鲢微卫星标记研制及其在鲢和鳙遗传多样性研究中的应用

鲢(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙(Aristichys nobilis)是中国特有的四大家鱼中2个重要成员,主要分布于黑龙江、长江和珠江水系.传统人工养殖依靠天然鱼苗.但是,人口增长和人类经济活动加剧使其天然产卵和孵化场消失或遭到破坏.人工育苗技术虽然解决了鱼苗供应问题,但由于遗传资源管理和使用方法的不完善,使两种鱼的生长表现、抗病抗逆性和遗传多样性等都有明显的降低.另外,因洪水导致的养殖个体逃逸也使天然群体的遗传多样性受到干扰.近年来,比较大规模的人工鱼苗放流实践也加剧了对天然群体遗传多样性的扰动.对这些问题的深入研究迫切需要一套适用的分子标记.为评价鲢和鳙的遗传多样性、确定它们的遗传分化和地理分化、科学合理地管理和开发利用遗传资源,本研究构建了富集GT微卫星序列的基因组短片段文库.随机选择并测序的97个克隆中有87个含有微卫星序列.根据其中的21条序列,设计了22对微卫星标记引物并用来分析了在长江荆州段捕获的32尾野生鲢和7尾野生鳙的遗传多样性.所有标记引物在两种鱼中通用.在全部样品中共发现129个等位基因.每位点等位基因数在3～10个,平均5.9个.不同标记揭示的遗传多样性指数在0.33～2.00,平均1.22.由于使用的鱼个体数少,如鳙,只有7个个体,样品也只来源于长江荆州江段.本研究无法基于两种鱼的天然分布,对两种鱼的遗传分化、地理种群多样性比较、养殖群体和天然群体差异等问题进行深入分析.但是,这组标记的研制将有助于这2个中国特有经济鱼种的遗传多样性分析、遗传资源的管理及开发利用等相关研究.本研究中,微卫星DNA标记的研制使用了固定有微卫星核心序列的磁珠.这样的磁珠与两端接有已知序列的DNA片段杂交能富集出含有微卫星核心序列的片段.通过扩增和连接转化,可方便地获得大量含微卫星核心序列的片段.与已有的方法不同的是,本研究用AFLP方法的某些步骤使片段两端加上已知引物序列,方便易行.迄今,这两种鱼还没有微卫星标记连锁图谱.构建这样的图谱是本项目研究的长远目标.     

津鲢与长江鲢遗传多样性分析

随机选取津鲢和长江鲢各36尾,用16个微卫星标记进行遗传多样性分析。结果显示:16个微卫星位点在2个群体中共检测到等位基因105个,基因型241种,每个位点等位基因数3～15个,平均6.6个,基因型4～37种,平均15.1种。2个鲢群体平均观察杂合度(Ho)分别为0.5393和0.5392,平均期望杂合度(He)分别为0.5887和0.5762,结果表明该2个鲢群体遗传多样性水平较高。2个鲢群体平均多态信息含量(PIC)分别为0.5602和0.54,固定系数(FIS)表明这2个鲢群体表现为杂合子缺乏(FIS0)。2个鲢群体之间的遗传距离为0.0566,平均遗传分化系数(Fst)值为0.021,说明仅有2.1%的遗传变异来源于群体间。     

微卫星DNA标记对乌苏里江哲罗鱼遗传多样性的分析

从网上查询获得鳟微卫星标记30对，并对乌苏里江哲罗鱼的基因组进行遗传多样性分析，结果筛选出10对具多态性的微卫星标记。并用其中6对微卫星引物对17尾乌苏里江哲罗鱼进行基因组DNA扫描检测。用2％的琼脂糖凝胶电泳检测微卫星标记的PCR扩增产物，并对扩增结果进行了统计分析，计算了6个基因座的等位基因频率、杂合度等。结果表明，乌苏里江哲罗鱼等位基因频率为0．0455～0．7857，多态信息含量(PIC)为0．2801～0．6351，杂合度(H)为0．3368～0．6563。统计结果初步表明乌苏里江哲罗鱼的遗传多样性程度处于中等偏下水平。同时，结合资源量下降的事实，建议在保护遗传多样性的前提下对其采取人工繁殖和放流的方法增加其种群数量。     

长江宜宾江段圆口铜鱼遗传多样性的微卫星分析

选用实验室克隆的23个圆口铜鱼(Coreius guichenoti Sauvageet Dabry)微卫星标记分析了长江宜宾江段的圆口铜鱼群体遗传多样性,统计分析了有效等位基因数、观测杂合度Ho、期望杂合度He、多态信息含量(PIC)等遗传学指标。结果表明:23个位点有14个微卫星位点呈单态,9个位点出现多态,在这9个位点中共检测到48个等位基因,其平均有效等位基因数为5.3,多态信息含量在0.440～0.839之间变动,平均为0.670,除YT17和YT22位点属于中度多态外,其余7个位点均属于高度多态。平均观测杂合度为0.753,平均期望杂合度为0.728,表明该群体的遗传多样性较为丰富。     

秦皇岛海域野生牙鲆群体遗传多样性分析

用18对多态性微卫星标记对采自秦皇岛海域的90尾野生牙鲆(Paralichthys olivaceus)进行遗传分析。18个微卫星位点共检测出161个等位基因;各位点等位基因数为7~11个,平均为8.9;有效等位基因为3.7~8.0,平均有效等位基因为5.9;各个位点多态信息含量为0.69~0.86,平均值为0.80;Shannon多样性指数平均值为1.9;观测杂合度(Ho)值为0.33~0.87,平均值为0.64;期望杂合度为0.74~0.89,平均期望杂合度(He)为0.84。χ2检验表明,18个位点中有9个的等位基因分布偏离了哈迪温伯格平衡(P<0.05)。研究结果表明,秦皇岛海域野生牙鲆群体遗传信息含量丰富、等位基因分布均匀,遗传多样性较高,但是,存在Hardy-Weinberg不平衡现象。     

微卫星（Microsatellite）基本涵义

本刊讯：微卫星（Microsatellite），又称为简单序列重复（SimpleSequence Repeats，SSR），是基因组中广泛分布的1到6个碱基的重复序列，具有高水平的遗传变异。目前微卫星标记已成为基因组研究的非常有效的遗传标记，已用于遗传作图、基因定位、分子标记辅助选择、亲子鉴定、指纹识别。[第一段]     

2个锦鲤人工养殖群体遗传多样性的微卫星标记分析

采用13对微卫星引物,对2个锦鲤(Ornamental carp)人工养殖群体的遗传多样性进行了研究.结果表明,锦鲤群体的遗传多样性水平较高;其平均等位基因数(A)为7.86和8.37;2个群体的平均观测杂合度(Ho)为0.7911和0.7928,平均期望杂合度(He)为0.6735和0.6792,平均多态信息含量为0.7145和0.7192.群体间的遗传距离为0.1057,遗传相似度为0.9011.13个微卫星位点可用于锦鲤群体的遗传学研究.     

微卫星DNA标记在鱼类遗传多样性分析中的应用

微卫DNA因其数量分布广,多态性丰富及检测快速方便等优点在动物的遗传育种中已得到了广泛的应用。本文通过对微卫星DNA性质特点,微卫星DNA标记的原理以及其在鱼类遗传多样性的分析中的应用等多方面进行综述．并简单介绍该技术中存在的问题及发展前景。     

长江、珠江、黑龙江水系野生鲢遗传多样性的微卫星分析

采用34个微卫星分子标记,对长江（湘江、监利、枞阳）、珠江、黑龙江（抚远）鲢共5个群体的观测杂合度(H_o)、期望杂合度(H_e )、多态信息含量(PIC)和有效等位基因数(N_e)等进行了遗传检测,根据基因频率计算遗传相似系数和Nei氏标准遗传距离,以卡方检验估计Hardy-Weinberg平衡,以近交系数(F_ST)和基因流(Nm)分析群体的遗传分化。同时,基于Nei氏标准遗传距离获得NJ聚类图。共检测出154个等位基因,其中有80个共有基因。位点等位基因1～9个不等,平均等位基因4.666 7,平均有效等位基因2.948 9。5群体平均观测杂合度为0.329 5～0.461 9,平均期望杂合度为0.500 2～0.552 9,平均多态信息含量为0.443 5～0.493 0。表明5群体为中度多态,遗传多样性较低,且长江不同地理群体的遗传多样性也有差异,但差异不显著。通过群体间遗传相似性和遗传距离比较显示：长江3个群体间遗传相似系数最大,遗传距离最小;黑龙江与长江鲢群体间相似系数较大（平均0.871 8）,遗传距离较小（平均0.137 4）表明二者遗传分化亦最小;珠江鲢与长江鲢间的相似系数最小（平均0.831 0）,遗传距离最大（平均0.185 2）,其遗传分化差异较大,结果未显现出群体间遗传差异的大小与其地理距离远近呈正相关。     

秦皇岛海域野生牙鲆的遗传多样性研究

采用微卫星标记的方法对秦皇岛海域的野生牙鲆进行了遗传多样性分析,结果显示,12对微卫星标记的多态信息含量PIC为0.784~0.949,平均为0.896;12对标记的等位基因数NA为13~108个,平均为51;本研究中观测杂合度Ho为0.286~0.957,平均为0.764,期望杂合度He为0.809~0.953,平均为0.906。结果表明,秦皇岛海域野生牙鲆的遗传多样性处于较高水平,是优良的牙鲆种质资源宝库。     

洪泽湖日本沼虾 9 个野生群体遗传多样性微卫星分析

利用微卫星标记分析了洪泽湖避风港、蒋坝、鲍集等9个日本沼虾(Macrobrachium nipponense)野生群体的遗传多样性。结果表明,8个微卫星位点呈现高度多态性;每个群体中至少有5个位点显示杂合不足,显著偏离了Hardy-Weinberg平衡;9个日本沼虾野生群体均表现出较高的遗传多样性水平,洪泽湖中、东部避风港和蒋坝等群体遗传多样性高于西部鲍集和界集群体。突变-漂移平衡分析表明,洪泽湖日本沼虾群体部分位点杂合显著过剩,表明洪泽湖日本沼虾群体部分位点偏离了突变-漂移平衡,但近期没有经历过瓶颈效应,群体数量也没有下降。群体间F-统计量及AMOVA分析表明,群体遗传分化极显著(F ST=0.0643,P0.01);基于D A遗传距离构建的NJ和UPGMA聚类树均显示,地理位置相邻的群体聚在一起。结论认为,洪泽湖日本沼虾群体具有丰富的遗传多样性,在洪泽湖地区建立日本沼虾种质资源自然保护区,可以更好地有效保护洪泽湖水域的日本沼虾种质资源。     

Genetic diversity of oriental river prawn(Macrobrachium nipponense De Haan)revealed by ISSR markers

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)是中国分布范围广、经济价值较大的一种重要淡水虾类.随着养殖规模的不断扩大,如何保持养殖群体的遗传品质已引起了人们的重视.但迄今为止,养殖的日本沼虾均来自未经系统遗传选育的野生群体,而养殖病害的日趋严重和养成规格、品质的下降已严重影响到日本沼虾养殖产业的健康发展.研究野生群体的遗传结构和遗传分化,揭示其遗传多样性是制定合理有效的保护和管理策略的前提和基础.ISSR(Inter-simple sequence repeats,简单重复序列中间区域)标记技术具有实验重复性好、信息量大、多态性高等优点,是一种理想的检测群体遗传变异的分子标记.因此,本研究应用ISSR标记技术对日本沼虾5个地理群体进行了初步的遗传分析,以期为合理开发和利用日本沼虾天然资源,以及建立和保护日本沼虾种质资源库及基因库提供理论依据.本研究对采自江苏苏州、江西南昌、云南西双版纳、湖北宜都和新疆博湖的5个地理群体进行了初步研究.从50个ISSR引物中筛选出9个条带清晰、稳定性和重复性好,且产生相对较多条带的引物用于全部DNA样品的PCR扩增.对日本沼虾5个地理群体的群体遗传分析表明,在所有榆测到的清晰且可重复的142个有效位点中,多态位点有138个.物种水平上,多态位点百分率(PPL)、等位基因数(No)、有效等位基因数(Ne)、Nei's基因多样性指数(H)和Shannon信息指数(Ⅰ)分别为97.18%、1.972、0.312、0.120和0.323.而在群体水平上,5个地理群体的多态位点百分率为29.58%～61.97%;等位基因数(No)为1.296～1.620;有效等位基因数(Ne)为1.165～1.281;Nei's基因多样性指数(H)为0.098～0.172;Shannon信息指数(Ⅰ)为0.147～0.267.从各个地理群体看,江西南昌群体的遗传多样性最高(PPB:61.97%,No:1.620,Ne:1.281,H:0.172,I:0.267),而湖北宜都群体最低(PPB:29.58%,No:1.296,Ne:1.165,H:0.098,I:0.147).群体内遗传多样度(HS)和总基因多样度(HT)分别为0.135和0.201,根据遗传多样性水平在群体内(HS)和群体间(HT-HS)的分化,各个群体之间的Nei's基因分化系数[GST=(HT-HS)/HT]是0.327.AMOVA分析表明,群体间的遗传变异占总遗传变异的38.59%,而61.41%的遗传变异源于群体内,群体之间表现出较高水平的遗传分化.与其他群体相比,新疆博湖群体和江苏苏州群体差异最小(FST:0.1923,遗传距离D:0.0542),而新疆博湖群体与云南西双版纳群体差异最大(FST:0.5950,D:0.1559).采用UPGMA法构建的分子系统树显示,5个地理群体明显地聚为2个族群,来自新疆博湖和江苏苏州的日本沼虾群体聚为一支,而江西南昌、湖北宜都和云南西双版纳的群体聚在一起.本研究使用9条引物对5个地理群体进行了扩增,共检测到138个多态位点,各群体的多态位点百分率(PPL)为29.58%～61.97%.与其他相关研究结果进行比较,发现对日本沼虾而言,ISSR技术是一个理想的检测群体遗传变异的分子标记.与其他群体相比,新疆博湖群体和江苏苏州群体各遗传参数均相近,且UPGMA系统树亦显示新疆博湖群体和江苏苏州群体的亲缘关系较近,推测它们可能来自同一个祖先群体.与其他野生群体相比,江西南昌群体的遗传多样性最高,该群体采自江西省鄱阳湖,鄱阳湖是中国最大的淡水湖泊,它接纳赣江、抚河、信江、饶河、修河5大河及博阳河、漳田河、潼津河的来水经调蓄后由湖口注入长江,是一个过水性、吞吐型、季节型的湖泊.上游河流汇入鄱阳湖引起群体迁移使不同生态型的基因交流,增加了迁入地的遗传多样性.从遗传角度来讲,一个物种保持足够的遗传变异性是适应不同生境、生存和进化的首要保证.因此,较高水平的遗传多样性对于保护和利用野生群体具有重要意义.本研究表明,在日本沼虾的多样性研究方面,ISSR标记技术是一个非常有效的检测群体遗传变异的遗传标记.研究结果可以为合理开发和利用日本沼虾自然野生资源,以及建立和保护日本沼虾种质资源库及基因库提供基础资料.     

长江、高邮湖、太湖日本沼虾遗传多样性的RAPD分析

采用随机扩增多态性DNA (RAPD)技术对取自长江、高邮湖、太湖3个野生群体的日本沼虾共51个个体的遗传多样性进行分析.10个随机引物共检测出54个位点(200-2500bp),长江、高邮湖、太湖各群体的多态位点比例分别为72.22%、53.70%、62.96%,基因多样性指数分别为0.2878、0.2380、0.2635.群体遗传多样性的Shannon信息指数分析表明,日本沼虾3个野生群体种质资源状况良好,遗传多样性水平较高.     

日本沼虾太湖、长江水域群体分化的AFLP标记差异分析

采用AFLP技术分别对太湖、长江日本沼虾(Macrobrachium nipponense)群体各30尾的基因组DNA进行了群体特异性位点比对分析,并对各位点基因频率分布进行正态性检验、方差齐性检验(F检验)、样本平均数差异显著性检验(t检验)。结果显示:3对引物共扩增出138个位点;太湖组是独立于长江组的群体,而且它们是两个分化了的野生群体;采用变异性的显著性检验(χ2检验)对位点进行差异比较发现,23个位点在太湖组中出现的频率显著高于长江组,其中位点BY160、BY320、BY470、BY520是与太湖群体分化显著关联的位点,可作为区别太湖野生群体与长江野生群体的标记。     

白洋淀日本沼虾血细胞的初步研究

对取自华北白洋淀种群的日本沼虾(Macrobrachium nipponense)血细胞进行显微形态观察、分类、测量和计数。依据细胞的形态,胞质中颗粒的数量和密度以及细胞的核质比把日本沼虾血细胞分为透明细胞(hyaline cell,HC)、半颗粒细胞(semigranular cell,SGC)和颗粒细胞(granular cell,GC)3类。血细胞大小依次为颗粒细胞>半颗粒细胞>透明细胞。血细胞密度为(1.13±0.50)×106个/mL,其中GC占48.5%,SGC占31.8%,HC占19.7%。并对我国日本沼虾的华南种群、华中种群及白洋淀所在地华北种群的血细胞大小和数量进行了比较。     

异型雄性罗氏沼虾遗传多样性的微卫星分析

利用微卫星DNA标记研究3种近亲交配形态型雄性罗氏沼虾遗传多样性,所用虾样均采自国家级(南宁)罗氏沼虾良种场,共150尾成年近亲交配的雄虾,其中蓝色长臂型、橙色长臂型、小个体型各50尾。研究结果表明,3组样品的生长发育差异显著,蓝色长臂型、橙色长臂型、小个体型各组中微卫星位点的总等位基因分别为24、28和22,3组样品所有位点的平均观察杂合度为0.474～0.556。其平均群体内近交系数为-0.0189,说明杂合子过剩,对比分析和群体间分化系数表明,3组雄虾遗传差异明显,最大遗传间距位于蓝色长臂型和小个体型,最小的遗传间距位于蓝色长臂型和橙色长臂型。研究结果将为罗氏沼虾优质父本选育和调控雄性遗传发育提供基础性遗传信息。     

长江上游中华沙鳅遗传多样性研究

测定了采自3个地理位置(宜宾、江津、思南)共45尾中华沙鳅(Botia superciliaris)的线粒体DNA控制区序列。结果显示:在所有个体913 bp序列中检测到22个变异位点,45尾个体中发现26种单倍型。中华沙鳅的平均核苷酸多样性指数π较低(0.00365),而平均单倍型多样性指数Hd较高(0.986)。中性检验Fu′sFs值为-9.49536(P<0.05)。3个群体内的Kimura 2-paramter遗传距离为0.00329～0.00417,群体间为0.00340～0.00379,群体间和群体内的遗传距离处于同一水平。分子变异分析(AMOVA)结果显示:Fst=0.0291(P<0.01),2.9%的变异来自群体间,97.1%的变异来自群体内;在NJ聚类树中,3个群体的个体并没有按相应的地理位置进行聚类。     

镨对青虾卵子孵化的影响

研究了镨(Pr)对青虾（Macrobrachiumnipponense）卵子孵化出Sou状幼体的影响，结果表明：Pr^3 的最佳质量浓度为0.4-1.6mg/L，可孵化离12.4%-20.3%。青虾卵子对Pr^3的饱和吸收量为9.2μg／粒，饱和吸收率为36.8%。     

日本沼虾中肠腺细胞的超微结构研究

应用电镜技术研究了日本沼虾中肠腺细胞的类型及超微结构。结果表明：日本沼虾中肠腺上皮细胞大多呈柱状，顶端具有微绒毛，依结构和功能不同可分为Ｒ细胞、Ｆ细胞、Ｂ细胞和Ｅ细胞４种类型。Ｒ细胞具有吸收、贮存营养物质的功能，细胞内含有脂滴、糖原和吞噬咆，内质网、线粒体等细胞器数量少；Ｆ细胞内蛋白酶原合成活动旺盛，粗面内质网极为发达，在数量上比Ｒ细胞多，几乎充满整个细胞；Ｂ细胞微绒毛较短，以胞饮方式吸收营养，在     

长江上游特有鱼类红唇薄鳅线粒体控制区遗传多样性研究

红唇薄鳅(Leptobotia rubrilabris)是长江上游特有鱼类,近年来资源量不断下降。本研究利用线粒体控制区序列片段(896 bp)分析了长江上游红唇薄鳅的遗传多样性及遗传结构,为其资源保护提供科学依据。共采集了119尾样本,来自长江上游江津、四川南溪、岷江下游蕨溪等。结果显示,共检测到58个单倍型,平均单倍型多样性为0.967,平均核苷酸多样性0.006 7,表明红唇薄鳅种群具有较高的遗传多样性。单倍型NETWORK网络关系图和分析系统树结果显示红唇薄鳅单倍型不按地理分布聚类,但是明显分成了2个谱系,表明红唇薄鳅群体发生了同域遗传分化。AMOVA分析结果显示,采样点和采样时间的群体间没有发生遗传分化。中性检验、错配分析及BSP(Bayesian skyline plot)分析表明红唇薄鳅Lineage 1种群在距今0.007 5~0.055 Ma(百万年)期间发生过种群选择或扩张事件。