫反应的影响。36头28 d断奶仔猪随机分配到2个处理组,分别饲喂基础日粮和2%CLA日粮,每个处理组6个重复,每个重复3头猪,试验期为28 d。结果表明:与对照组相比,CLA组仔猪的饲料增重比降低了6.29%(P<0.05),但2组仔猪的日增重没有显著差异(P>0.05)。日粮添加CLA对56 d仔猪外周血CD4+、CD8+亚群的百分数和淋巴细胞转化率均无显著性的影响(P>0.05),但与对照组相比,CLA组仔猪回肠派亚氏结(PP)、回肠上皮内CD8+淋巴细胞亚群百分数和回肠内容物分泌型免疫球蛋白A(SIgA)的含量分别提高了15.54%(P<0.05)、20.05%(P<0.01)和28.57%(P<0.05)。本研究表明日粮添加CLA对仔猪回肠免疫反应具有调节作用。     

宫内生长迟缓仔猪T细胞的发育研究

研究旨在探讨从出生到断奶不同日龄宫内生长迟缓(IUGR)猪T细胞的发育变化情况。选用体重相近和配种期相同的达兰初产妊娠母猪30头,分娩时从每窝仔猪中挑选1头正常体重猪和1头IUGR猪,分别在1、7、14、21、28日龄时屠宰取胸腺,分离T细胞,通过流式细胞仪测定CD3、CD4、CD8T细胞的数量,每个日龄6个重复。结果表明:出生后第1天IUGR仔猪与正常仔猪的CD4+CD8+细胞(双阳性T细胞)占总T细胞的百分比差异显著(P<0.05);出生后第7天IUGR仔猪与正常仔猪的CD4细胞占总T细胞的百分比差异极显著(P<0.01);后期各细胞亚群之间没有差异。结果提示,子宫内各种因素的综合影响能造成出生后早期IUGR仔猪T细胞亚群发育不完善,这就从T细胞亚群的发育方面解释了IUGR仔猪免疫力低的原因。     

米糠多糖对免疫抑制鸡外周血CD4~+和CD8~+ T淋巴细胞亚群的调节作用

为探讨米糠多糖对免疫抑制鸡免疫功能的调节作用,采用流式细胞技术检测了环磷酰胺和传染性法氏囊病毒诱导免疫抑制鸡在服用米糠多糖(剂量为150 mg/kg)和不服用米糠多糖情况下,外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群数量的动态变化。结果显示,米糠多糖能够抑制环磷酰胺和传染性法氏囊病毒处理鸡外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞数量的降低;提高健康雏鸡外周血中CD4+T淋巴细胞比率,对CD8+T淋巴细胞作用不明显。     

糖萜素对固始鸡免疫器官发育及T淋巴细胞亚群的影响

应用流式细胞仪技术检测固始鸡CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞含量来研究添加不同剂量的糖萜素对固始鸡免疫器官及T淋巴细胞亚群的影响。结果表明,500、700 mg/kg糖萜素组的免疫器官指数及CD4⁺／CD8⁺比值显著(P<0.05)高于其余各组。因此,一定剂量的糖萜素可以促进固始鸡免疫器官发育,提高T淋巴细胞亚群的水平。     

板蓝根多糖对缺乳仔鼠免疫器官发育及T淋巴细胞亚群的影响

应用流式细胞仪检测缺乳仔鼠CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞含量,研究添加不同剂量的板蓝根多糖(RIP)对缺乳仔鼠免疫器官及T淋巴细胞亚群的影响。结果表明,RIP可以提高缺乳仔鼠胸腺指数和脾脏指数,对胸腺指数和脾脏指数效果最佳的RIP剂量随日龄增大而减小;RIP可以增加缺乳仔鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞数量,CD3+T淋巴细胞数量在7-28日龄时,A、C、D组与B组差异显著(P0.05);CD4+T淋巴细胞数量在7-21日龄时,A、C、D组与B组差异显著(P0.05);各处理组CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞数量以及CD4+/CD8+比值随着日龄的增加有所下降。结果表明,一定剂量的RIP可以促进缺乳仔鼠免疫器官发育,提高T淋巴细胞亚群的水平。     

重组鸡白细胞介素-2对禽流感灭活疫苗免疫增强作用的研究

为研究重组鸡白细胞介素-2(IL-2)对H5N1亚型禽流感灭活苗的免疫效果,将重组IL-2蛋白和禽流感灭活疫苗联合免疫14日龄SPF鸡,免疫后每周测定一次血清抗体效价﹑脾脏T淋巴细胞亚群,最后计算攻毒保护率。试验结果表明:重组IL-2蛋白具有增强禽流感疫苗免疫效果的作用,提高了血清中的抗体水平﹑增加了脾脏T淋巴细胞CD4+﹑CD8+亚群数量。     

板蓝根多糖对缺乳仔鼠免疫器官发育及T淋巴细胞亚群的影响

试验应用流式细胞术检测缺乳仔鼠CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞含量来研究添加不同剂量的板蓝根多糖(RIP)对缺乳仔鼠免疫器官及T淋巴细胞亚群的影响。结果表明:①RIP可增加缺乳仔鼠胸腺指数和脾脏指数。对胸腺指数和脾脏指数效果最好的RIP剂量随日龄增大而减小。②RIP可以增加缺乳仔鼠外周血CD3⁺、 CD4⁺ 、CD8⁺ T淋巴细胞数量。7~28日龄时初乳组(A组)、缺乳+中RIP组(C组)和缺乳+高RIP组(D组)3组CD3⁺ T淋巴细胞含量与缺乳组(B组)相比差异显著(P<0.05)。7~21日龄时初乳组(A组)、缺乳+中RIP组(C组)和缺乳+高RIP组(D组)3组CD4⁺ T淋巴细胞含量与缺乳组(B组)相比差异显著(P<0.05)。各处理组CD3⁺、 CD4⁺、CD8⁺ T淋巴细胞含量及CD4⁺/CD8⁺比值随着日龄的增加有所下降。适宜剂量的RIP可促进缺乳仔鼠免疫器官发育,提高T淋巴细胞亚群的水平。     

金银花复方制剂对人工感染NDV雏鸡免疫器官T淋巴细胞及其亚群以及B淋巴细胞的影响

为了研究金银花复方制剂对人工感染NDV雏鸡免疫器官T淋巴细胞及其亚群以及B淋巴细胞的影响,本试验以21日龄雏鸡为研究对象,随机分成感染组、中药治疗组、空白组。中药治疗组饮水给予复方金银花制剂。应用流式细胞仪检测技术,细胞培养技术研究了金银花复方制剂对人工感染NDV雏鸡免疫器官(胸腺、脾脏、腔上囊)T淋巴细胞及其亚群以及B淋巴细胞的影响,旨在揭示金银花复方制剂对人工感染NDV雏鸡免疫器官细胞免疫和体液免疫功能的影响及其机理。研究结果发现,金银花复方制剂能够提高人工感染NDV雏鸡免疫器官胸腺及脾脏CD3~+、CD4~+T淋巴细胞百分率,使CD4~+/CD8~+T淋巴细胞值升高,提高免疫器官脾脏及腔上囊B淋巴细胞百分率,表明金银花复方制剂能够提高雏鸡的免疫功能。     

复方中药超微粉对哺乳期仔猪T淋巴细胞亚群及细胞因子的影响

将30头健康临产母猪(大白×长白)随机均分为I、Ⅱ、Ⅲ组。I组为对照组;Ⅱ、Ⅲ组为试验组,在预产期前3天分别在饲料中加拌0.75%和1.5%比例中药超微粉(d<30μm)。母猪产仔后将仔猪按照母猪的分组分为Ⅰa、Ⅱa、Ⅲa组,在仔猪7、14、21日龄分别从各组仔猪中抽取5头仔猪进行采血进行T淋巴细胞亚群和细胞因子检测。结果表明,两试验组仔猪CD4⁺显著提高(P<0.05)、CD4+显著提高(P<0.05)、CD4⁺/CD8+/CD8⁺有升高趋势;IL-2、INF-γ较对照组差异显著(P<0.05);1.5%剂量试验组TNF-α含量与对照组差异显著(P<0.05)。     

激动素对衰老模型小鼠外周血T淋巴细胞亚群及免疫力的影响

为了研究激动素对衰老模型小鼠外周血T淋巴细胞亚群及免疫力的影响,将昆明系小白鼠分为青年对照组、衰老模型组和激动素低、中、高处理组,衰老模型组和各激动素处理组小鼠背部皮下注射125 mg/(kg·BW)D-半乳糖制造衰老模型,低、中、高激动素处理组分别腹腔注射浓度为5、10、20mg/(kg·BW)的激动素溶液,青年对照组不作处理。检测各组小鼠外周血T淋巴细胞亚群的变化、红细胞结合C3b受体(C3b R)和免疫复合物受体(ICR)的能力以及胸腺、脾淋巴细胞的凋亡情况。结果显示,不同浓度的激动素可提高衰老模型小鼠的外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的百分比,提高RBC-C3b R花环率,降低RBC-ICR花环率,降低胸腺、脾淋巴细胞凋亡率,表明激动素能够提高小鼠机体免疫力,延缓免疫衰老。     

沙门菌对猪部分血液指标的影响

将16头猪随机分为2组,以猪霍乱沙门菌为致病菌对猪只进行攻毒,检测猪外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群及血清尿素氮(SUN)和类胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的变化情况。结果显示,沙门菌感染后血清SUN显著降低,而对IGF-1影响不显著;攻毒后CD4+和CD8+T淋巴细胞数急剧下降。     

蛋氨酸缺乏对雏鸡盲肠扁桃体T淋巴细胞亚群和细胞因子的影响

为了研究蛋氨酸缺乏对雏鸡盲肠扁桃体T淋巴细胞亚群和细胞因子的影响,试验选取100只1日龄健康Cobb(科宝)雏鸡分为对照组和蛋氨酸缺乏组,分别采食对照日粮和蛋氨酸缺乏日粮,试验期为42 d,分别于14、28和42日龄对雏鸡进行剖检,取盲肠扁桃体样品进行酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测T淋巴细胞亚群和细胞因子。结果表明:与对照组相比,蛋氨酸缺乏组中盲肠扁桃体CD3+、CD3++CD4+、CD3++CD8+以及CD4+/CD8+比例均显著或极显著降低(P0.05或P0.01)。细胞因子白介素2(IL-2)、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF-α(LITAF)的含量及mRNA表达水平也呈现不同程度的下降(P0.05或P0.01)。说明蛋氨酸缺乏会导致盲肠扁桃体T淋巴细胞亚群和细胞因子下降,进而影响雏鸡的特异性免疫功能。     

传染性支气管炎病毒结构蛋白免疫鸡对CD4+CD8+T淋巴细胞亚群的影响

为了比较传染性支气管炎病毒3种主要结构蛋白免疫鸡后对CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的不同影响.本试验以pVAX1载体为携带工具,制备分别含有IBV主要结构蛋白基因的质粒免疫健康雏鸡,采用流式细胞仪(FACS)对免疫鸡外周血中CD4+、CD8+T淋巴细胞数进行检测.结果显示:各试验组间,携带N蛋白基因的质粒在免疫后3周内CD4+T淋巴细胞数和CD8+T淋巴细胞数均高于其他组,且差异极显著(P＜0.01).由此可见,IBV的N蛋白可明显诱导CD8+T淋巴细胞的CTL免疫作用和CD4+T淋巴细胞的辅助性免疫作用,其细胞免疫原性高于S1蛋白和M蛋白.     

黄芪多糖和灭活H9N2亚型禽流感病毒对C57BL/6小鼠外周血T、B淋巴细胞影响的研究

为了评价黄芪多糖作为疫苗佐剂的潜力,试验用黄芪多糖和灭活的H9N2亚型禽流感病毒免疫C57BL/6小鼠,将20只小鼠均分为4组,第1组为黄芪多糖组(免疫黄芪多糖),第2组为灭活H9N2亚型禽流感病毒组(免疫灭活H9N2亚型禽流感病毒),第3组为混合组(免疫黄芪多糖和灭活H9N2亚型禽流感病毒),第4组为生理盐水组(注射生理盐水),通过淋巴细胞增殖试验和流式细胞术对C57BL/6小鼠外周血淋巴细胞的增殖反应、B淋巴细胞和T淋巴细胞的变化及T淋巴细胞亚群比值变化进行研究。结果表明:混合组对小鼠外周血淋巴细胞的增殖有促进作用,可以提高小鼠外周血B淋巴细胞和CD~+_3CD~+_4T淋巴细胞亚群比例,并对小鼠外周血T淋巴细胞亚群有调节作用。说明灭活H9N2亚型禽流感病毒与黄芪多糖混合时具有协同作用。     

原花青素A-1体内外对猪与小鼠T淋巴细胞亚群的影响

为研究从碎米花杜鹃叶中分离得到的化合物原花青素A-1（Proanthocyanidin A-1，简称PAA-1）的免疫增强活性，初步从细胞水平上探讨其免疫增强机制。体外试验采用流式细胞术，检测PAA-1体外对小鼠脾淋巴细胞T细胞亚群CD4和CD8单阳性和双阳性T淋巴细胞亚群百分率及CD4+/CD8+比值；体内试验通过饲喂不同剂量的PAA-1后，检测试验猪外周血淋巴细胞CD4和CD8单阳性以及CD4+/CD8+比值。结果证明，体外试验中同阴性对照组相比，PAA-1能单独或协同Con A提升具CD4+、CD8+及CD4+CD8+表型的T淋巴细胞亚群百分率，提高CD4+/CD8+的比值；体内试验中饲喂中、高剂量的PAA-1的试验猪外周血中具有CD4+、CD8+表型的T淋巴细胞的百分率及CD4+/CD8+的比值均有显著提高。说明PAA-1可通过增加辅助性T淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞数量、促进T淋巴细胞的成熟以及增加CD4+/CD8+的比值发挥增强细胞免疫的作用，为其进一步开发为新型免疫增强剂提供试验依据。     

初生重对新生梅山仔猪免疫功能的影响

本试验旨在研究初生重对新生梅山仔猪免疫功能的影响。选取正常初生重(NBW)和低初生重(LBW)新生梅山仔猪各6头,不喂食母乳,出生6 h内颈动脉放血致死。结果表明:1)LBW组新生梅山仔猪的体重、脾脏重和相对脾脏重均显著低于NBW组(P0.05)。2) LBW组新生梅山仔猪血液中CD+4 T淋巴细胞比例、CD+4/CD+8均极显著低于NBW组(P0.01),CD+8 T淋巴细胞比例极显著高于NBW组(P0.01)。3) LBW组新生梅山仔猪脾脏中T淋巴细胞比例极显著低于NBW组(P0.01),CD+3 T淋巴细胞比例极显著高于NBW组(P0.01)。4) LBW组新生梅山仔猪胸腺中白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-4(IL-4)的基因相对表达量极显著低于NBW组(P0.01)。5) LBW组新生梅山仔猪脾脏和肠系膜淋巴结中CD8的基因相对表达量显著高于NBW组(P0.05),IL-2、IL-4和干扰素-γ(IFN-γ)的基因相对表达量极显著高于NBW组(P0.01)。综上,LBW新生梅山仔猪的免疫功能低于NBW新生梅山仔猪,这与其体内T淋巴细胞分化和功能改变有关。     

流式分析外周血CD4和CD8淋巴细胞样本制备及其分离培养方法

CD是英文cluster of differentiation的缩写,中文意思是“分化抗原”,是表达在细胞表面的分子。这些分子将免疫细胞分成不同的细胞群。细胞表面的标记抗体(例如CD4,CD8)可以用来识别和定量不同细胞群,在免疫毒理研究中,利用流式细胞技术对动物脾脏或外周血中T细胞亚群CD4+T(辅助性T细胞)和CD8+T淋巴细胞(杀伤性T细胞)进行检测,作为评价动物机体的免疫状态方法之一。在此类试验中对不同动物种类将使用合适的单克隆抗体。