猪瘟疫苗病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测猪瘟疫苗病毒(HCLV)含量的荧光定量PCR方法。【方法】用RT-PCR方法扩增HCLV基因200bp片段,构建含有该基因片段的重组质粒,对此重组质粒进行系列稀释后作为SYBR GreenⅠ荧光定量PCR模板,绘制定量检测HCLV的标准曲线。【结果】在(6.4×107~6.4×102)copies/μL模板浓度范围内,荧光定量PCR的扩增效率为92.2%,标准曲线的决定系数为0.9997。该方法的精确灵敏度为640copies/μL,重复性试验的变异系数小于2%,对牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测结果均为阴性。临床检测结果显示,不同商品猪瘟疫苗之间的病毒载量存在明显差异。【结论】建立了1种具有良好特异性与敏感性的HCLV荧光定量PCR检测方法。     

猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中5′端非编码区的靶序列设计了用于TaqMan荧光定量PCR的1对引物及TaqMan探针,以猪瘟活疫苗病毒为模板,在常规PCR的基础上优化了TaqMan荧光定量PCR反应条件,建立了猪瘟病毒（CSFV）TaqMan荧光定量PCR检测方法。其敏感性和特异性试验结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法对CSFV具有很高的特异性,其检测灵敏度可达5.03×10-2μg/μL。说明TaqMan荧光定量PCR适用于CSFV的快速检测。     

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快捷高效的非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测方法,本研究根据GenBank中登录的ASFV B646L基因保守区序列设计引物和探针,通过优化PCR反应体系和反应条件,建立了非洲猪瘟Taqman荧光定量(ASFV-qPCR)检测方法,验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示：本研究所建立的检测方法特异性强,与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应;灵敏度高,能检出10拷贝阳性质粒DNA;重复性好,组内和组间重复试验变异系数均小于1.5%。本研究为非洲猪瘟快速诊断提供了有力技术支撑,为进一步开发ASFV多重荧光PCR检测技术奠定了坚实的基础。     

非洲猪瘟病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)快速、敏感的检测方法,根据GenBank中登录的中国流行株ASFV-SY18的P72基因,建立了SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对所建立方法的灵敏性、特异性与重复性进行了验证。结果显示,所建立的非洲猪瘟病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法能有效扩增1.0～1.0×10~9 copies·μL~(-1)的ASFV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系;检测灵敏度为1.0 copies·μL~(-1);对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数小于1%,重复性良好。     

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR的建立及4种检测试剂盒的比较

为评估目前常用商品化非洲猪瘟荧光定量PCR检测试剂盒,参考OIE推荐的非洲猪瘟病毒(ASFV)荧光定量PCR方法合成引物和探针,建立非洲猪瘟病毒qPCR检测方法(OIE-qPCR);并与市面4种ASFV检测试剂盒进行了比较.以人工合成的ASFV p72基因TA克隆重组质粒为阳性标准品,OIE-qPCR可以检测到10～1...     

针对非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因的TaqMan荧光定量PCR的建立

[目的]建立一种以MGF360-13L基因为靶标的实时荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的方法,为非洲猪瘟(African swine fever,ASF)的诊断、MGF360-13L基因缺失毒株鉴别、病毒分离鉴定、基因功能研究提供技术支持.[方法]首先,以A...     

猪瘟病毒野毒株TaqMan-MGB荧光定量PCR、鉴别方法的建立与应用

 【目的】建立一种快速、敏感、特异地检测猪瘟病毒野毒的一步TaqMan-MGB 荧光定量PCR方法,为临床鉴别猪瘟野毒和HCLV疫苗毒提供了准确可靠的工具。【方法】在猪瘟病毒基因组5′端非编码保守区设计一对猪瘟病毒通用引物和一条特异性MGB探针,通过优化,得到最佳反应体系和反应条件,进行特异性、灵敏度和临床样本符合检验。【结果】该方法在100～10-7范围内线性相关系数为0.998,检测极限达5.3×10-2pg 病毒核酸;对24个质控样本检测结果显示,该方法能检测除猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）以外的猪瘟流野毒株,其它猪相关致病病原检测阴性;对122份疑似猪瘟样本检测的结果与本实验室建立的RT-nPCR方法的符合率为94.3％（115/122）,阳性和阴性符合率分别为86.4％（38/44）和98.7％（77/78）,Kappa值为0.87＞0.75。【结论】建立的一步TaqMan-MGB 荧光定量PCR方法能鉴别猪瘟野毒和HCLV疫苗毒,且特异性好、灵敏度高、与笔者先前建立的RT-nPCR方法对临床样本的检测结果具有高度的一致性。     

鸡传染性支气管炎病毒荧光定量PCR标准曲线的建立

笔者针对传染性支气管炎病毒（IBV）M41株中编码核衣壳蛋白的N基因设计并合成一对引物,通过构建重组阳性标准质粒的方法,成功建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法检测IBV的标准曲线。该方法所建立的曲线可检测到初始模板中5×10^2copies／μL的病毒核酸,与常规PCR相比敏感性大大提高。笔者建立的荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于传染性支气管炎的临床诊断和健康带毒鸡群的检测。     

猪瘟病毒实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速检测猪瘟病毒的基因检测方法,根据GenBank中猪瘟病毒(CSFV)基因组NS2基因序列设计并合成引物和Taq Man探针,通过各项条件优化并以10倍稀释度的质粒为标准品进行实时定量PCR扩增制作标准曲线,建立检测CSFV的实时定量PCR方法。该方法的检测灵敏度可达每微升10个拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高出1个数量级;对标准品质粒检测的线性范围是1.0×109～1.0×101μL-1。对1.0×107、1.0×105、1.0×103μL-13种稀释度的标准品质粒进行重复试验,批内变异系数分别是0.30%、0.85%、0.43%,批间变异系数分别是0.81%、1.36%、0.63%,具有良好的重复性。应用该方法对45份临床样品进行检测,检出26份阳性样品,而常规PCR只检测出19份阳性样品,说明该实时定量PCR方法的敏感性高于常规PCR。可见,该方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,可用于检测病料中的猪瘟病毒。     

非洲猪瘟基因缺失株和非缺失株荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测鉴别非洲猪瘟病毒(ASFV)基因缺失株和非缺失株的荧光PCR鉴别方法,通过查询Genbank数据库中收录的相关基因组序列,应用相关软件设计针对ASFV不同毒株序列的引特异性物,用荧光PCR技术检测ASFV的不同病毒毒株,并对该方法进行敏感性、精密性和特异性试验.结果显示,该方法能在最低1.3×103c...     

A multiplex real-time PCR assay for simultaneous detection of classical swine fever virus,African swine fever virus,and atypical porcine pestivirus

With the implementation of the C-strain vaccine, classical swine fever (CSF) has been under control in China, which is currently in a chronic atypical epidemic situation.  African swine fever (ASF) emerged in China in 2018 and spread quickly across the country. It is presently occurring sporadically due to the lack of commercial vaccines and farmers’ increased awareness of biosafety.  Atypical porcine pestivirus (APPV) was first detected in Guangdong Province, China, in 2016, which mainly harms piglets and has a local epidemic situation in southern China.  These three diseases have similar clinical symptoms in pig herds, which cause considerable losses to the pig industry.  They are difficult to be distinguished only by clinical diagnosis.  Therefore, developing an early and accurate simultaneous detection and differential diagnosis of the diseases induced by these viruses is essential.  In this study, three pairs of specific primers and Taq-man probes were designed from highly conserved genomic regions of CSFV (5´ UTR), African swine fever virus (ASFV) (B646L), and APPV (5´ UTR), followed by the optimization of reaction conditions to establish a multiplex real-time PCR detection assay.  The results showed that the method did not cross-react with other swine pathogens (porcine circovirus type 2 (PCV2), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), foot-and-mouth disease virus (FMDV), pseudorabies virus (PRV), porcine parvovirus (PPV), and bovine viral diarrhea virus BVDV).  The sensitivity results showed that CSFV, ASFV, and APPV could be detected as low as 1 copy mL^–1; the repeatability results showed that the intra-assay and inter-assay coefficient of variation of ASFV, CSFV, and APPV was less than 1%.  Twenty-two virus samples were detected by the multiplex real-time PCR, compared with national standard diagnostic and patented method assay for CSF (GB/T 27540–2011), ASF (GB/T 18648–2020), and APPV (CN108611442A), respectively.  The sensitivity of this triple real-time PCR for CSFV, ASFV, and APPV was almost the same, and the  compliance results were the same (100%).  A total of 451 clinical samples were detected, and the results showed that the positive rates of CSFV, ASFV, and APPV were 0.22% (1/451), 1.3% (6/451), and 0% (0/451), respectively.  This assay provides a valuale tool for rapid detection and accurate diagnosis of CSFV, ASFV, and APPV.     

伪狂犬病病毒gE基因荧光定量PCR检测方法的建立

伪狂犬病病毒(PRV)野毒有gE基因,而其疫苗毒株无gE基因,这为检测有无PRV野毒感染提供参考。用PCR方法扩增PRV的gE基因片段,构建含有PRV gE基因片段的重组质粒。以系列稀释后的重组质粒作为模板,应用SYBR GreenⅠ来进行检测PRV gE基因的实时荧光定量PCR扩增。结果显示:在(6.9×107~6.9×101)copies/μL范围内,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物具有单一整齐的熔解曲线峰,标准曲线具有优良的线性关系。该方法最低可准确检测69copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2%,对PRV-gE基因缺失疫苗毒株和常见猪源DNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明,建立了1种特异性强、灵敏度高、重复性好的检测PRV gE基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可用于PRV野毒感染的定量检测。     

猪瘟病毒Taqman实时定量RT-PCR检测方法的建立和临床应用

根据猪瘟病毒5’非编码区(5’-UTR)设计特异性引物和Taqman探针,建立Taqman实时定量RT-PCR检测猪瘟病毒法。检测结果显示,该方法的灵敏度为1μl 10拷贝,在病毒拷贝数为1μl 108～101时,循环数(Ct)值与拷贝数对数呈现较好的线性关系,且重复性好,批间变异系数小于1%。用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、牛病毒性腹泻病毒,结果均为阴性。用该方法检测采集自江苏和新疆的192份组织和血清样品,猪瘟病毒阳性率为71.9%;检测感染猪的不同脏器,发现在心、肺、肝、肾、脑、脾脏、淋巴结、腹水中均可以检测到猪瘟病毒,与常规RT-PCR方法相比,该方法敏感性更高。该方法的建立为猪瘟病毒的流行病学调查和定量提供了有效手段。     

实时荧光定量PCR法检测草莓镶脉病毒

为了建立一种特异、灵敏、快速检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus,SVBV）的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据已有的检测SVBV的引物信息,合成引物,对不同草莓品种进行PCR扩增。经过克隆、测序及序列比对得到了感染SVBV的阳性植株,利用此植株PCR扩增产物构建重组质粒作为标准品,优化了PCR反应体系,标准曲线的循环阈值（Ct值）与模板浓度有良好的线性关系（R2=0.999 1）;进行了灵敏度和重复性试验,敏感性可达到101拷贝·μL-1,约为普通PCR的1 000倍,重复性好;并与常规PCR方法进行了比较,成功建立了检测SVBV的实时荧光定量PCR法。用该方法检测了部分草莓品种的DNA样品,结果表明,大部分植株都带有SVBV。该方法具有很高的灵敏性和重复性,可用来快速检测草莓植株是否感染SVBV。     

猪传染性胃肠炎病毒荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立1种猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的荧光定量PCR检测方法.[方法]用RT-PCR方法扩增TGEV的N基因片段,构建含有N基因片段的重组质粒,基于SYBR Green方法以不同浓度的TGEV-N基因重组质粒作为模板进行检测TGEV的荧光定量PCR扩增.[结果]TGEV SYBR Green荧光定量PCR的扩增效率为101％,标准曲线的决定系数为0.9997,可准确检测的最低核酸模板浓度为490 copies/μL,重复性试验的变异系数小于3％,对其他3种常见的猪源RNA病毒的检测结果全为阴性,对临床样品的检出率高于常规PCR方法.[结论]建立了1种TGEV SYBR Green荧光定量PCR检测方法,可用于TGE的早期快速诊断.     

3种猪繁殖障碍性病毒Real-time PCR快速检测方法的建立

【目的】建立可同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的多重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank数据库中PRV、PPV和PCV2的核苷酸序列,设计3对特异性引物和探针,以10倍系列稀释的阳性质粒为模板,优化反应条件,建立检测PRV、PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法,并对其敏感性、重复性和特异性进行检验;分别采用单项和多重Real-time PCR方法,对临床收集的42份疑似病料进行检测,比较2种方法的符合率。【结果】特异性和灵敏度试验表明,建立的多重Real-time PCR检测方法具有高度特异性,与其他病原无明显交叉反应;检测灵敏度高,可检出1.0×101拷贝/μL的阳性质粒或1TCID50/mL的病毒样品。用多重Real-time PCR对42份临床疑似病料进行检测,其检测结果与单重Real-time PCR结果完全一致,表明多重Real-time PCR方法是可行的。【结论】建立了可同时检测PRV、PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法,该法具有快速、灵敏、特异和重复性好等优点。     

伪狂犬病病毒gB基因荧光定量PCR检测方法的建立

用PCR方法扩增伪狂犬病病毒(PRV)的gB基因片段,构建含有gB基因片段的重组质粒,以不同浓度的PRV-gB基因重组质粒为模板应用SYBR Green I方法来建立检测PRV-gB基因载量的荧光定量PCR方法。结果显示:在(8.6×107~8.6×101)copies/μL范围内,回归方程为y=-3.5604x+41.165,其决定系数为0.9993,显示出优良的线性关系;扩增产物的熔解曲线仅有一个特异性单峰。该方法对猪圆环病毒、猪细小病毒、猪细环病毒等常见猪源DNA病毒进行检测时均没有扩增曲线,重复性试验的变异系数小于2%,表明建立了特异性强、重复性好、灵敏性高的PRV-gB基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。用该方法检测8种商品伪狂犬病弱毒活疫苗的每头份剂量的病毒载量,结果显示不同商品伪狂犬病弱毒活疫苗之间的病毒载量存在明显差异,与其标识剂量基本一致,表明该荧光定量PCR检测方法可用于疫苗剂量检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立一种定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的荧光定量PCR方法.[方法]用RT-PCR方法扩增PRRSV的N基因片段,构建含有N基因片段的重组质粒,以不同浓度的PRRSV-N基因重组质粒作为模板来进行检测PRRSV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增.[结果]PRRSV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的扩增效率为98.2％,标准曲线的决定系数为0.9995,可准确检测的最低核酸模板浓度为60 copies/μL,重复性试验的变异系数小于3％,对3种常见的猪源RNA病毒的检测结果全为阴性.临床检测显示,PRRS病猪的血清中PRRSV载量极显著(P＜0.01)高于PRRSV亚临床感染猪.[结论]建立了一种可用于PRRSV定量检测与PRRS早期快速诊断的特异性强、灵敏度高、重复性好的PRRSV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法.     

猪细环病毒2型荧光定量PCR检测方法的优化

[目的]优化1种猪细环病毒2型(TTSuV2)的荧光定量PCR检测方法.[方法]对原有引物进行调整设计,以原有重组质粒为模板来重新进行检测TTSuV2 DNA的SYBR Green Ⅰ real-time PCR扩增.[结果]新的TTSuV2 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的扩增效率为99.3％,标准曲线的决定系数为0.998,可准确检测的最低核酸模板浓度为50 copies/μL.与原方法相比较,新方法在熔解曲线、特异性、重复性方面都非常接近,但在扩增曲线方面得到明显改善,其可准确定量检测的灵敏度提高了至少10倍以上,临床检测数据也更加准确可靠.[结论]建立了一种新的准确灵敏度更高的定量检测TTSuV2的荧光定量PCR方法.