天祝白牦牛HSP60基因的克隆及其在下丘脑-垂体-睾丸中的表达定位研究

热休克蛋白60(HSP60)不仅在细胞保护方面发挥作用,也参与雄性动物生殖生理的调控。为研究HSP60基因序列特性及其在天祝白牦牛下丘脑-垂体-睾丸轴(HPT-axis)上的表达情况,探寻其在白牦牛睾丸发育、精子发生过程中的作用机制,本研究采用RT-PCR和RACE技术获得白牦牛HSP60基因全长cDNA序列,采用生物信息学方法分析HSP60蛋白的理化性质、结构及不同物种之间的同源性等,并利用qPCR、Western blotting、免疫组化法分析HSP60在白牦牛下丘脑-垂体-睾丸轴中的表达及定位。结果表明,白牦牛HSP60基因cDNA全长为2 300 bp,开放阅读框为1 722 bp,编码572个氨基酸;其理论分子量为60.977k Da、等电点为5.69,编码的蛋白为非跨膜可溶性蛋白。氨基酸序列比对结果显示,白牦牛HSP60氨基酸序列与牛、瘤牛、绵羊、藏羚羊、骆驼、白犀牛、兔和黑猩猩的氨基酸序列同源性高、进化水平相近。HSP60基因及蛋白在白牦牛的下丘脑、垂体及睾丸组织中均有表达,其中下丘脑及垂体组织表达量显著高于睾丸,下丘脑和垂体之间差异不显著。免疫组化结果显示,HSP60蛋白定位表达于白牦牛下丘脑组织的室旁核大细胞、室旁核小细胞和神经角演网、垂体组织的腺细胞、睾丸组织的精原细胞、精母细胞、支持细胞和间质细胞,而精子细胞中表达较弱。通过对健康成年白牦牛HSP60在下丘脑-垂体-睾丸轴的表达与定位检测,推断HSP60参与雄性白牦牛生殖轴调控,并参与睾丸发育与精子发生。本研究结果为进一步研究HSP60对雄性生殖调控奠定了基础。     

天祝白牦牛金属硫蛋白基因(MT-1)全序列分子克隆及生物信息学分析

金属硫蛋白-1基因(metallothionein-1,MT-1)是一类广泛存在于动物体内的金属结合蛋白,除维持金属动态平衡和重金属解毒外,还可参与清除自由基、拮抗电离辐射和抗应激等。为深入研究MT-1基因参与动物机体抗逆性的分子机制,本研究采用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得天祝白牦牛(Bos grunneins)MT-1基因全长cDNA序列,运用生物信息学方法分析MT-1蛋白的理化性质、结构和不同物种间的同源性,并利用RT-qPCR方法分析MT-1基因在天祝白牦牛各个脏器和组织中的表达丰度。结果表明,天祝白牦牛MT-1基因cDNA序列全长为408 bp(GenBank登录号:KF770836),开放阅读框(ORF)长186 bp,编码61个氨基酸,氨基酸的分子量为5.981 kD;氨基酸序列分析显示,天祝白牦牛MT-1基因编码氨基酸序列与牛(Bos taurus)的同源性高达100%,同时与大多数哺乳动物相似;荧光定量PCR结果发现,MT-1 mRNA在天祝白牦牛8个不同脏器和组织中均有表达,心脏中表达量最高。天祝白牦牛MT-1基因的成功克隆为进一步研究该基因的功能提供了基础资料。     

西北地区现代游牧业产业化发展初探——以天祝藏族自治县白牦牛产业为例

天祝藏族自治县是一个以牧为主的少数民族自治县,白牦牛产业是当地经济发展的特色产业之一。在领导的的重视和龙头企业的带动下,天祝县积极引进资金、技术,大力建设生产基地,逐渐走上了产业化发展之路。但在发展过程中也存在着种群数量少、下游企业动力缺乏,全产业链资金短缺,设施落后等问题。通过研究资料和基层走访调研等方式,文章从政府、生产基地、生产企业等方面对解决这些问题提出了意见及建议。     

天祝白牦牛Y染色体性别决定基因(SRY)编码区的克隆和原核表达

从天祝白牦牛(Bos grunneins)的基因组DNA中扩增了Y染色体性别决定基N(SRY)编码区序列,将其克隆至pGEM-T easy载体,天祝白牦牛SRY基因编码区长687 bp,编码229个氨基酸(GenBank:FJ373272);对牦牛和奶牛(B.grunneins)的SRY基因编码区进行序列比对,发现存在2个碱基的变异,造成1个氨基酸的变异;将牦牛SRY基因编码区连接至pET-28a(+)载体,成功地构建了表达载体pET-28a/SRY;把表达载体pET-28a/SRY转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用IPTG在30℃ 200 r/min条件下诱导,获得了SRY蛋白的大量表达;对表达产物进行Western blot检测,结果显示获得的蛋白能与抗-His单抗特异性结合,确定了牦牛SRY蛋白的表达.     

NO对仔猪睾丸支持细胞微管的影响

为阐明一氧化氮（NO）对睾丸支持细胞（SC）的影响,并为深入探讨精子发生调节机制奠定基础,本试验通过体外培养的仔猪睾丸支持细胞研究NO对SC中微管结构的影响。试验利用硝普钠（SNP）作为NO的供体,通过细胞活性检测、免疫荧光、酶活检测、免疫印迹等方法检测NO对睾丸支持细胞微丝的影响。结果表明,低浓度NO能维持支持细胞正常的骨架和活力,而高浓度NO能提高SC内p38MAPK的活性,降低抗氧化酶的活性和破坏细胞内微管的结构和分布,甚至细胞的分泌功能。上述证明,SNP通过使睾丸支持细胞NO的水平升高从而降低细胞内抗氧化能力,并通过p38MAPK级联,使细胞中微管发生解聚化,破坏微管的结构,从而降低细胞的分泌功能。     

仔猪睾丸支持细胞的增殖与发育

为了阐明支持细胞增殖和分化能力对精子生成的影响,本实验以7、21和35d仔猪为材料,利用细胞直接计数、免疫组织化学、流式细胞术和免疫印迹分析了仔猪睾丸支持细胞、生精细胞数量和增殖能力变化以及支持细胞的成熟分化状况。结果:(1)从7～21d,曲细精管中支持细胞与其它细胞之间的界线更加明显;从7～35d,每克睾丸中间质细胞和支持细胞的数量在21d时达到高峰(P<0.05),而生精细胞的数量则一直增加(P<0.05),但并没有在曲细精管中发现圆形精子;(2)从7～35d,支持细胞和间质细胞都能表达GATA-4,支持细胞中GATA-4的累积光密度(IOD)在21d时最高(P<0.05),而间质细胞中的IOD在21d和35d之间没有明显差异(P>0.05);(3)从7～35d,整个睾丸细胞都有增殖能力,睾丸细胞的细胞增殖指数(PI)和S期细胞指数(SPF)在21d时最高(P<0.05);三种细胞在这一时期都能表达PCNA,三种细胞PCNA的IOD值和睾丸中PCNA的表达水平在21d时最高(P<0.05);(4)从7～35d,Connexin 43(Cx43)主要表达于支持细胞的细胞质,支持细胞和间质细胞中的IODs在2...     

一氧化氮(NO)对仔猪睾丸支持细胞微管的影响

为阐明一氧化氮(NO)对睾丸支持细胞(sc)微管的影响,利用硝普钠(SNP)作为NO供体.通过细胞活性检测、免疫荧光、酶活检测、免疫印迹等方法检测NO对培养仔猪睾丸支持细胞微管结构和分布的影响.结果表明,低浓度NO能维持支持细胞的活力和微管正常的结构;高浓度NO能提高Sc内p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的活性,降低抗氧化酶的活性、破坏细胞内微管的结构和分布.降低细胞的分泌功能.实验证明,SNP通过使睾丸支持细胞NO的水平升高从而降低细胞内抗氧化能力,并通过p38MAPK级联,使细胞内微管发生解聚化.破坏微管的结构,从而降低细胞的分泌功能.     

提高成熟温度对牦牛乳硬质干酪蛋白质降解的影响

为了了解提高成熟温度对牦牛乳硬质干酪成熟过程中蛋白质降解与苦味程度的影响,本文研究了5、10、15℃成熟牦牛乳硬质干酪在1~6个月成熟过程中p H值4.6可溶性氮含量、12%TCA可溶性氮含量、5%PTA可溶性氮含量、游离氨基酸和苦味程度的变化,并利用RP-HPLC对p H值4.6可溶性氮提取物肽分布进行了分析。结果表明:成熟温度和时间显著影响干酪成熟过程中以p H值4.6可溶性氮含量、12%TCA可溶性氮含量、5%PTA可溶性氮含量、游离氨基酸等所体现的蛋白质降解程度。提高成熟温度导致p H值4.6可溶性氮含量、12%TCA可溶性氮含量、5%PTA可溶性氮含量、游离氨基酸含量等增加,特别是15℃在成熟早期能较快增加干酪12%TCA可溶性氮含量、5%PTA可溶性氮含量。RP-HPLC分析显示从5℃提高到15℃时,干酪p H值4.6可溶性氮提取物亲水性肽含量增加,疏水性肽含量降低。除5、10、15℃成熟2个月干酪具有非常轻微的苦味之外,15℃成熟干酪比5、10℃成熟干酪具有较强苦感,成熟4个月后,10、15℃成熟干酪具有中等较强苦味,且差异不显著(P≥0.05)。该研究为加快牦牛乳硬质干酪成熟提供了试验数据。     

供体细胞不同性别和处理方式对异种克隆牦牛胚胎发育的影响

以黄牛(Bos taurus)卵母细胞为受体,牦牛(Bos grummiens)耳成纤维细胞为核供体进行体细胞核移植,研究供体细胞性别、细胞周期同期化处理方式及冷冻对异种克隆牦牛胚胎发育的影响.结果显示,雄性供体细胞的异种克隆牦牛囊胚发育率显著高于雌性供体细胞(56.6% vs 39.5%,P<0.05),但卵裂率和囊胚细胞数差异不显著;血清饥饿和接触抑制提供的供体细胞对异种克隆牦牛胚胎发育率和胚胎质量的影响没有明显差别;供体细胞冷冻-解冻组的克隆胚胎卵裂率明显低于新鲜消化组(54.5% vs 78.2%,P<0.05),但两组之间的囊胚率和囊胚细胞数没有显著差异.说明供体细胞的性别对异种克隆牦牛囊胚发育有影响,而同期化处理和细胞冷冻对异种克隆牦牛囊胚发育影响很小.     

供体细胞不同来源和处理方式对牦牛异种克隆胚胎发育的影响

本文以黄牛卵母细胞胞质为受体,牦牛耳成纤维细胞为核供体进行体细胞核移植,研究供体细胞性别、细胞周期同期化处理方式及冷冻对牦牛异种克隆胚胎发育的影响。结果显示：雄性供体细胞的牦牛异种克隆囊胚发育率显著高于雌性供体细胞（56.6% vs 39.5％,P﹤0.05）,但卵裂率和囊胚细胞数差异不显著;血清饥饿和接触抑制提供的供体细胞对牦牛异种克隆胚胎发育率和胚胎质量的影响没有明显差别;供体细胞冷冻后解冻组的克隆胚胎卵裂率明显低于新鲜消化组（54.5％ vs 78.2％,P﹤0.05）,但两组之间的囊胚率和囊胚细胞数没有显著差异。说明供体细胞的性别对牦牛异种克隆囊胚发育有影响,而同期化处理和细胞冷冻对牦牛异种克隆囊胚发育影响很少。     

HSP27基因在牦牛卵母细胞和体外早期胚胎中的表达

为了探讨牦牛HSP27(heat shock proteins27, HSP27)基因在牦牛卵母细胞和早期孤雌激活胚胎中的表达情况及定位,本试验通过实时荧光定量PCR检测牦牛HSP27基因在未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞以及孤雌激活不同时期胚胎中的相对表达量,用免疫荧光染色法检测HSP27蛋白在未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞以及孤雌激活不同时期胚胎中的表达与定位情况。结果显示,HSP27基因在牦牛未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞以及体外培养孤雌激活不同时期胚胎中均可表达,其中在未成熟卵母细胞中的表达量显著高于成熟卵母细胞;在孤雌激活胚胎中,2~4细胞期表达量最高,囊胚期胚胎表达量最低,随着胚胎的发育,HSP27的表达量呈现逐渐降低的趋势;在2~4细胞期和囊胚期胚胎中的表达与其他组表达存在显著差异性,在5~8细胞期和桑椹胚中的表达无显著差异。免疫荧光染色结果表明,HSP27蛋白在牦牛卵丘细胞和卵母细胞中均有表达,在牦牛孤雌激活2~4细胞期、5~8细胞期和桑椹期胚胎中主要表达于细胞核内和细胞质中,在囊胚期主要表达于细胞核中;而HSP27蛋白的表达水平与基因表达水平基本一致。本研究为后续研究HSP27基因在牦牛生殖生理过程中的作用机制提供了参考。     

超声处理对牦牛乳酶促凝胶流变特性的影响研究

为探究超声牦牛乳的酶促凝胶流变特性,并进一步分析超声后牦牛乳的蛋白疏水性和脂肪球粒径如何影响凝胶网络的形成,本研究以牦牛乳为原料,进行超声处理(时间5 min和10 min,功率300、400和500 W)后,编号为US1(300 W,5 min)、US2(300 W,10 min)、US3(400 W,5 min)、US4(400 W,10 min)、US5(500 W,5 min)和US6(500 W,10 min),以未处理的牦牛乳作为对照(CK),通过小振幅振荡时间扫描获取凝胶形成的流变信息。结果表明,超声处理后牦牛乳的脂肪含量、蛋白质含量以及pH值无显著变化(P>0.05),而均质效率和乳液稳定性显著提高(P<0.05);超声处理能够增加凝胶的储能模量,使得牦牛乳酶促凝胶的弹性增加。US5和US6的储能模量增幅最多(分别为6 824和7 189 Pa),但凝胶时间长。与CK相比,超声牦牛乳US1、US2、US3和US4的凝胶时间分别缩短了1.78、3.72、5.75和4.74 min;超声处理在改变乳蛋白表面疏水性的同时减小了脂肪球尺寸。与CK相比,US3最大荧光强度显著增加了51.22%(P<0.05),脂肪球粒径分布范围为0.300~4.002 μm,集中在1.974 μm处。US4最大荧光强度显著降低了5.31%(P<0.05),脂肪球粒径呈双峰分布,范围为0.131~4.502 μm。综上所述,经过不同时间和不同功率的超声处理后,US1~US6乳蛋白表面疏水性和脂肪球尺寸受到影响的程度不同,使得凝胶网络体系存在差异,从而表现出不同的凝胶特性。本研究为超声技术在牦牛乳凝胶类制品加工中的应用提供了理论基础。     

羟自由基氧化对牦牛肉肌原纤维蛋白生化特性的影响

为探究羟自由基(·OH)氧化处理对宰后牦牛肉成熟过程中肌原纤维蛋白氧化特性的影响,以经不同浓度(0、0.5、1、5、10、20 mmol·L^-1)羟自由基氧化体系氧化不同时间(0、0.5、1、12、24、48 h)的牦牛肉为研究对象,以未经处理的牦牛肉为空白对照,测定不同浓度不同氧化时间下肉样肌原纤维蛋白的羰基含量、巯基含量、二硫键含量、表面疏水性、Ca/K-ATPase活性等指标的变化规律。结果表明,随着H₂O₂浓度的增加及氧化时间的延长,不同处理组间牦牛肉肌原纤维蛋白均表现出不同程度的氧化水平,其中羰基含量、二硫键含量和Ca-ATPase活性均呈显著增加趋势(P<0.01),而表面疏水性呈先上升后下降的趋势,巯基含量和K-ATPase活性则显著降低(P<0.01)。H₂O₂浓度增加至20 mmol·L^-1时,与空白对照组相比,羟自由基处理组羰基含量升高46.03%,而巯基含量下降79.79%。综上,羟自由基促使宰后牦牛肉成熟过程中肌原纤维蛋白发生了显著氧化,增加了蛋白的氧化程度。本研究结果为牦牛肉生产加工过程中蛋白氧化控制提供了一定的参考。     

不同浸渍工艺对贵人香干白葡萄酒香气品质的影响

为提升贵人香干白葡萄酒的香气品质,以澄清汁发酵工艺(CQ)为对照,利用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用技术(HS-SPME/GC-MS)检测浸渍工艺(JZ)和浸渍澄清工艺(JC)处理发酵酒样中的挥发性香气化合物。结果表明,浸渍处理可以明显增加葡萄酒中香气物质的含量。与CQ相比,JZ和JC对发酵酒样中品种香气物质的含量影响显著(P<0.05),萜烯类化合物含量分别增加1.86、1.01倍,且JC酒样中醇类、酯类香气物质含量最高,分别为4 799.38μg·L^-1和5 013.28μg·L^-1。主成分分析结合感官评价结果表明,JZ和JC酒样的花香特征相似,且JC酒样的热带水果香气以及醇香特征更为明显;与CQ相比,JC发酵酒样香气优雅、纯正,口感平衡。综合分析,浸渍澄清工艺(JC)可有效提升甘肃河西产区贵人香干白葡萄酒的香气品质。本研究结果可为干白葡萄酒增香酿造提供技术支持。     

Effect of Copper on Antioxidant Enzyme Activities and Mineral Nutrition of White Lupin Plants Grown in Nutrient Solution

We analyzed the effect of different copper (Cu) concentrations (0.10, 0.15, 0.20 and 0.35 mM) and time (1 day to 9 days) on several growth and biochemical parameters of roots and shoots of white lupin plants (Lupinus albus cv Estoril) grown in nutrient solution. A significant decrease in leaf fresh weight and leaf area was detected. Copper accumulated in the roots, and an impairment of nutrient translocation was only observed after six days at the highest Cu concentrations applied. A transient increase in the activity of polyphenoloxidase (EC 1.10.3.1) enforces a role for lignification as a defense strategy under enhanced Cu levels. The activities of several antioxidative enzymes were enhanced after Cu application. Our results indicate that Lupinus albus cv ‘Estoril’ is a rather resistant plant that can cope with moderate concentrations of copper, mostly by controlling up to a certain point, the uptake of excessive amounts of this metal.     

60Co-γ射线对菊花组培苗的诱变效应

对菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)品种秋之山的组培苗, 采用5～30 Gy的60Co-γ射线照射处理。研究了γ射线对组培苗生长、增殖和生根的影响以及对组培再生植株移栽后生长开花的影响。结果表明20 Gy是γ射线处理菊花组培苗的致死剂量；从生根和继代培养生长和增殖的结果看，诱变处理的最佳剂量在10 Gy左右；组培再生植株移栽后发现，10 Gy处理的植株中花色变异率为8.2%。与对照花鲜艳的纯黄色相比，变异花增加了不同深浅的红色素，且突变植株均为同质稳定突变。     

稳定剂对蛋白液鸡蛋干质构特性的影响

为了探究稳定剂对蛋白液鸡蛋干质构特性的影响,以蛋白液为主要原料制作鸡蛋干,分析不同加水量、NaCl添加量以及不同种类稳定剂及添加量对鸡蛋干感官评分、硬度、胶着性、咀嚼性、弹性、粘聚性、回复性等参数的影响。结果表明,鸡蛋干的感官评分和质构参数随着水、NaCl的添加量变化而发生明显改变,在加水量12%、加盐量1.5%的条件下,鸡蛋干的品质相对较好。与不添加稳定剂的对照组(CK)相比,单独添加复合磷酸盐、谷氨酰胺转氨酶(TG酶)、瓜尔豆胶、结冷胶的试验组的鸡蛋干感官评分均提高,质构同样得到不同程度的改善。上述稳定剂的各自最佳添加量分别为:复合磷酸盐0.20%、TG酶0.25%、瓜尔豆胶0.25%、结冷胶0.10%。本研究结果为改进蛋白液鸡蛋干的加工配方,有效提升蛋白液鸡蛋干的感官品质和质构特性提供了一定的技术指导。