转液胞膜AtNHX1基因的白三叶耐盐性研究

以白三叶(Trifolium repens)吸胀种子的子叶为转化体,用根癌农杆菌(Agrobacterium auncfaciens)介导法将拟南芥(Arabidopsis)液胞膜Na /H 逆向转运蛋白基因AtNHX1转入白三叶,经过筛选、分化和再生,得到了具有卡那霉素抗性的转基因植株.对这些植株进行PCR、Southern印迹和Northern杂交分析,结果表明,外源目的基因已经整合到白三叶基因组中并且得到了表达.室内耐盐性试验结果表明,表达AtNHX1的转基因植株总叶面积和地上部分干重都显著高于非转基因对照,说明液胞膜上的AtNHX1基因有助于提高白三叶耐盐性.     

新疆棉花品种的耐盐性综合评价

为了解北疆7种常用棉花品种的耐盐性,通过50、100和150mmol/L 3个NaC l浓度的胁迫处理,在棉花种子萌发阶段进行发芽势、发芽率的测定,在水培条件下对7个品种的生长势进行了比较,并采用隶属函数法进行耐盐性综合评价。根据耐盐性综合评价值得出供试7个棉花品种种子萌发阶段的耐盐性顺序为:新陆早10号新陆早13号新陆早12号新陆早17号新陆早31号新陆早26号新陆早18号;在幼苗生长阶段为:新陆早17号新陆早10号新陆早13号新陆早31号新陆早18号新陆早12号新陆早26号。由此可见,种子萌发阶段与幼苗生长阶段的耐盐性是不一致的,但新陆早10号在2个生长时期的耐盐性均表现较高,而新陆早26号则对盐害表现较为敏感。     

NaCl胁迫对小麦种子发芽率的影响及耐盐性分析

为了研究NaCl胁迫对小麦发芽率的影响,探明小麦芽期的耐盐能力。以宁夏已审定的78个小麦品种和新品系为供试材料,以纯净水处理为对照,设置1、2、3、4、5、6、7 g/kg的NaCl溶液处理,测定其发芽率。结果表明,小麦种子发芽率随着盐浓度的增加而降低。当NaCl浓度≤2 g/kg时,发芽率均保持在80%以上;NaCl浓度为3 g/kg时,发芽率在70%左右;NaCl浓度为4 g/kg时,发芽率降至40%左右;NaCl浓度为5 g/kg时,发芽率降至20%以下;NaCl浓度为7 g/kg时,发芽率接近于零。说明NaCl浓度3 g/kg是小麦芽期耐盐临界值。结合聚类分析,初步筛选出芽期耐中度盐分的小麦品种6份,分别为春小麦品种HJ437、宁春8号、宁春48号、宁春49号,灌区冬小麦品种冬宁春4号、冬育10号。     

毛白杨PtSEP3-1基因启动子的克隆分析及其表达载体构建

SEP（SEPALLATA）类基因属于花器官发育ABCDE模型中的E类基因,拟南芥中的研究表明该类基因可能具有控制花器官形态发育以及激活其它类型基因的功能,是一类花发育过程中的关键基因。因此,研究杨树SEP类基因启动子表达特性对于杨树的开花调控研究具有重要意义。本文根据毛白杨SEP3基因和毛果杨基因组序列设计引物,通过PCR获得了PtSEP3-1,基因上游2000bp的序列。序列分析结果表明该序列具有启动子的基本元件TATA—box和CAAT-box,还包含大量光响应元件ACE、BoxI和Box4等,此外还有脱落酸响应元件ABRE,赤霉素响应元件GARE—motif以及胁迫响应元件HSE、TC—richrepeats等。进一步构建了一个以PtSEP3-1启动子驱动GUS基因的植物表达载体pPtSEP3-1,protest,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。     

毛白杨抗病相关转录因子基因PtWRKY1的表达特性分析

WRKY转录因子作为植物特有的一类重要转录调控因子,广泛参与植物对生物和非生物胁迫的应答反应及形态发育和组织衰老等,已引起人们的关注。本文以前期克隆得到的毛白杨WRKY转录因子基因（命名为PtWRKY1）为研究对象,开展其基因枪介导洋葱表皮细胞瞬时表达、外源信号分子（水杨酸SA,茉莉酸MeJA,脱落酸ABA）诱导表达、转PtWRKY1基因烟草植株的烟草花叶病毒（TMV）接种实验以及抗病相关基因表达的实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析等研究。结果表明,PtWRKY1基因编码蛋白定位于细胞核,SA、ABA及MeJA处理均可诱导PtWRKY1基因表达,但不同诱导因子对PtWRKY1表达量的影响存在一定差异;同时,TMV侵染实验发现外源PtWRKY1表达能增强转基因烟草抗TMV能力,qRT-PCR分析表明PtWRKY1基因及膜保护性酶（POD,SOD,CAT）基因均受TMV诱导而增强表达。本文研究结果可为后续开展毛白杨转录因子PtWRKY1的功能鉴定及应用奠定基础。     

转Na+/H+antiporter(Nhap)基因烟草植株的获得及耐盐性鉴定

Nhap基因编码一种质膜Na /H 逆向转运蛋白,在耐盐方面具有重要的研究价值。实验利用根癌农杆菌(Agrobac-teriumtumefacience)介导的叶盘法将Nhap基因转入烟草(Nicotianatobacum),经PCR和RT-PCR检测已获得转Nhap基因烟草的再生植株。同时从发芽率、存活率、叶绿素含量、Na 含量及耐盐性表现进行了F1代转基因烟草的耐盐性检测。结果表明,转基因烟草的发芽率、存活率、叶绿素含量均较对照高,Na 含量较对照有所下降,并且转基因烟草在200mmol/LNaCl处理下,仍能正常存活、生长,而对照烟草的生长却受到抑制。即转基因F1代烟草的耐盐性得到了显著的提高。     

马铃薯StSnRK1基因过表达提高烟草耐盐性研究

为研究马铃薯蔗糖非发酵-1-型相关蛋白激酶-1基因StSnRK1对于调控植物耐盐性的促进作用,以过表达StSnRK1的烟草株系及野生型为试验材料,研究盐胁迫下StSnRK1对植株生长的影响。耐盐性鉴定结果表明,过表达StSnRK1基因显著提高烟草植株的耐盐性。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析显示,StSnRK1基因显著上调脯氨酸生物合成相关基因(吡咯琳-5-羧酸合酶NtP5CS)、胚胎发育后期丰富蛋白基因(NtLEA5)和活性氧清除系统相关基因(超氧化物歧化酶NtSOD和过氧化物酶NtPOD)。同时,转基因烟草植株的SOD活性、POD活性和脯氨酸含量显著高于野生型烟草植株,丙二醛(MDA)含量和过氧化氢(H₂O₂)含量显著低于野生型植株。由此可见,StSnRK1基因在改良植物耐盐性方面具有重要作用,为耐盐马铃薯生物技术育种提供了理论基础。     

小麦胁迫相关蛋白基因TaSAP12-D的耐盐性分析

胁迫相关蛋白（SAPs）是一类具有A20/AN1锌指结构域的蛋白,在植物中主要参与逆境胁迫响应。为探究小麦胁迫相关蛋白基因TaSAP12-D在耐盐胁迫中的功能,本研究以小麦品种旱选10号为试材,克隆得到TaSAP12-D基因,利用农杆菌瞬时注射烟草叶片进行亚细胞定位,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行不同组织和盐胁迫条件下的表达模式分析,利用蘸花法将TaSAP12-D转化到拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）中并进行耐盐性分析。结果表明,TaSAP12-D基因全长519 bp,编码172个氨基酸,预测蛋白分子量为18.41 kDa,等电点为9.21。亚细胞定位显示,TaSAP12-D在烟草细胞核和细胞质中均有表达。qRT-PCR结果显示,TaSAP12-D在小麦萌发期和幼苗期的胚芽、根和叶中均有表达,其中在幼苗期的叶中表达量最高。在盐胁迫条件下,TaSAP12-D的表达量显著上调。在150 mmol·L-1NaCl处理条件下,过表达TaSAP12-D拟南芥的存活率显著提高,表明TaSAP12-D可以增强转基因拟南芥的耐盐性。另外,在转基因拟南芥中盐胁迫相关...     

三倍体毛白杨PtDRG02基因启动子的瞬时表达分析

本研究利用PCR技术从三倍体毛白杨（（Populus tomentosaxP．bolleana）xP．tomentosa）基因组DNA中扩增获得抗病相关PtDRG02基因的一个启动子区（包括其下游5’端非编码区序列）,命名为Ptp01。以β-葡萄糖苷酸酶（舢）基因为报告基因,构建了PtDRG02基因启动子植物表达载体Ptp01／gus。以根癌农杆菌EHA105及LBA4404感受态细胞为受体,转化植物表达载体Ptp01／gus进行瞬时表达,并对启动子进行了功能活性分析,结果表明该启动子能够驱动gus报告基因在毛白杨叶片组织中表达,但表达强度弱于花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子。     

转碱蓬SsNHX1基因烟草的耐盐抗旱性研究

烟草是重要的模式植物和经济作物,盐害和干旱两种环境因子对其生长发育、产量和品质都危害很大。为了提高烟草的耐盐抗旱性,本研究利用农杆菌介导的遗传转化法在烟草中过量表达了碱蓬液泡膜Na~+/H~+逆向转运基因SsNHX1,对转基因烟草的耐盐及抗旱性进行表型鉴定和各项生化指标的检测,以期得到耐盐抗旱表性良好的SsNHX1转基因烟草。表型分析发现,SsNHX1基因过表达株系L1和L5的抗盐能力比野生型显著提高,表现为盐胁迫条件下仍能保持旺盛的生长且根系的伸长未受抑制。SsNHX1过表达株系在叶片和根系中积累了更多的Na~+和K~+,同时Na~+含量增长速率较快,而K~+含量降低速率较缓,并可维持较高的叶片相对含水量和叶绿素含量,及较低的丙二醛含量和相对电导率。干旱胁迫发现,过表达株系受干旱胁迫程度更小,并在复水后迅速恢复正常生长。同时,过表达株系的丙二醛含量和相对电导率显著低于野生型,且维持了较高的叶片相对含水量及叶绿素含量。这些结果说明SsNHX1基因在烟草中过量表达后,降低了盐胁迫和干旱胁迫对烟草根系及细胞膜的损伤,并通过调节离子含量、降低细胞的渗透势,维持了叶片较高的相对含水量和叶绿素含量,最终提高了烟草的抗盐和抗旱性。     

Ri质粒T-DNA对6年生转基因三倍体毛白杨生长和生理性状的影响

为探索外源基因在成年树木中的表达及稳定性,以转Ri质粒6年生三倍体毛白杨成年树木为材料,以同时种植的未转基因三倍体毛白杨为对照植株,对21个转基因株系和对照植株进行外源基因检测和生长、生理特性测定。PCR检测结果证明,Ri质粒T-DNA上的tms、rolC基因在各转基因株系基因组中稳定存在。转基因株系生长受到不同程度影响,各转基因株系的叶柄长、叶片长、叶片宽度和叶面积均小于对照植株,叶片长宽比大于对照植株;71%的转基因株系树高低于对照植株;81%的转基因株系胸径低于对照植株。转基因株系叶绿素a和叶绿素a+b含量、Fv/Fm值、PI值均低于对照植株。81%的转基因株系叶片内源GA3含量及所有株系叶片的内源IAA含量和IAA/ABA比值均高于对照植株,而86%转基因株系叶片的内源ABA含量低于对照植株。T-DNA能够在三倍体毛白杨成年树木中稳定表达,使植物体内内源IAA和GA3含量提高,生长受到抑制,但不同株系存在较大差异。本研究结果为进一步研究外源基因在植物体内的表达调控机制提供了参考依据。     

毛白杨叶绿体基因启动子和终止子的克隆及其功能鉴定

摘 要：从毛白杨(Populus tomentosa)无性系植株组培苗中提取基因组总DNA，通过合成3对特异性引物，用PCR的方法扩增了包含psbA基因启动子、终止子和16S rRNA基因启动子的叶绿体DNA序列。用BLAST及DNAMAN对克隆序列进行了分析，并结合前人的研究工作，确定了两个启动子Prrn、PpsbA的-35区、-10区以及翻译调控序列等重要调控序列元件和终止子的“TAA”序列。并在序列分析的基础上合成新的引物，准确克隆了毛白杨的叶绿体16S rRNA基因启动子Prrn、psbA基因启动子PpsbA及其终止子TpsbA。利用叶绿体基因启动子的原核表达特性，分别用启动子Prrn（其后添加rbcL基因的RBS序列）和PpsbA及终止子TpsbA分别构建了GFP基因的原核表达载体pSGmT、pPGmT，并以T7启动子为对照构建了GFP基因的原核表达载体pETGm，进行了初步的原核表达实验，检测结果表明：克隆到的叶绿体基因启动子和终止子是有生物学功能的，在大肠杆菌BL21中呈组成型表达，同时还证明了RBS序列在基因表达中的重要性。     

毛白杨真核细胞翻译起始因子5A基因(PtoeIF5A4)的克隆与表达分析

真核细胞翻译起始因子5A(eIF5A)是目前己知的唯一一种含有羧腐胺赖氨酸残基的蛋白质,其在细胞的生长和增殖方面具有重要作用.但eIF5A各异形体的生物学功能尚不明晰.本研究从毛白杨(Populus tomentosa)中克隆了一个eIF5A的全长编码区序列,并根据同源性分析将其命名为PtoeIF5A4(GenBank登录号:HQ529482),其编码区与毛果杨(Populus trichocarpa)PtreIF5A4的编码区在核酸水平的序列相似性为99％.PtoeIF5A4的编码区全长483 bp,共编码160个氨基酸,编码蛋白的预测分子量约为17.5 kD,等电点为5.76.表达分析结果表明,该基因在根、茎及叶中均表达,在茎中的表达量最高,而且随生长时间的增长,PtoeIF5A4在茎中表达量逐渐上升,生长12个月的杨树茎次生木质部中PtoeIF5A4的表达水平是移栽1个月的4倍,且在12个月后趋于稳定,推测PtoeIF5A4在林木次生生长中起关键作用.     

胡杨谷胱甘肽过氧化物酶PeGPX基因的克隆及转化植株耐盐性分析

胡杨（Populus euphratica Oliv.）具有极强抗盐碱能力.本实验室前期胡杨微阵列芯片数据结果显示：盐胁迫下,胡杨谷胱甘肽过氧化物酶基因（PeGPX）的转录上调,暗示该基因可能对胡杨耐盐性具有一定的作用.为分析GPX对植物耐盐性的贡献,本研究以胡杨为材料,利用RT-PCR方法克隆了胡杨谷胱甘肽过氧化物酶PeGPX基因,并在烟草中过量表达该基因,以分析谷胱甘肽过氧化物酶活性与植物耐盐性的关系.研究结果显示,实验中克隆的cDNA （PeGPX）编码谷胱甘肽过氧化物酶,其ORF为693 bp,其蛋白由231个氨基酸编码.过量表达PeGPX基因的烟草与野生型烟草的耐盐性实验结果显示,野生型烟草植株在加NaCl （200 mmol/L）的MS培养基中生长15 d后,无明显的长高,且不长根;而转基因烟草在同样的加盐培养基上,生长基本没有受到抑制,植株生长状态良好,并且能够长根.光合数据显示,在盐胁迫下过量表达PeGPX基因烟草的净光合速率受到影响明显小于野生型烟草的净光合速率.酶活数据显示,转基因株系GPX酶活与野生型的相比在盐胁迫下活性有非常显著的提高.我们的研究结果说明：过表达PeGPX基因使得烟草的耐盐性得到显著提高,这对深入研究PeGPX基因在胡杨耐盐机制中的作用具有重要的意义.     

遗传转化KN1基因促进毛果杨外植体再生

已有研究表明玉米同源异形盒（homeobox）基因Knotted1（KN1）超量表达会导致转基因烟草、拟南芥和番茄等植物中细胞分裂素含量增加,提高转化效率。由于木本植物遗传转化困难,且毛果杨可作为木本植物研究的模式植物,因此,本研究利用农杆菌介导法,将35S启动子驱动的玉米KN1（35S：：KN1）基因导入毛果杨,并分析KN1基因表达对毛果杨再生率的影响。研究结果表明,经GUS组织化学染色及PCR分子鉴定,KN1基因已经成功导入毛果杨幼苗;KN1基因对毛果杨外植体愈伤诱导率影响不明显,但单个外植体芽诱导率比对照高0.96倍,毛果杨的再生频率明显提高;与移栽成活的野生对照植株相比,转化KN1基因植株出现叶片变小,叶色变深,在叶片边缘产生裂片,分枝增加,无顶端优势等特殊表型。本研究中KN1基因引起转化植株表型变化,因此在毛果杨的遗传转化中,可作为一种有效的正向选择标记基因。     

水稻耐盐生理及分子调节机制

土壤钠盐积累导致的土壤盐渍化程度越来越严重,已成为制约水稻产量和品质的重要因素之一。钠离子是引起水稻盐胁迫伤害的主要离子,研究钠离子在水稻植株体内的吸收运输机制,及水稻应对盐胁迫的生理分子调节机制,有助于抗盐品种的选育以及盐碱地的综合治理与利用。本文综述了水稻对盐信号的感应及盐分在水稻体内的吸收转运特征;分析了盐分进入水稻机体后对植株形态及生长发育的影响;探讨了水稻为缓解盐分伤害,诱发的渗透调节、养分、抗氧化系统、激素等生理调节机制,以及通过抗逆蛋白差异性表达和耐盐相关基因应激表达,来控制水稻体内离子平衡,保护膜系统及光合系统的分子调节机制。同时,本文对提高水稻耐盐性提出了外源调控措施,并对该领域的研究进行了展望。